CC BY
37
УДК 615.917'2/'9
ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТАБОЛИЗМА И РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СИНТЕТИЧЕСКОГО КАННАБИНОИДА АБ-РШАСА В МОЧЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
Д.Ю. Апушкин, Т.Л. Малкова
ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России Пермь, Россия
Аннотация. Работа посвящена исследованию особенностей метаболизма синтетических каннабиноидов; в статье приведены данные о продуктах метаболизма синтетического каннабимиметика АВ-РШАСА в организме лабораторных животных - крыс стока линии Wistar, в частности, приведены масс-спектры метаболитов, полученные с помощью методов ГХ-МС и ВЭЖХ-МС. Предложена комплексная методика получения модельного метаболического профиля для веществ группы карбонилиндзолов, ориентированная на задачи обнаружения и качественного определения новых психоактивных веществ в биологических объектах для целей судебно-химического анализа.
Ключевые слова: метаболиты, синтетические каннабиноиды, лабораторные животные, ГХ-МС, ВЭЖХ-МС.
ВВЕДЕНИЕ
Проблема злоупотребления наркотическими средствами и психотропными веществами является одной из ключевых в политике безопасности государства. Существует несколько эффективных методов борьбы с распространением веществ, вызывающих наркотическое или токсическое опьянение и/или изменяющих состояние сознания, однако наиболее эффективным было и остается внесение веществ в Списки контролируемых [1; 2], обеспечивающее неотвратимое наказание за факты приобретения, хранения или производства подобных веществ на территории Российской Федерации.
Для определения факта злоупотребления и установления конкретной структуры примененного психоактивного вещества применяются хро-матографические методы анализа биологических жидкостей, в том числе газовая хроматография с масс-селективным детектированием (ГХ-МС) и высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-селективным детектированием (ВЭЖХ-МС).
Данное исследование обусловлено необходимостью разработки методологии изучения метаболизма психоактивных веществ. Целью его является установление метаболитов психоактивного вещества АВ-РШАСА, которые могут свидетельствовать о факте злоупотребления конкретным соединением. Одним из методов оперативного получения метаболических профилей новых веществ является проведение экспериментов на лабораторных животных с применением метаболических камер. В настоящей статье рассмотрены некоторые методические особенности применения методов ГХ-МС и ВЭЖХ-МС для определения метаболитов синтетического каннабимиметика АВ-РШАСА в моче лабораторных животных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Лабораторные животные
Эксперименты проводились на белых нелинейных крысах-самцах массой 180—240 г в возрасте 4—6 месяцев. До начала эксперимента жи-
—--—
вотные содержались в условиях вивария ФГБОУ ВО ПГФА Минздрава России на стандартной диете для лабораторных животных (ГОСТ Р 50258-92) согласно правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96).
Пробоподготовка и дериватизация для ГХ-МС
Во флакон помещали 2 мл мочи, прибавляли 150 мкл 50% раствора NaOH и перемешивали. Флакон плотно укупоривали и помещали в термоблок на 10 минут при 60 °С. После охлаждения флакон вскрывали, добавляли стандарт гексенала 100 мкл 0,2 мг/мл, прибавляли 6Н раствор HCl до pH 2—3 и экстрагировали смесью н-гексан-этилацетат (7 : 1) порцией 5 мл. Верхний слой отделяли, выпаривали до сухого остатка в токе теплого воздуха (40 °С). К сухому остатку прибавляли 500 мкл безводного ацетона, 40 мкл йодистого метила и 2 мг карбоната калия, герметично закрывали и нагревали при 60 °С в течении 60 минут в термоблоке. Флакон охлаждали. Раствор переносили в чистый флакон и выпаривали в токе азота. Сухой остаток дериватизированного образца растворяли в 100 мкл этилацетата и 1—2 мкл вводили в инжектор хромато-масс-спектрометра [3].
Условия хроматографирования для ГХ-МС Газовый хроматограф Agilent 7890A с масс-спектрометром Agilent 5975C, колонка неполярная HP-5ms 28 м х 0,25 мм. Скорость газа носителя (гелий) 1,2 мл/мин, режим работы split/splitless (деление потока 1 : 10, с задержкой включения 1 мин после ввода пробы). Температура инжектора 250 °С, интерфейса 280 °С, температура колонки программируемая 70(1)-30-250-3-280-10-300. Режим работы детектора: селективный ионный мониторинг в интервале 9—13 минут, напряжение на умножителе устанавливается на 200 В выше величины автоматической настройки.
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Исследования проводились на жидкостном хроматографе «Shimadzu LCMS-8050» с масс-спектрометрическим детектором типа тройной квадруполь с двойным источником ионизации (электроспрей и ХИАД). Разделение осуществляли на хроматографической колонке из нержавеющей стали (150 *3,0 мм, Luna 3uC18(2) 100А) с обра-щенно-фазным сорбентом.
Пробоподготовка для ВЭЖХ-МС
В пробирку с завинчивающейся крышкой вместимостью 10 мл вносили 3 мл анализируемой мочи, добавляли 0,5 мл 5М раствора NaOH и выдерживали 2 минуты при 50 °С. В чистую сухую пробирку объемом 10 мл вносили 3 мл гидролизата мочи. Гидролизат подкисляли до pH 2—3 добавлением 250—350 мкл концентрированной соляной кислоты. В пробирку вносили 3 мл смеси изоок-тан-этилацетат 7 : 1. Помещали пробирку на 10 минут на орбитальный шейкер. Центрифугировали 5 минут при 3000 об/мин. Отделяли органический слой, переносили в стеклянную пробирку для упаривания и упаривали в токе горячего воздуха. К экстракту добавляли 500 мкл ацетонитрила, встряхивали на вибромиксере 2—3 сек и анализировали [4].
Условия хроматографирования для ВЭЖХ-МС
Nebulizing Gas Flow — 3 L/min, Heating Gas Flow — 10 L/min, Interface Temperature — 300 °С, DL Tenperature — 25 °С, Heat Block Temperature — 400 °С, Drying Gas Flow — 10 L/min.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Газовая хроматография (рис. 1—6).
Высоко-эффективная жидкостная хроматография (рис. 7—12). Во время проведения эксперимента нами было установленно, что при энергии соударения = -20 eV масс-спектр метаболитов вещества AB-PINACA получается более четким, чем при -10 eV.
—--—
Л И И
и
и
и
а
£
а
<и н
« « £
и
<и «
8
<и
¡г
£
<с о <с £
рр <с
л
Ё ч о
н
<и
<и
а
и
I
о о
о Рч
—--—
■л К К
Й
■л И
а
£
а
(D Н
СП
S «
W
(D «
Si
<D
£
<с о <с
m
<с
л
U
ч о
MS
н
(D
W
(D
а
0
1
о о
J3
о
(D Н
Л
и
Л
4 л
Ё
(D
IS
5 а
(D
е
m «
и и
(D
О
а
(D О
и н
о «
£
<С О
<с
m
<с
л
ч о
43
н
(D
£
w
(D
а
0
1
о £
О
S №
—--—
■а
К К
И
и
з
и
а
£
а
<и н
« «
3
£
и
<и «
8
<и
¡г
£
<с о <с £
рр <с
л
Ё ч о
н
<и
<и
а
и
I
о о
1Л о
—--—
—--—
—--—
л И
Л
15
(D
S s а
<D
а
m «
и и
(D
F
О
а
(D О
о «
£
<С О
<с g
S
л
U
ч о
н
(D
W
(D
а
0
1
о о Л
о S
еь
—--—
Л И
е
л
Ё
(D
S S а
<D
а
а
m «
и и
(D
F
О
а
(D О
S
О «
£
<с о
<с g
5
л g
4 о
н
(D
5
6
<D
е
0
1
о
о g
о S
еь
Выводы
При сравнении масс-спектров метаболических профилей животных, полученных экспериментальным путём, и человека, взятых из литературных данных, [4] сделаны следующие выводы:
♦ ионные составы метаболитов вещества АВ-РШАСА у лабораторных крыс стока линии Wistar и человека качественно не отличаются;
♦ соотношение наиболее интенсивных ионов в разных метаболических профилях существенно сходно;
♦ время выхода метаболитов зависит от конкретных условий хроматографирования; нами определено время выхода для ГХ-МС: метаболит № 1 — 15,802 мин, метаболит № 2 — 15,536, метаболит № 3 — 15,632, для ВЭЖХ-МС: метаболит № 1-- 12,707, метаболит № 2 — 13,048 минут.
На основе полученных данных можно сделать вывод о том, что метаболиты человека и животного, определенные методами ГХ-МС и ВЭЖХ-МС, для вещества АВ-РШАСА идентичны, что может
служить подтверждением целесообразности дальнейших исследований метаболизма синтетических каннабиноидов у лабораторных животных.
ЛИТЕРАТУРА
1. Федеральный закон от 8 января 1998 г. № З-ФЗ «О наркотических средствах и психотропных веществах».
2. Постановление Правительства РФ от 30 июня 1998 г. № 681 «Об утверждении перечня наркотических средств, психотропных веществ и их прекурсоров, подлежащих контролю в Российской Федерации».
3. Катаев С.С, Зеленина Н.Б., Дворская О.Н. Идентификация метаболитов каннабимиметика AB-PINACA в моче методом ГХ-МС // Бутлеровские сообщения. 2013. № 9 Т. 35. С. 131—138.
4. Информационное письмо «Обнаружение синтетических каннабимиметиков, наркотических, психоактивных веществ и их метаболитов в моче, волосах и ногтях методами жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием». Министерство здравоохранения Российской Федерации, Национальный научный центр наркологии. 2014.
CHARACTERISTICS OF METABOLISM AND DEVELOPMENT OF TECHNIQUES
FOR DETERMINATION SYNTHETIC CANNABINOIDS AB-PINACA IN URINE OF LABORATORY ANIMALS
D.Yu. Apushkin, T.L. Malkova
Perm State Pharmaceutical Academy Perm, Russia
Annotation. The work is devoted to the study of synthetic cannabinoids metabolic characteristics; article shows the metabolic products of the synthetic cannabimimetics AB-PINACA in the body of laboratory animals — line Wistar rats, in particular, shows the mass spectra of the metabolites produced by GC-MS methods and HPLC-MS. A complex procedure for the preparation of the model of the metabolic profile of the carbonilindasol group substances focused on problem of finding and qualitative detection of new psychoactive substances in biological objects for forensic chemical analysis.
Key words: metabolites, synthetic cannabinoids, laboratory animals, GC-MS, HPLC-MS.
REFERENCES
1. Federal Law of January 8, 1998 N 3-FZ "On Narcotic Drugs and Psychotropic Substances" (In Russian).
2. Government Decree dated June 30, 1998 N 681 "On approval of the list of narcotic drugs, psychotropic substances and their precursors subject to control in the Russian Federation" (In Russian).
3. Kataev S.S., Zelenin N.B., Dvorsky O.N. Identification of metabolites cannabimimetics AB-PINACA in urine
by GC-MS. Butlerov Communications, 2013, vol. 35, no. 9, pp. 131—138.
4. Call for Papers "The discovery of synthetic cannabimimetics, drugs, psychoactive substances and their metabolites in the urine, hair and nails by liquid chromatography with mass spectrometry". Russian Ministry of Health, National Science Center on Addiction. 2014.
