CC BY
70
_Ветеринария 'У
ХАРАКТЕРИСТИКА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА, ЦИРКУЛИРУЮЩЕГО В ПОПУЛЯЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
В РАЗНЫХ РЕГИОНАХ РФ
и. м. донник,
доктор биологических наук, профессор, академик Россельхозакадемии, 620075, г. Екатеринбург, ул. к. Либ-ректор, Уральская государственная сельскохозяйственная академия кнехта, д. 42; тел.: 8 (343) 371-33-63
Положительная рецензия представлена И. А. Шкуратовой, доктором ветеринарных наук, профессором Уральской государственной сельскохозяйственной академии
Одним из самых распространенных хронических инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, наносящих значительный экономический ущерб животноводству, является лейкоз крупного рогатого скота (ВЛ КРС). Проблема лейкоза имеет общебиологическое и медицинское значение ввиду близкого морфологического и эволюционного родства вируса лейкоза крупного рогатого скота с вирусами Т-клеточного лейкоза человека и до настоящего времени не потеряла своей актуальности. Наоборот, лейкоз вышел на первое место в ряду хронических инфекций крупного рогатого скота. Болезнь поражает в первую очередь высокопродуктивных коров, что, в свою очередь, является угрозой национальному генофонду крупного рогатого скота страны.
На сегодняшний день единственными наиболее эффективными методами борьбы с лейкозом крупного рогатого скота являются его ранняя диагностика, изоляция и методичная выбраковка больных животных с последующим формированием свободного от вируса лейкоза стада. Поэтому совершенствование методов его ранней диагностики является актуальной задачей. Одними из основных требований, предъявляемым к диагностическим тестам, являются чувствительность и специфичность.
Установление принадлежности ВЛКРС к определенному генотипу может служить основанием для расширения исследований в данном направлении, в проведении исследований в выявлении патогенетических особенностей развития лейкозного процесса, как в экспериментальном, так и в спонтанном вариантах. Изучение особенностей строения и функционирования генома вируса/провируса позволит в будущем не только понять, но и управлять течением инфекционного процесса.
Генотипическое разнообразие ВЛКРС и результаты сравнительного исследования, в контексте их эпизоотической значимости, открывают новые методические подходы в разработке научно-обоснованных схем оздоровления неблагополучных по лейкозу стад.
В организме хозяина хронически персистирую-щий вирус может претерпевать мутационные изменения, направленные на увеличение патогенности, преодоление более эффективных защитных механизмов хозяина. Поэтому наряду с генетическим статусом макроорганизма, во внимание необходимо принимать генетическую изменчивость самого патогена, который в процессе длительной персистенции способен изменять свою патогенность, как в сторону комменсализма, так и усиления патогенных свойств.
У ретровирусов высокой вариабельностью отличаются поверхностные белки. Наиболее изучен у ВЛКРС полиморфизм гена env-gp51. Gp51 — главный оболочечный гликопротеид, который играет решающую роль в жизненном цикле вириона и является важной детерминантой вирусной инфекционности, содержит эпитопы связывания с клеточными рецепторами, индукции образования синцития, сигналов трансактивации слияния мембраны клеток и поэтому его нуклеотидная последовательность является хорошим геномным маркером в изучении особенностей географического распределения генотипов ВЛ КРС.
На основании метода полиморфизма длин ре-стрикционных фрагментов и ДНК секвенирования вируса лейкоза крупного рогатого скота классифицировано три подгруппы вируса — Бельгийская, Австралийская и Японская.
Проведенные ранее исследования по изменчивости гена env ВЛ КРС показали, что существующие различия между отдельными изолятами в мире не столь велики. Такое низкое генетическое разнообразие может быть связано с относительно невысокой изменчивостью вируса. Однако, исследования, основанные на анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) позволили классифицировать среди штаммов ВЛ КРС до семи различных генотипов, предполагая, что вирус лейкоза более разнообразен, чем ожидалось ранее. Анализ из последовательностей гена env-gp51 ВЛ КРС из разных географических регионов показал наличие различных генетических групп, которые связаны с географическим происхождением изолятов. На основе анализа полученных данных недавно была предложена новая классификация штаммов ВЛ КРС на семь различных генотипов.
Имеются сообщения о возможной роли различных вариантов ВЛКРС в развитии инфекционного процесса. Данные о функциональной значимости полиморфизмов, патогенных свойствах генотипов, их способности избегать иммунного надзора со стороны организма хозяина, остаются не до конца изученными. Животные, инфицированные такими вариантами вируса, остаются серонегативными на протяжении длительного времени и, таким образом, являются источником распространения инфекции.
Молекулярно-генетическое изучение многообразия генотипов ВЛКРС в России ранее проводилось в Новосибирске, Москве и Новочеркасске и Республике Татарстан. Для изучения корреляции клинически бессимптомного постоянства ВЛКРС с известным провирусным генотипом, исследуют штаммы
14
т-Э¥и. пегое!. ги
_Ветеринария
Таблица 1
Географическая структура опытных изолятов для молекулярно-генетических исследований
№ образца Регион РФ, в котором отбирали изоляты ВЛ КРС
Краснодарский край
1., 2., 3., 4., 5. Краснодарский край, Красноармейский район
Тюменская область
3T. Тюменская область, Ишимский район
4T. Тюменская область, Заводоуковский район
5T. Тюменская область, Ялуторовский район
6T., 1s, 2s, 3s, 4s, 5s Тюменская область, Ялуторовский район (СХП Петелино)
Челябинская область
4Z., 5Z. Челябинская область, Каслинский район
1c, 7c, 8c, 9c, 10c Челябинская область, Коелгинский район
Курганская область
2K., 3K., 4K. Курганская область, Кетовский район
Свердловская область
2, 3, 4, 5 Свердловская область, Туринский район
различного происхождения в ПЦР, с последующим ПДРФ (RFLP) — методом (restriction fragment length polymorphism — полиморфизм длин рестрикцион-ных фрагментов), который заключается в обработке ДНК, выделенной из заведомо подлинного образца сырья (стандарта), ферментом рестриктазой. Полученные фрагменты разделяют в агарозном геле путем электрофореза, и затем переносят на нитро-целлюлозную мембрану, а также применяют ДНК секвенирование.
Это необходимо, чтобы в дальнейшем выявить молекулярную основу для определения различий в инфек-ционности, антигенных свойств, патогенеза и туморо-генеза различных генетических вариантов ВЛ КРС.
Исходя из этого были подготовлены к исследованиям методами «Nested» ПЦР, ПДРФ (RFLP), ДНК-секвенирования, пробы лейкоцитов (PBL) от инфицированных (РИД (+)) ВЛ КРС телок и коров из Свердловской, Курганской, Тюменской, Челябинской областей и Краснодарского края, а также экспериментально инфицированных баранов и кроликов.
Все пробы были отобраны от положительно реагировавших по последним исследованиям в РИД коров 3-4-летнего возраста и телят 3,5-4-месячного возраста. Кроме того, в Туринском районе Свердловской области были выделены три изолята от телят, положительно ревгирующих в РИД, ИФА, ПЦР и один образец от 6-летней коровы, положительно реагирующей в РИД.
Всего было получено 32 изолята из разных регионов (табл. 1) для исследований в «Nested» ПЦР, ПДРФ.
При анализе образцов ДНК от экспериментально инфицированных животных также получены разноречивые данные. При расщеплении ампликонов PvuII рестриктазой были получены фрагменты, длиной 280, 164 и 128 bp, что указывает на одновременное присутствие нескольких типов вируса. Названные подопытные животные были инфицированы сборной кровью от нескольких животных Ялуторовского района Тюменской области.
Всего было исследовано 30 образцов ДНК, выделенных от животных из Уральского региона и Краснодарского края и, проведен анализ распределения рестрикционных фрагментов по каждому из ферментов (Bam HI, Pvu II, BclI).
Таким образом, проведенными исследованиями генотипирования по участку гена епу 444Ьр и определен тип вируса, циркулирующий в том или ином регионе РФ.
На основании полученных данных и сравнении с представленными образцами была составлена сводная таблица распределения типов ВЛ КРС в областях РФ (табл. 2).
Исходя из данных, представленных в таблице, видно, что все образцы ДНК из Челябинской области (Каслинский и Коелгинский районы) можно классифицировать к Бельгийской подгруппе ВЛ КРС (типу В), а образцы ДНК из Тюменской области (Ишимский, За-водоуковский, Ялуторовский районы) показали различные результаты, часть изолятов (№ 2s, 4s, 3Т, 4Т, 5Т) — отнесены к Австралийской подгруппе (типу А), а часть проб (№ 3s, № 5s, 6Т) Ялуторовского района были классифицированы в энзимах ВатН1 и Вс11 — к Австралийской подгруппе (тип А), а в РуиИ — к Бельгийской (тип В).
Образцы из Курганской области (Кетовский район) также показали различные результаты: пробы 2К — тип А или В, 3К — тип В, 4К — тип А.
Пробы из Южного региона Краснодарского края (Красноармейский район) характеризовались наличием возбудителя как типа В (№ 1, 2, 4, 5), так и типа А (№ 3). При анализе проб из Туринского района Свердловской области во всех образцах был выявлен тип вируса А.
Таким образом, в опытных образцах преимущественно определены образцы из Бельгийской подгруппы ВЛ КРС (тип В) и Австралийской подгруппы (тип А). Примерно 10 % проб ДНК по распределению рестрикционных фрагментов во всех эндону-клеазах можно было отнести как к подгруппе А, так и к В (тип А/В).
Анализируя данные, можно определить территориальное распространение различных штаммов ВЛ КРС. В Краснодарском крае из пяти исследованных проб ДНК в пределах одного района (Красноармейский), четыре были отнесены к Австралийской подгруппе ВЛ КРС (80 %), а одна к Бельгийской (20 %). В Тюменской области данные разделились: шесть из девяти опытных образцов ДНК были классифицированы в Австралийскую подгруппу ВЛ КРС (66,7 %),
_Ветеринария -И*
Таблица 2
Результаты генотипирования ВЛ КРС из изолятов, полученных в различных регионах РФ
№ образца Регион РФ, в котором отобраны изоляты ВЛ КРС Выявлен тип вируса лейкоза
Краснодарский край
1. Краснодарский край, Красноармейский район Ь
2. Краснодарский край, Красноармейский район Ь
3. Краснодарский край, Красноармейский район а
4. Краснодарский край, Красноармейский район Ь
5. Краснодарский край, Красноармейский район Ь
Тюменская область
3Т. Тюменская область, Ишимский район а
4Т. Тюменская область, Заводоуковский район а
5 Т. Тюменская область, Ялуторовский район а
6Т. Тюменская область, Ялуторовский район (СХП Петелино) Ь
18 Тюменская область, Ялуторовский район (СХП Петелино) а
28 Тюменская область, Ялуторовский район (СХП Петелино) а
38 Тюменская область, Ялуторовский район (СХП Петелино) а/Ь
48 Тюменская область, Ялуторовский район (СХП Петелино) а
58 Тюменская область, Ялуторовский район (СХП Петелино) а/Ь
Челябинская область
4г. Челябинская область, Каслинский район Ь
5г. Челябинская область, Каслинский район Ь
1с Челябинская область, Коелгинский район Ь
7с Челябинская область, Коелгинский район Ь
8с Челябинская область, Коелгинский район Ь
9с Челябинская область, Коелгинский район Ь
10с Челябинская область, Коелгинский район Ь
Курганская область
2К. Курганская область, Кетовский район а/Ь
3К. Курганская область, Кетовский район Ь
4К. Курганская область, Кетовский район а
Свердловская область
2 Свердловская область, Туринский район а
3 Свердловская область, Туринский район а
4 Свердловская область, Туринский район а
5 Свердловская область, Туринский район а
Примечание: а — Австралийская подгруппа ВЛ КРС; Ь — Бельгийская т (Австралийская или Бельгийская подгруппа).
одна в Бельгийскую (11,1 %) и два образца в результате реакции полиморфизма можно было отнести как к Бельгийской так и к Австралийской подгруппе (22,2 %). Важно отметить, что опытные образцы были отобраны из различных районов области (Ишимский, Заводоуковский, Ялуторовский), вирус, выделенный в этих районах был отнесен к Австралийскому типу, однако, параллельное присутствие смешанных типов ВЛ КРС (А, В, А/В) было определено только в пределах одной фермы Ялуторовского района, а именно в хозяйстве «Петелино». При исследовании отчетной документации, предоставленной на районной ветеринарной станции, был выявлен факт завоза импортного поголовья (из Германии) в 2006-2007 гг., а также увеличения процента инфицированности, в том числе выявление РИД (+) животных среди им-
)группа ВЛ КРС, а/Ь — смешанный тип ВЛ КРС
портного поголовья (1 кв. и 2 кв. 2007 г. животные показали отрицательный результат, в 3 кв. из 354 животных выявлено 11 РИД (+) животных, в 4 кв. из 333 животных выявлено 52 РИД (+) головы), при том, что в хозяйстве реализовывалась комплексная программа противолейкозных мероприятий, включающая в себя изолированное содержание инфицированных животных. Это подтверждает полученные результаты и указывает на недостаточность официально рекомендуемых серологических диагностических методов при осуществлении международной и внутренней торговли крупным рогатым скотом.
Аналогичные данные были получены и в Курганской области (Кетовский район), где из трех опытных образцов один был классифицирован к Австралийской (33,3 %), один к Бельгийской подгруппе ВЛ
16
т-Э¥и. пагое!. ги
• •ф
Ветеринария ^
КРС (33,3 %) и один к смешанному типу, который по характеру распределения сайтов рестрикции в агаровом геле можно было отнести как к Бельгийской так и к Австралийской подгруппе (33,3 %). Несколько иная картина наблюдалась в Челябинской и Свердловской областях — все семь опытных образцов ДНК из Челябинской области (Каслинский и Коел-гинские районы) были отнесены к Бельгийской подгруппе (100 %), а четыре пробы из Свердловской области классифицированы к Австралийской подгруппе ВЛ КРС (100 %). В данных областях не проводилось закупок импортного поголовья, что подтверждает полученные нами результаты. Таким образом в хозяйствах исследованных регионов РФ (Уральский регион и Краснодарский край) по результатам реакции анализа полиморфизма было определено территориальное распространение и типовой состав, в пределах подгруппы ВЛ КРС преимущественно характеризовался проявлением типов А, В и смешанных (А, В). Присутствие смешанных типов ВЛ КРС в пределах одной фермы или района (Ялуторовский район Тюменской области, Курганская область, Краснодарский край) могут указывать на единовременное их сосуществование и на возможный завоз одного из типов ВЛ КРС с импортным поголовьем.
Для более полноценных сравнительных исследований штаммов ВЛ КРС между собой и с известными мировыми изолятами, взятыми из Genbank (КСВГ), а также для точной классификации в пределах группы и подгруппы, проведено секвенирование участка вирусной ДНК по гену епу 444 Ьр.
Всего, при помощи ДНК-секвенирования участка гена епу, длиной 444Ьр, было исследовано 18 проб, из них: пять из Краснодарского края (Красноармейский район); четыре из Свердловской области (Туринский район); три из Курганской области (Кетовский район); две из Челябинской области (Каслинский район); четыре из Тюменской области (Ишимский, За-водоуковский, Ялуторовский районы).
В результате исследований были получены нуклеотид-ные последовательности, которые были сравнены между собой и с известными мировыми изолятами ВЛ КРС.
Филогенетический анализ позволил классифицировать опытные штаммы в пределах группы и подгруппы, а также сравнить с известными мировыми
изолятами. При данном анализе были определены различия между группами, и дистанция между известными генотипами вируса. Можно сделать вывод, что в мире дистанция между генотипами небольшая. При сравнении основные мутационные изменения расположены в эпитопах 2 ND и CD8+ (подгруппа цитотоксических лимфоцитов), последний из которых отвечает за подавление иммунного ответа в организме, а именно выработку Т-лимфоцитов, у таких животных в крови циркулирует большое количество провируса, наблюдается лейкоцитоз, иммунологический ответ подавлен.
Такой «агрессивный» тип вируса определен в группе III (B подгруппа) и существование его объясняется эволюционным этапом приспособления вируса в организме хозяина при территориальном перемещении.
Сравнивали 18 образцов, взятых из различных регионов РФ с 62 известными мировыми штаммами, взятыми в GenBank (NCBI), и установили следующее: всего было классифицировано 4 группы ВЛ КРС, генетическая дистанция между которыми была не столь велика; было подтверждено проведенное генотипирование.
В первой группе, вместе с изолятами из Чили, Польши и Украины располагались все образцы из Свердловской области (2, 3, 4, 5), один из Краснодарского края (3.), один из Курганской области (4К), и три образца из Тюменской (Ялуторовский район (5Т.), Ишимский (3Т.), Заводоуковский (4Т.)). В III-й группе вместе с образцами из Польши, Бельгии, Украины, Германии, Чили, располагались четыре изолята из Краснодарского края (1., 2., 4., 5.), два из Челябинской области (4Z, 5Z), один образец из Курганской области (3К) и один из Тюменской области (Ялуторовский район (6Т.)). Один изолят из Курганской области был расположен несколько отдельно от остальных, на границе II-й и III-й группы, по результату ПДРФ он был отнесен к типу А/В.
Таким образом, впервые проведены исследования, позволяющие классифицировать изоляты ВЛ КРС из РФ. Изучение особенностей строения и функционирования генома вируса/провируса, позволит в будущем не только понять, но и управлять течением инфекционного процесса. Исследования в этой области необходимо продолжить.
Литература
1. Донник И. М., Татарчук А. Т. Лысов А. В., Петропавловский М. В., Михеев М. П., Садчикова С. В. Чувствительность и специфичность диагностических тестов (РИД, ИФА, ПЦР) в выявлении вирусоносителей ВЛКРС среди оздоравли-ваемого поголовья крупного рогатого скота : материалы Международной научной конференции. Екатеринбург, 2010.
2. Донник И. М., Татарчук А. Т., Петропавловский М. В. Региональная молекулярно-генетическая структура вируса лейкоза крупного рогатого скота : сборник статей. Международная научно-практическая конференция. Екатеринбург, 2008.
3. Дробот Е. В. Результаты изучения генотипического разнообразия вируса лейкоза крупного рогатого скота и особенности эпизоотологического и гематологического проявления лейкоза : автореферат. Новосибирск, 2007.
4. Зиновьева Н. А., Попов А. Н., Эрнст Л. К., Морзанов Н. С., Бочкарев В. В., Стрекозов Н. И., Брем Г. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве. Дубровицы, ВИЖ, 1998. 47 с.
5. Гулюкин М. И., Донник И. М., Татарчук А. Т., Красноперов В. А., Смирнов П. Н. и др. Методологическая система оздоровительных мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота : научно-практические рекомендации. Екатеринбург : Уральское издательство, 2007. 224 с.
6. Гулюкин М. И., Барабанов И. И., Иванова Л. А., Лопунов С. В., Грек К. П., Козырева Н. Г. Анализ эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота в Приволжском Федеральном Округе : сб. научн. статей по материалам Международной научно-практической конференции 80 лет Самарской НИВС. Самара, 2009. С. 92-96.
7. Ломакина Н. Ф., Гулюкин М. И., Иванова Л. А., Клименко А. И., Коваленко А. В. Филогенетический анализ вирусов лейкоза КРС, циркулирующих в Московской, Калужской и Ростовской областях : материалы международной научно-практической конференции. Екатеринбург, 2010.
8. Петров Н. И., Апалькин В. А., Гулюкин М. И. Лейкоз крупного рогатого скота. Санкт-Петербург, 2005.
9. Смирнов А. М., Гулюкин М. И., Субботин В. В., Колбасов Д. В., Донник И. М. и др. Новые методы исследования по проблемам ветеринарной медицины. Ч. 4. Лабораторные методы исследования инфекционной патологии животных. М. : РАСХН, 2008. 620 с.
