CC BY
7УДК 575.222.7:631.527.5
Н.И. Дубовец1, Е.А. Сычева1, Н.И. Дробот1, Е.Б. Бондаревич1, Л.А. Соловей1, С.П. Халецкий2
ХАРАКТЕРИСТИКА ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ПО КОМПЛЕКСУ ПРИЗНАКОВ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ОВСА ПОСЕВНОГО AVENA SATIVA L. МЕТОДОМ ОТДАЛЕННОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27, e-mail: n.i.dubovets@igc.by 2РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по земледелию» Республика Беларусь, 222160, г. Жодино, ул. Тимирязева, 1
Представлены результаты оценки исходных родительских форм (сортов Avena sativa L. и образцов Avena sterilis L.) по ряду признаков, которые предполагается использовать в дальнейшей работе для подтверждения гибридности полученного материала и отбора наиболее перспективных для дальнейшей селекционной проработки генотипов. Приведены данные по особенностям морфологии образцов Avena sterilis L. и их устойчивость к стеблевой и корончатой ржавчине. Изучена цитологическая стабильность и генетический полиморфизм по SSR маркерам сортов Avena sativa L.
Ключевые слова: овес посевной Avena sativa L, Avena sterilis L., межвидовая гибридизация, устойчивость к болезням, цитологическая стабильность, SSR-маркеры
Введение
Овес (Avena sativa L.) - одна из важнейших зерновых культур мира, занимающая по сумме посевных площадей пятое место после пшеницы, риса, кукурузы и ячменя. В Республике Беларусь овес посевной относится к числу значимых культур и выращивается на площади около 150 тысяч гектаров [1]. Avena sativa L. считается ценной продовольственной и зернофуражной культурой. В зерне овса содержится 12-15% белка, 40-45% крахмала, 4-6% липидов. Белок легко усваивается и отличается повышенным содержанием необходимых для организма человека аминокислот (аргинин, гистидин, лизин, триптофан). По сравнению с другими хлебными злаками зерно овса содержит значительно больше липидов, в составе которых преобладают линоленовая и олеиновая кислоты. Значительный ущерб урожаю и качеству продукции этой культуры наносят вредители и болезни. Среди болезней наиболее вредоносными являются корончатая и стеблевая ржавчина, в последние годы широкое распространение получила также красно-бурая пятнистость [2]. Самый эффективный, экономичный и безопасный способ борьбы с болезнями растений - создание устойчивых сортов. При этом наиболее пер-
спективным на настоящий момент представляется использование в качестве доноров целевых признаков дикорастущих сородичей A. sativa L., являющихся обширным источником генов устойчивости к различным абиотическим и биотическим стрессовым факторам, потенциал которых в селекции овса до сих пор не реализован. Особый интерес для селекции на устойчивость к болезням представляют дикорастущие гексаплоидные виды, которые имеют аналогичную Avena sativa L. геномную структуру (AACCDD), что гарантирует получение в скрещиваниях фертильных гибридных форм.
В статье представлены результаты оценки по ряду признаков исходных родительских форм (сортов Avena sativa L. и образцов Avena sterilis L.), которые предполагается использовать в дальнейшей работе для подтверждения гибридности полученного материала и отбора наиболее перспективных для дальнейшей селекционной проработки генотипов.
Материалы и методы
Материалом для исследований служили высокопродуктивные возделываемые в Республике Беларусь сорта овса посевного Айвори, Бинго, Запавет, Лидия, Мирт и Фристайл, а также
13 образцов Avena sterilis L. - источников устойчивости к корончатой и стеблевой ржавчине, полученных из мировой коллекции ВИР (табл. 1).
Исследование особенностей поведения хромосом овса на различных стадиях микроспо-рогенеза проводили на временных давленых препаратах, изготовленных по общепринятой методике [3] и окрашенных 4%-ным орсеи-ном. Метелки срезали на стадии выхода на 1/3 из листового влагалища и фиксировали в этанол-уксусной смеси (3:1). Через сутки материал переносили в 70%-ный этиловый спирт, в котором и хранили до момента анализа при температуре +2-4 °С.
Выделение и очистку ДНК осуществляли с помощью готовых наборов реактивов Genomic DNA Purification Kit К0512 (Fermentas,
Литва). Для изучения генетического полиморфизма использовались SSR-маркеры, перечень которых и нуклеотидные последовательности праймеров к ним представлены в табл. 2.
Общий уровень качества прохождения реакции оценивали разделением продуктов ПЦР электрофорезом в 1,5%-ном агарозном геле в 1*ТАЕ буфере в течение 60 минут при напряжении в 80 В. Для точного определения размера амплифицируемых фрагментов был проведен стандартный фрагментный анализ при помощи прибора Applied Biosystems 3500 Genetic Analyzer (США). Данные анализировались в программной среде, поставляемой с прибором.
Оценка устойчивости A. sterilis L. к болезням проводилась по 9-ти бальной шкале.
Таблица 1
Перечень генотипов Avena sterilis L., включенных в рабочую коллекцию
№ образца по каталогу ВИР Название Страна происхождения Наличие генов устойчивости
1870 CW 486 Тунис Рс-50
1876 C.I. 8081 Португалия Рс-36,47
1877 C.I. 8387 Израиль Рс-58
1888 PI 287211 Израиль Рс-60,61
1970 ME 1951 Турция Рс-54, Pg-15
1977 EN 2145 Алжир Рс-68
1978 F 033 Израиль Рс-55
1981 F 169 Израиль Рс-45
1982 F 290 Израиль Рс-46
655 CAV 1975 Алжир -
517 CAV 1360 Израиль -
539 CAV 1414 Израиль -
428 ME 1083 Иран -
Таблица 2
Нуклеотидные последовательности праймеров для анализа полиморфизма овса
SSR-маркер Прямой праймер Обратный праймер
AM1 GGATCCTCCACGCTGTTGA- FAM CTCATCCGTATGGGCTTTA
AM3 CTGGTCATCCTCGCCGTTCA-ROX CATTTAGCCAGGTTGCCAGGTC
AM4 GGTAAGGTTTCGAAGAGCAAAG-TAMRA GGGCTATATCCATCCCTCAC
AM5 TTGTCAGCGAAATAAGCAGAGA-FAM GAATTCGTGACCAGCAACAG
AM7 GTGAGCGCCGAATACATA-ROX TTGGCTAGCTGCTTGAAACT
AM15 GTGACCGTAAACGATAACAAC-TAMRA AAGCAAGACGCGAGAGTAGG
Статистическую обработку данных выполняли при помощи пакета анализа данных программы Microsoft Excel.
Результаты и обсуждение
Сравнительная оценка морфологических признаков A. sativa и A. sterilis
Несмотря на внешнее сходство надземной части растений, виды A. sativa и A. sterilis имеют ряд отличительных морфологических признаков, которые проявляются главным образом на уровне строения генеративных органов. Как видно из рис. 1, для колосков A. sterilis характерно наличие двух грубых коленчатоизогнутых остей, в то время как у включенных в эксперимент сортов A. sativa ости отсутствуют.
Типичным для образцов A. sterilis является также сильное опушение основания первого и второго зерна (рис. 1а), отсутствующее у зерновок овса посевного (рис. 1б). Наблюдаются существенные различия и по окраске зерновки: среди сортов отмечены генотипы с белой и желтой окраской зерновки с преобладанием последней, а среди образцов A. steri-lis преобладающей является серая окраска, за исключением образца CI 8081 с коричневой окраской зерновки и образца ME 1083 с желтой окраской.
Но самыми существенными и значимыми для селекции являются различия по характеру основания цветковой чешуи зерна. У
образцов A. sterilis нижняя часть цветковой чешуи утолщена и образует вырост в виде подковки, которая обеспечивает осыпание зерна. При этом подковка присутствует только у нижнего (первого) зерна, вследствие чего колоски при созревании опадают цельными, не разделяясь на зерна. Поскольку цветение всех видов овса идёт от верхушки метёлки до основания и процесс налива и созревания зерна растянут примерно на месяц, то у A. sterilis складывается следующая ситуация: когда в нижней части метелки идет налив зерна и колоски стабильно удерживаются на мутовках, верхние колоски созревают и, благодаря наличию подковки, осыпаются. Данное свойство в селекционной работе является отрицательным, поскольку для обеспечения механизированной уборки производственных посевов с потерями зерна, не превышающими нормативные, растения создаваемых сортов должны обеспечивать дружное созревание зерна и сохранение его в метелке без осыпания минимум в течение 5-7 дней. У A. sativa цветковые чешуи зерен выроста не имеют, подковка не образуется, вследствие чего он устойчив к осыпанию.
Долгое время считалось, что при гибридизации культурного овса с A. sterilis будет доминировать «дикий» тип отчленения колосков, что ограничивало использование в селекции этого ценного донора устойчивости
Рис. 1. Колоски A. sativa (слева) и A. sterilis
к болезням. На настоящий момент установлен доминантный характер наследования более «культурного» типа отделения колосков, включая различные промежуточные типы [2], что позволяет выделять из гибридного материала устойчивые к осыпанию зерна генотипы.
Анализ цитологической стабильности сортов овса посевного Avena sativa L.
Оценка цитологической стабильности является важной составляющей работ по созданию отдаленных гибридов. Это вызвано тем, что, с одной стороны, интрогрессия в геном культурного вида чужеродного генетического материала приводит к различным аномалиям процесса формирования гамет, что чревато потерей интродуцированного хроматина. С другой стороны, повышенная мейотическая нестабильность гибридов Fj по сравнению с исходной культурной формой нередко используется в качестве критерия гиб-ридности полученного в скрещиваниях материала. В связи с этим у сортов овса посевного, включенных в исследование в качестве материнских компонентов гибридизации, были изучены особенности поведения хромосом на различных стадиях микроспорогнеза.
Как видно из данных табл. 3, наиболее высокой цитологической стабильностью на стадии метафазы I мейоза характеризовались сорта Запавет и Фристайл, у которых уровень бивалентной конъюгации составил 100% (рис. 2.1).
У остальных сортов овса посевного среднее количество материнских клеток пыльцы (МКП) с нарушениями было незначительным и колебалось от 0,14% у сорта Бинго до 0,81% у сорта Айвори. У всех проанализированных сортов наблюдалось явное преобладание закрытых бивалентов над открытыми, что свидетельствует о высокой интенсивности процесса синапсиса гомологичных хромосом. В то же время у всех сортов, кроме Айвори, было отмечено определенное количество МКП с бивалентами, не входящими в состав метафазной пластинки (рис. 2.2, 2.3), что согласуется с литературными данными [4, 5] и, по-видимому, является характерной особенностью мейотического цикла у представителей рода Avena L.
Если исходить из положения, что образующиеся в метафазе I униваленты являются основной причиной аномалий на последующих стадиях мейоза, то на стадии анафазы I у сортов овса следует ожидать незначительного количества нарушений. Проведенный анализ этой стадии в целом подтвердил ожидания - количество МКП с нарушениями колебалось от 15 до 38,3%. Исключение составил сорт Фристайл, у которого количество МКП без нарушений при переходе к стадии AI снизилось от 100 до 25% (табл. 4). При этом основной тип аномалий заключался в отставании от основных анафазных групп деления двух (41,6% МКП; рис. 2.4), реже - одной (25% МКП) хромосом.
Сорт Биваленты Униваленты
Закрытые Открытые Всего %
Айвори 20,13±0,19 0,70±0,16 20,83±0,10 99,19 0,33±0,19
Бинго 20,03±0,19 0,93±0,19 20,97±0,03 99,86 0,06±0,06
Запавет 20,07±0,19 0,93±0,19 21,00±0,00 100,00 0
Лидия 20,50±0,15 0,43±0,14 20,93±0,05 99,67 0,14±0,09
Мирт 20,13±0,15 0,77±0,15 20,09±0,06 99,50 0,20±0,11
Фристайл 20,37±0,15 0,63±0,15 21,00±0,00 100,00 0
Таблица 3
Средние частоты различных хромосомных ассоциаций на МКП в метафазе I мейоза сортов
овса посевного
Рис. 2. Материнские клетки пыльцы сортов овса посевного Avena sativa L: 1 - МКП в метафазе I мейоза без нарушений; 2, 3 - МКП в метафазе I мейоза с не включенными в метафазную пластинку бивалентами; 4 - МКП с двумя отставшими хромосомами; 5 - МКП с мостами; 6 - асинхронное деление в метафазе II мейоза; 7 - МКП в анафазе II мейоза без нарушений; 8 - МКП в анафазе II мейоза с отставшими хромосомами; 9, 10 - тетрады
с одним и тремя микроядрами; 11 - триада; 12 - пентада.
Таблица 4
Характеристика стадии анафаза I мейоза у сортов овса посевного
Сорт Количество МКП без нарушений, % Количество МКП с нарушениями
С числом отставших хромосом, % С мостами, %
1 2
Айвори 61,67 - 1,66 36,70
Бинго 78,57 - - 21,43
Запавет 85,00 - 5,00 10,00
Лидия 75,71 - 1,43 22,86
Мирт 77,14 7,14 - 15,72
Фристайл 25,00 25,00 41,67 8,33
Следует отметить, что для сорта Фристайл характерны также существенные различия по уровню цитологической стабильности между индивидуальными растениями. Что касается других исследованных сортов, то количество МКП с отставшими хромосомами у них было незначительным (от 1,43 до 7,14%, а у сорта Бинго такой тип нарушения мейоза не был выявлен вообще), в то время как основной аномалией анафазного расхождения было формирование мостов (рис. 2.5). Наибольшее количество МКП с мостами (36,7%) было отмечено у сорта Айвори, наименьшее (8,33%) - у сорта Фристайл. Появление этого типа аномалий обычно связывают с запоздалой терминали-зацией хиазм [6].
На стадии метафаза II размах изменчивости по количеству МКП без нарушений существенно снизился (табл. 5), а количество МКП с нарушениями не превышало 26%.
Худший показатель был отмечен у сорта Фристайл, однако он был на 48% меньше, чем на предыдущей стадии, что говорит о существенной нормализации процесса мейоза с переходом ко второму делению. Основными нарушениями являлись наличие 1-3 унива-лентных хромосом, при этом максимальное их число (3) отмечено только у сорта Фристайл (1,25% МКП), а также асинхронность деления (рис. 2.6).
На следующей стадии мейоза - в анафазе II количество МКП без нарушений у большинства сортов осталось на прежнем уровне с небольшими колебаниями (2-4%) как в сторону уменьшения, так и увеличения показателя. Исключение составляют сорта Бинго и Мирт. У первого произошло существенное (на 12, 75%) улучшение показателя, в то время как у второго количество МКП без нарушений снизилось на 12,12% (табл. 6). Количество МКП с отставшими хромосомами было не-
Таблица 5
Характеристика стадии метафаза II мейоза у сортов овса посевного
Количество МКП без нарушений, % Количество МКП с нарушениями
Сорт С числом унивалентов, % С асинхронным делением, %
1 2 3
Айвори 84,29 5,71 4,29 - 5,71
Бинго 81,25 13,75 3,75 - 1,25
Запавет 84,28 2,86 2,86 - 10,00
Лидия 78,00 6,00 - - 16,0
Мирт 86,67 6,67 3,33 - 3,33
Фристайл 73,75 8,75 12,50 1,25 3,75
значительным, за исключением сорта Мирт, у которого выявлено 5,45% МКП с одной отставшей хромосомой и 10,91% - с двумя (рис. 2.8). У двух сортов (Айвори и Лидия) наблюдались МКП с мостами. Основной аномалией на этой стадии являлось асинхронное деление, которое было отмечено у всех исследованных сортов, при этом количество МКП с этим видом нарушений варьировало от 2,0 до 13,75%.
Стадия тетрад является заключительной, и количество МКП без аномалий на этой стадии (мейотический индекс) является важным показателем нормального течения всего мейоза. Как видно из данных табл. 7, все исследованные сорта, за исключением сорта Фристайл, характеризуются высоким значением мейоти-ческого индекса. У сортов Бинго и Лидия тетрад с аномалиями не выявлено. У сорта Мирт 1,25% тетрад содержали по два микроядра, у сорта Запавет с одинаковой частотой (1,25%) встречались тетрады с 1, 2 и 3-мя микроядрами (рис. 2.9, 2.10).
Наибольшее количество тетрад с микроядрами (24,17% с одним микроядром и 16,67% - с двумя) было выявлено у сорта Фристайл. Среди других свойственных данной стадии мейоза аномалий в незначительном количестве были выявлены триады (1% - у сорта Айвори) и пентады (1,25% - у сорта Запавет) (рис. 2.11, 2.12)
В целом, следует отметить высокую цитологическую стабильность подавляющего большинства исследованных сортов овса посевного. Сравнение в дальнейшем полученных данных с аналогичными данными для гибридных форм овса позволит выделить наиболее перспективные для включения в селекционный процесс генотипы.
Анализ генетического полиморфизма сортов A. sativa
Генетический полиморфизм сортов овса посевного, включенных в исследование, был изучен с использованием микросателлитных (SSR) маркеров. Данные об аллельном составе изученных локусов представлены в табл. 8.
Таблица 6
Характеристика стадии анафаза II мейоза у сортов овса посевного
Сорт Количество МКП без нарушений, % Количество МКП с нарушениями
С числом отставших хромосом, % С мостами, % С асинхронным делением, %
1 2
Aйвори 80,00 3,33 - 10,00 б,б7
Бинго 94,00 4,00 - - 2,00
Запавет 82,50 2,50 1,25 - 13,75
Лидия 80,00 - - 11,б7 8,33
Mирт 74,55 5,45 10,91 - 9,09
Фристайл 75,00 1,б7 1,б7 - 13,75
Таблица 7
Характеристика стадии тетрад в мейозе сортов овса посевного
Сорт Mейотический индекс, % Количество тетрад с микроядрами, % Триады, % Пентады,%
1 2 3
Aйвори 99,00 - - - 1,00 -
Бинго 100,00 - - - - -
Запавет 95,10 1,25 1,25 1,25 - 1,25
Лидия 100,00 - - - - -
Mирт 98,75 - 1,25 - - -
Фристайл 55,00 24,17 1б,б7 - - -
Таблица 8
Результаты фрагментного анализа продуктов ПЦР с праймерами к микросателлитным
локусам овса посевного
Сорт, АМ1, АМ3, АМ4, АМ5, АМ7, АМ15,
образец п.о. п.о. п.о. п.о. п.о. п.о.
Мирт 156 300 133, 139 134 153 225, 228
Запавет 156 260 135 134 153, 155 225
Фристайл 156 288 133 131 155 225
Лидия 156 288 133 131 155 225
Айвори 151 284 138 131 155 227
Бинго 153 - 133 131 155 223
В ходе исследования выявлено, что количество аллелей на исследованный локус колеблется от 2 до 4. Сорта белорусской селекции Фристайл и Лидия мономорфны по всем шести исследованным локусам. Сорта Мирт и Запавет имеют аналогичный им аллельный состав по локусу АМ1, но отличаются по составу других локусов. Сорт немецкой селекции Айвори отличается от сортов белорусской селекции по аллельному составу локусов АМ1, АМ3, АМ4, М15, а сорт польской селекции Бинго - по составу локусов АМ1 и АМ15. Большинство сортов характеризуются одновариантным составом микросателлитных локусов. Для сорта Мирт выявлены по 2 варианта микросателлитных локусов АМ4 и АМ15. Сорт Запавет несет 2 варианта локуса АМ7.
Оценка устойчивости к болезням образцов A. sterilis L.
Проведена оценка включенных в исследование форм A. sterilis Ь. по устойчивости к корончатой и стеблевой ржавчине в условиях естественного инфекционного фона. Погодные условия 2016 года в целом были депрессивными для проявления корончатой ржавчины овса. Первые признаки болезни появились к моменту уборки образцов на вторичных побегах кущения. Устойчивость к корончатой ржавчине показали образцы EN 2145, С.1. 8387, Р1 287211, F 169, F 290, С.1. 8081, CW 486 (табл. 9). Стандартный сорт овса Запавет проявил умеренную восприимчивость. Статистическая обработка полученных данных выявила существенные различия по степени устойчивости изученных образцов и сорта стандарта. Заражение стеблевой ржавчиной в посевах A. sterilis Ь. в 2016 году не наблюдалось.
Таблица 9
Устойчивость образцов A. sterilis Ь. к корончатой ржавчине
№ Каталог ВИР Название Степень устойчивости к корончатой ржавчине, балл
1 1870 CW 486 7
2 1876 С.1. 8081 7
3 1877 С.1. 8387 7
4 1888 Р1287211 7
5 1970 МЕ 1951 5
6 1977 EN 2145 7
7 1978 Б 033 5
8 1981 Б 169 7
9 1982 Б 290 7
10 655 CAV 1975 5
Окончание табл. 9
№ Каталог ВИР Название Степень устойчивости к корончатой ржавчине, балл
11 517 CAV 1360 5
12 539 CAV 1414 3
13 428 ME 1083 5
14 Запавет (стандарт) 3
НСР05 1,9
Заключение
Выявлены особенности морфологии включенных в гибридизацию образцов Avena steri-lis L. по сравнению с сортами Avena sativa L. Показана высокая цитологическая стабильность (мейотический индекс 95,10-100%) подавляющего большинства проанализированных сортов овса посевного. Сорт белорусской селекции Фристайл отличался низким уровнем общей цитологической стабильности (мейо-тический индекс - 55,00%) и существенными различиями по уровню цитологической стабильности между индивидуальными растениями на отдельных стадиях мейоза. С использованием SSR-маркеров изучен генетический полиморфизм сортов Avena sativa L. на молекулярном уровне. Проведен анализ устойчивости к стеблевой и корончатой ржавчине образцов A. sterilis различного географического происхождения в условиях Беларуси. Установлено, что образцы EN 2145, C.I. 8387, PI 287211, F 169, F 290, C.I. 8081, CW 486 характеризуются высокой устойчивостью к болезням и достоверно превосходят по этому показателю сорт-стандарт Запавет. Полученные данные будут использованы в дальнейшей работе для отбора наиболее перспективных
для селекционной проработки гибридных генотипов.
Список использованных источников
1. Скоро сеять овес [Электронный ресурс] / С.П. Халецкий [и др.]. - Режим доступа: izis.by/wp-content/uploads/articles/skoro-seyat-oves.doc.
2. Лоскутов, И.Г. Дикорастущие виды овса - источник ценных для селекции генов / И.Г. Лоскутов. - СПб: ВИР, 2005. - C. 823-830.
3. Паушева, З.П. Практикум по цитологии растений / З.П. Паушева. - М.: Колос, 1970. -254 с.
4. Baptista-Giacomelli, F.R. Elimination of micronuclei from microspores in a Brazilian oat (Avena sativa L.) variety / F.R. Baptista-Giaco-melli, M.S. Pagliarini, J.L. de Almeida // Genet. Mol. Biol. - 2000. - Vol. 23, № 3. - P. 681-684.
5. Suaki, R.M. Microsporogenesis in Brazilian varieties of Avena sativa and Avena strigosa under agronomic forage selection / R.M. Suaki [et al.] // Cytologia. - 2003. - Vol. 68, № 3. -P. 295-302.
6. Цитология и генетика мейоза /отв. ред. ВВ. Хвостова, Ю.Ф. Богданов. - М.: Наука, 1975. - 432 с.
N.I. Dubovets1, Y.A. Sycheva1, N.I. Drobot1, Y.B. Bondarevich1, L.A. Solovey1, S.P. Khaletsky2
CHARACTERISTIC OF THE INITIAL MATERIAL BY A COMPLEX OF TRAITS FOR USE IN OAT (AVENA SATIVA L.) BREEDING BY THE METHOD OF DISTANT HYBRIDIZATION
institute of Genetics and Cytology, NAS of Belarus Minsk BY-220072, the Republic of Belarus 2Research and Practical Center of National Academy of Sciences of the Republic of Belarus
for Arable Farming Zhodino, BY-222160, the Republic of Belarus
Results of the initial parental forms' assessment (varieties Avena sativa L. and Avena sterilis L. specimens) by a number of traits that are supposed to be used in future work to verify the hybrid nature of the developed material and to select the most promising in further breeding genotypes are presented. Data on the morphological traits of Avena sterilis L. specimens and their resistance to stem and crown rust given. The cytological stability and genetic polymorphism by SSR-markers of Avena sativa L. varieties studied.
Key words: Avena sativa L., Avena sterilis L., cross-species hybridization, diseases resistance, cytological stability, SSR markers.
Дата поступления статьи: 14 сентября 2017 г.
