CC BY
30
УДК 579.26; 579.8:616-036.22
ХАРАКТЕРИСТИКА ИНТЕГРАТИВНЫХ КОНЪЮГАТИВНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ШТАММОВ НЕХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ ВОЛГОГРАДСКОЙ ОБЛАСТИ
А. А. Замарин1, И. Б. Захарова1,2, М. В. Подшивалова1, Ю. А. Кузютина12, Н. Н. Тетерятникова1, Я. А. Лопастейская12, Д. В. Викторов12, А. В. Топорков12
1ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, 2 Волгоградский государственный медицинский университет, кафедра молекулярной биологии и генетики
В геномах штаммов Vibrio spp., выделенных из воды открытых водоемов Волгоградской области, идентифицированы интегративные конъюгативные элементы семейства SXT/R391. Показана рекомбинантная природа ICE четырех штаммов Vibrio spp.
Ключевые слова: Vibrio spp., интегративные конъюгативные элементы, ICE, SXT/R391, вариабельная ДНК.
CHARACTERISTICS OF INTEGRATIVE CONJUGATIVE ELEMENTS OF NON-CHOLERAE VIBRIO STRAINS IN THE VOLGOGRAD REGION
А. А. Zamarin1, I. B. Zakharova12, M. V. Podshivalova1, Yu. A. Kuzyutina12, N. N.Teteryatnikova1, Ya. A. Lopasteyskaya12, D. V. Viktorov12, А. V. Toporkov12
1FSHI «Volgograd Plague Control Research Institute» of the Federal Service on Customer Rights Protection and
Human Wellbeing Surveillance. 2 Volgograd State Medical University, Department of Molecular Biology and Genetics
Integrative conjugative elements (ICEs) belonging to the SXT/R391 family were identified in Vibrio spp. strains isolated from open water in the Volgograd region. Four Vibrio spp. strains were found to contain recombinant ICEs. Key words: Vibrio spp., integrative conjugative elements, ICEs, SXT / R391, variable DNA.
Механизмы, обеспечивающие устойчивость бактерий к антимикробным агентам, основаны на способности бактерий быстро изменять свои геномы. Эта пластичность является следствием не только спонтанных мутаций и перестроек, которые могут возникать во время бактериального жизненного цикла, но и экзогенного приобретения генов. Интенсивное изучение данной проблемы показало, что одним из ведущих механизмов формирования множественной устойчивости к антибактериальным соединениям у многих представителей гам-ма-протеобактерий, в том числе и Vibrio cholerae, является приобретение и аккумуляция индивидуальных генов антибиотикорезистентности в интегронах, трансмис-сибельных плазмидах и интегративных конъюгативных элементах (ICE) [6—8].
Одним из наиболее представительных филогенетических семейств ICE по числу входящих в них генетических элементов является функциональное семейство SXT/R391 [1], получившее свое название по первым идентифицированным представителям. Сравнение полных нуклеотидных последовательностей SXTM010 (99.5 т.п.н.) и R391 (89 т.п.н.) показало высокую консервативность групп генов, кодирующих их регуляцию, интеграцию/вырезание и функции конъюгативного переноса. К настоящему времени во всем мире выявлено более 35 SXT-подобных элементов в изолятах V. cholerae различных серогрупп и, по меньшей мере,
в 9 других видах рода Vibrio [5]. ICE семейства SXT/ R391 широко распространены в штаммах рода Vibrio, выделенных как от больных, так и из воды открытых водоемов, и обычно ассоциированы с мультирезистен-тностью к таким антибиотикам, как сульфаметоксазол, триметоприм, аминогликозиды и хлорамфеникол.
Помимо основных, консервативных для ICEs семейства SXT/R391 генов, обеспечивающих процессы интеграции, вырезания и конъюгативного переноса, данные элементы могут содержать дополнительную ДНК, интегрированную в межгенное пространство и отличающуюся у разных ICEs. Вариабельная ДНК расположена в 5 горячих точках (HSs) и четырех вариабельных регионах (VRs). Функции большинства генов, локализованных в вариабельной ДНК, на сегодняшний день неизвестны. Идентифицированные гены кодируют адаптивные системы, такие как комплекс ферментов образования биопленок, ферменты рестрикции-модификации, различные комбинации генов резистентности к антибактериальным препаратам и тяжелым металлам.
Известно, что многие виды рода Vibrio могут служить источником для холерных вибрионов новых, ранее не встречавшихся у них комбинаций генов устойчивости к антимикробным соединениям [8]. Ранее нами было показано наличие различных типов SXT в составе геномов штаммов V.cholerae различных серогрупп,
I^rnpfc ©©СаГГГМЩ
выделенных на территории Волгоградской области [2]. В связи с чем было логично оценить распространенность данных генетических элементов среди автохтонной вибриофлоры региональных открытых водоемов.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить распространенность и структурные особенности интегративных конъюгативных элементов в штаммах Vibrio spp., выделенных на территории Волгоградской области.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе было исследовано 38 штаммов Vibrio spp., выделенных из воды открытых водоемов на территории Волгоградской области в последние годы. Выделение ДНК проводили методом протеиназного лизиса [3]. ПЦР проводили с использованием праймеров, представленных в табл.
В состав реакционной смеси входили праймеры в конечной концентрации 15 пМ, 1 ед. DiaTaq ДНК-по-лимеразы и 1хПЦР-буфер с дНТФ и MgCl2 (ИнтерЛаб-Сервис, Россия). Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1,5%-м агарозном геле и визуализировали окрашиванием бромистым этидием.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Поиск ICE в геномах исследуемых штаммов проводили методом ПЦР с праймерами, специфичными консервативному гену интегразы intSXT. Искомый ген был обнаружен в 36 из 38 проанализированных штаммов. Для дальнейшего анализа было выбрано 18 штаммов, различающихся по месту и времени выделения.
Мы провели анализ 5 локусов вариабельной ДНК, два из которых:HS1 и VR I — могут нести вставки генов с неизвестными функциями, и три: VR III (rumAB), HS5 и HS3—транспозоноподобную структуру с кластером генов резистентности к триметоприму (dfr18), хлорам-фениколу (floR), стрептомицину (strAB) и сульфометак-
сазолу (sulII); ген резистентности к канамицину (kan) и триметоприму ^А1), соответственно.
Амплификация области вставки горячих точек HS1 между ORF s043 и traL и HS5 между ORF s026 и s027 не выявила фрагментов, характерных для SXTМО10 и R391. Однако в HS1 только у 4 штаммов обнаружено полное отсутствие вставки, в других случаях присутствуют комбинации ампликонов размером 200, 300 и 400 п.н., что свидетельствует о наличии вставок, отличающихся от описанных orf37-orf38 (1096 п.н.) у R391 и s043- s044(998 п.н.) у SXT МО10 (рис. 1А).
В случае HS5 у всех исследованных изолятов присутствовал ампликон 190 п.н., соответствующий расстоянию между праймерами, а также дополнительные ампликоны размером 250, 300 и 490 п.н. (рис. 1Б), то есть последовательность гена резистентности к ка-намицину (kan) размером 653 п.н., также как и последовательность 4410 п.н. с неизвестной функцией SXT МО10 не обнаружены.
Исследование вариабельного региона VR1 между ORF attL и xis с парой праймеров VisLF/VisLR3 выявил у штаммов 305-2, 305-5 и 305-7 фрагмент размером 453 п.н., характерный для SXTMO10. У штамма 285-1 имелся ампликон около 150 п.н. У остальных исследованных изолятов фрагментов, интегрированных в межгенное пространство VR1, не обнаружено (рис. 1 В).
Наличие генов резистентности в составе исследуемых ICEs анализировали в формате мультилокус-ной ПЦР с праймерами, специфичными к генам устойчивости к стрептомицину strB, сульфаметоксазолу sulII и двум генам дигидрофолатредуктаз dfr18 и dfrA1. Для SXTMO10 и подобных ему ICEs характерно наличие инсерции кластера генов резистентности в локусе rumB, тогда как у R391 и ему подобных данный ген является интактным. Анализ оперона rumAB показал отсутствие кластера генов антибиотикорезистентности (strB, sul2, dfr18) в ICEs всех исследованных штаммов. В ICE штамма Vibrio sp 287-9 обнаружена вставка в HS3, содержащая ген резистентности к триметоприму dfrA1
Праймер Последовательность 5' - 3' Мишень (ссылка)
SXT-F TTATCGTTTCGATGGC ген интегразы int SXT элемента (accession AF099172)
SXT-B GCTCTTCTTGTCCGTTC
HS1F GGCTATTCCACCGGTGGTG область горячей точки HS1 s043-traL [4]
HS1R TGCCGATCACTAGCCCCAAC
s026-F AAGCAATGGAACCGAATCGTT s026-s027/kan (accession AY055428, AY055428)
s027-R ACCATGCATCAGCGGTTAAAG
VisLF GAGTACAAATTCC GTTTTAG вариабельный регион VR1 attL-xis [4]
VisLR3 GCATTCTCCTGAAAATCAATG
sulII-F GTGCGGATGAAGTCAGCTCC ген устойчивости к сульфаметоксазолу sulII (accession AY034138)
sulII-R GGGGGCAGATGTGATCGAC
strB-F CGCGATAGCTAGATCGCGTT ген устойчивости к стрептомицину strB (accession AY034138)
strB-R GACTACCAGGCGACCGAAAT
dfr18-F CTGCCGTTTTCGATAATGTGG ген дигидрофолатредуктазы dfr18 (accession AY034138)
dfr18-R GGGTAAGACACTCGTCATGGG
dfrA1-F AGTTTACATCTGACAATGAGAACGTAT ген дигидрофолатредуктазы dfrA1 (accession GQ463140)
dfrA1-R ACCCTTTTGCCAGATTTGGTA
Последовательности праймеров для ПЦР-анализа
Выпуск 2 (58). 2016
105
(рис. 2). В качестве сравнения использовали ДНК штамма V.cholerae В-191, несущего SXTM010.
Рис. 1. Амплификация последовательностей интегративных конъюгативных элементов в штаммах Vibrio spp.: А — область вставки HS1; Б — область вставки HS5; В — вариабельный регион VR1. М — ДНК-маркер (100-1000 п.н.), 1. Vibrio sp 255,
2. Vibrio sp 257, 3. Vibrio sp 261, 4. Vibrio sp 270, 5. Vibrio sp 284-7, 6. Vibrio sp 285-1, 7. Vibrio sp 285 -3, 8. Vibrio sp 287-1, 9. Vibrio sp 287-2, 10. Vibrio sp 287-9, 11. Vibrio sp 290-5, 12. Vibrio sp 291-1, 13. Vibrio sp 291-5, 14. Vibrio sp 291-6, 15. Vibrio sp 298-6, 16. Vibrio sp 305-2, 17. Vibrio sp 305-5, 18. Vibrio sp 305-7
Рис. 2. Амплификация в формате мультилокусной ПЦР
генов резистентности ICEs: 1. Vibrio sp 287-2, 2. V. cholerae В-191, 3. ДНК-маркер (100-1000 п.н.)
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, показано широкое распространение интегративных конъюгативных элементов среди автохтонной вибриофлоры региональных открытых водоемов. Полученные данные позволяют отнести обнаруженные ICEs штаммов Vibrio spp, выделенных на территории Волгоградской области, к семейству SXT/R391.
Обнаруженные в данной работе инсерции вариабельной ДНК в составе идентифицированных элементов отличаются от описанных ранее. Так, в штаммах Vibrio sp. 287-9 и Vibrio sp. 305 наряду с геном резистентности к триметоприму dfrAI, характерным для SXTET штаммов V.cholerae O1, и вставкой генов с неизвестными функциями, типичной для SXTM010 штаммов V.cholerae O139 соответственно, в других горячих точках присут-
ствуют неканонические последовательности. Данные факты говорят о мозаичной структуре обнаруженных элементов, сформировавшейся в результате рекомбинаций между различными «исходными» ICEs. Формирование рекомбинантных ICEs может дать новые мобильные элементы, несущие новые комбинации генов, в том числе детерминант устойчивости к антибиотикам, расширяющие адаптивный потенциал бактериальных видов. Подавляющее большинство исследованных элементов не несет в своем составе детерминант резистентности к антибактериальным препаратам, однако, эти «пустые» ICEs обладают потенциалом не только для приобретения детерминант резистентности к антибиотикам, но и других генов, в том числе вирулентности, которые могут быть переданы другим штаммам.
ЛИТЕРАТУРА
1. Захарова И. Б., Викторов Д. В. Интегративные конъюгативные элементы микроорганизмов (ICEs) // Молекулярная генетика, микробиология, вирусология. — 2015. — Т. 33, № 3. — C. 9—16.
2. Подшивалова М. В., Кузютина Ю. А., Захарова И. Б. и др. Характеристика антибиотикорезистентных штаммов Vibrio cholerae, несущих интегративные конъюгативные элементы SXT-типа // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2014. — № 3. — С. 34—39.
3. Тетерятникова Н. Н, Захарова И. Б., Подшивалова М. В. и др. Молекулярная детекция интегронов класса 1 у Burkholderia pseudomallei// Проблемы особо опасных инфекций. — 2011. — Вып. 2 (108). — С. 46—49.
4. Burrus V., Quezada-Calvillo R., Marrero J., et al. SXT-related integrating conjugative element in New World Vibrio choleте // Appl. Environ. Microbiol. — 2006. — Vol. 72 (4). — P. 3054—3057.
5. Burrus V. Significance of the SXT/R391 family of integrating conjugative elements in Vibrio cholerae // Ramamurthy T., Bhattacharya S.K. Epidemiological and molecular aspects on cholera infectious disease. Springer. —
2011. — P. 161—184.
6. MacDonald D., Demarre G., Bouvier M., et al. Structural basis for broad DNA-specificity in integron recombination // Nature. — 2006. — Vol. 440. — P. 1157—1162.
7. Mazel D. Integrons: agents of bacterial evolution // Nat. Rev. Microbiol. — 2006. — Vol. 4. — P. 608—620.
8. Rodriguez-Blanco A., Lemos M., Osorio C. Integrating conjugative elements as vectors of antibiotic, mercury, and quaternary ammonium compound resistance in marine aquaculture environments // Antimicrob. Agents Chemother. —
2012. — Vol. 56 (5). — P. 2619—2626.
Контактная информация
Замарин Антон Александрович — научный сотрудник лаборатории геномики и протеомики ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, e-mail: somyatin@mail.ru
