CC BY
30
УДК 579.8.06:579.25
ХАРАКТЕРИСТИКА ФИМБРИАЛЬНОГО ГЕНА PTFA БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ PASTEURELLA MULTOCIDA, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ОСОБЕЙ
ИСЧЕЗАЮЩЕГО ВИДА САЙГАКОВ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
© К. А. Шораева, В. М. Строчков, С. О. Садикалиева*, М. Б. Орынбаев, Н. Т. Сандыбаев, А. Р. Сансызбай, К. Т. Султанкулова
Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности Республика Казахстан, Жамбылская обл., 080409 пос. Гвардейский.
Тел.: +7 (72636) 722 28.
*Етай: sadikalieva86@mail. ги
Фимбриальный ген р^А играет основную роль в процессе колонизации и адгезии на поверхности бактерии Pasteurella тиНо^а. Белок, кодируемый геном р$А, считается потенциальным кандидатом для создания субъединичных вакцин. Исследованы нуклеотидные последовательности генар$А бактерии Pasteurella тиНосМа, выделенные в 2010-2012 гг. для определения генетических различий между штаммами с использованием международной базы данных GenBank из особей исчезающего вида сайгаков Республики Казахстан. По последовательности гена р^А штаммы Pasteurella/Saigas/2010/ZKO/KZ, Pasteurella/Saigas/2010/ZKO/KZ, Pasteurella/Saigas/2012/ZKO/KZ, выделенные из внутренних органов и крови животных в 20102012 гг. идентичны на 100% штаммам Saigachiy/88 и Saigachiy/88/tel, выделенным в 1988 г. Казахстанские штаммы бактерии Pasteurella тЛосМа отличаются от штаммов из базы GenBank наличием шести нуклеотидных замен: А(155)Т (аденин ^ тимин), Т(170)С (тимин ^ цитозин), G(180)А (гуанин ^ аланин), Т(305)С (тимин ^ цитозин), А(350)Т (аденин ^ тимин) и Т(387)G (тимин ^ гуанин).
Ключевые слова: Pasteurella т^^^а, сайгаки, фимбриальный ген, филогенетический анализ
Введение
Сайгак (Saiga tatarica tatarica) - уникальный вид дикой степной антилопы. Массовая гибель сайгаков в период 2010-2012 гг. в Западно-Казахстанской и Костанайской областях выявила необходимость принятия срочных и конкретных научно-обоснованных мер по сохранению данного вида, находящегося на грани исчезновения. В результате комплексных исследований было установлено, что массовая гибель сайгаков обусловлена течением пасте-реллеза [1, 2].
Pasteurella multocida (P. multocida) является грамотрицательной, неподвижной и неспорообразу-ющей бактерией [3], способной вызывать такие заболевания, как геморрагическая септицемия крупного рогатого скота, птичью холеру, атрофический ринит у свиней и пневмонию у жвачных, свиней и кроликов [4].
Геморрагическая септицемия (ГС) является острой инфекцией крупного рогатого скота (КРС) и буйволов с высокой летальностью, в основном встречающейся на различных регионах Азии и Африки. Геморрагическая септицемия, вызванная P. multocida типа В:2, циркулирует в Азии, в то время как тип E:2 часто регистрируется в Африке. Предполагаемые экономические потери от ГС являются существенными среди КРС в некоторых странах [5]. Заболевание быстро распространяется среди стада, вызывая заболеваемость и смертность 50-100%. Иммунизация против инфекционного агента является единственным доступным инструментом в профилактике и борьбе с болезнью.
Патогенность Pasteurella multocida среди широкого круга домашних и диких животных/птиц опосредована несколькими факторами вирулентности, включая тип IV фимбрий (пили), кодируемый геномptfA (~ 435 п.н.) [4]. ГенptfA является одним из основных поверхностных компонентов бактерии P. multocida, принимающих участие в колонизации и адгезии на поверхности клетки хозяина [6-8]. Ген ptfA состоит из ^концевых высоко консервативных последовательностей с повторяющимися 21-амино-кислотными субъединицами массой 15-20 кДа. Нуклеотидные последовательности гена ptfA разных се-ротипов (А, В, D и F) бактерии P. Multocida указывают на значительные различия штаммов [9-11]
Генетическая характеристика гена ptfA, найденного в разных регионах Азии и Австралии, свидетельствуют о том, что существует две его основные последовательности в геноме бактерии P. multocida. Изучение генетического полиморфизма этого гена может выявить ключевые факторы, ответственные за различные клинические исходы инфекции P. multocida у животных. Кроме того, зарубежные исследователи относят ген ptfA к компонентам вакцинных препаратов против пастереллеза [12, 13]. Требуется дополнительная информация о последовательности гена ptfA бактериальных штаммов, выделенных в других географических регионах.
Целью данной работы является определение молекулярно-генетических характеристик последовательности фимбриального генаptfA казахстанских штаммов, выделенных из сайгаков в 1988 и 20101012 гг.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы. В качестве объекта исследования были выбраны пять штаммов Pasteurella/Saigas/2010/ZKO/KZ, Pasteurella/Saigas/ 2010/ZKO/KZ, Pasteurella/Saigas/2012/ZKO/KZ, выделенные из внутренних органов и крови погибших сайгаков в 2010-2012 гг., и Saigachiy/88 и Saigachiy/88/tel, выделенные в 1988 г. Ареал обитания животных - территории современной Республики Казахстан.
ДНК экстрагировали с использованием набора «PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent» (Applied Biosystems, USA) в соответствии с инструкциями производителя. ПЦР-амплификацию гена ptfA проводили с использованием набора праймеров и условий, описанных как ранее [9]. ПЦР-ампликон анализирован электрофорезом в агарозном геле. Секвенирование проводили методом дидезоксисеквенирования с использованием терминирующих дидезоксинуклеотидов (метод Сенгера) на автоматическом 16-капиллярном се-квенаторе Genetic Analyser 3130 xl, (Applied Biosystems, USA). Последовательность фрагмента ДНК содержала 435 пар оснований. Нуклеотидная последовательность гена ptfA казахстанского штамма Pasteurella/Saigas/2010/ZK0/KZ была депонирована в международную базу GenBank под номером KT238894.1. Детали всех использованных штаммов по последовательности гена ptfA приведены в табл. 1.
Филогенетический анализ последовательностей проведен с помощью программы Mega 6.06 [11] по следующим параметрам: Statistical Method -
Neighbor-joining, Test of Phylogeny - Bootstrap method, Number of Bootstrap Replications - 50, Model/Method - Kimura 2-parameter model, Substitutions to Include - d: Transitions + Transversions, Gaps/Missing Data Treatment - Complete deletion, Codons Included - 1st+2nd+3rd+Non-Coding.
Результаты
В ходе исследовании получены ПЦР-продукты гена ptfA казахстанских штаммов бактерии P. multocida с размером 435 последовательностей нук-леотидов, выделенных из тканей погибших сайгаков в разные временные периоды. Определены нуклео-тидные последовательности полученных ПЦР-про-дуктов по фимбриальному гену ptfA. На рис. 1 представлены результаты сравнительного анализа казахстанских штаммов по нуклеотидным последовательностям гена ptfA.
□ п«А Гд.И-.ц т Tv^.i-I 100% 0 D 10Û4. ДГЦО^
Рис. 1. Сравнительный анализ казахстанских штаммов P. multocida между собой по гену ptfA с помощью он-лайн-программы BLAST.
Сравнительный анализ казахстанских штаммов между собой по нуклеотидным последовательностям гена ptfA показал, что идентичность штаммов Pasteurella/saigas/2010/ZKÛ/KZ, Pasteurella/saigas/2011/ ZKO/KZ, Pasteurella/saigas/2012/ Kostanay/KZ и Saigachiy/88, Saigachiy/88/tel между собой составляет 100% (рис. 1).
Таблица 1
Характеристика штаммов, использованных в данном исследовании_
№ Штаммы/изоляты Хозяин Серо-тип Болезнь Страна Номер в GenBank
1 Pasteurella/Saigas/201O/ZKO/KZ Сайгак B Геморрагическая септицемия Казахстан
2 Pasteurella/Saigas/2011/ZKÜ/KZ Сайгак B Геморрагическая септицемия Казахстан
3 Pasteurella/Saigas/2012/ZKO/KZ Сайгак B Геморрагическая септицемия Казахстан KT238894.1
4 Saigachiy/88 Сайгак B Геморрагическая септицемия Казахстан
5 Saigachiy/88/tel Сайгак B Геморрагическая септицемия Казахстан
6 A8.1 Свинья A Птичья холера Китай KX161900.1
7 D35 Свинья D Атрофический ринит Китай KX161902.1
8 P52 КРС B Септицемия Индия AY644678.1
9 PMb2 КРС B Септицемия Иран KX679397.1
10 IndPm94 Перепела A Птичья холера Индия JX139092
11 HN06 Свинья D Атрофический ринит Китай CP003313
12 IndPm1113 Свинья D Атрофический ринит Индия JX139093
13 Pasteurella multocida type 4 fimbriae gene КРС B Септицемия Малайзия AY788893
14 Pasteurella multocida serogroup D:1 Свинья D Атрофический ринит Индия DQ788723
15 PBA815 Полевой изолят F Неизвестна Вьетнам AF154834
16 Pasteurella multocida 36950 КРС A Инфекция дыхательных путей Германия CP003022
При проведении сравнительного анализа нук-леотидных последовательностей гена ptfA казахстанских штаммов Pasteurella/saigas/2010/ZKO/KZ, Pasteurella/saigas/2011/ZKO/KZ, Pasteurella/saigas/ 2012/Kostanay/KZ, Saigachiy/88 и Saigachiy/88/tel было определено, что казахстанские штаммы идентичны на 100% штаммам базы GenBank с ID-номерами AY788893.1 и AY644678.1. В то же время, идентичность казахстанских штаммов со штаммами P. multocida _IndPm (JX139094.1), P.multocida _3480 (CP001409.1), P.multocida _HN06 (CP003313.1) и P.multocida _Pm70 (AE004439.1) составляла 99%.
Проведен филогенетический анализ с использованием нуклеотидных последовательностей гена ptfA казахстанских штаммов и данных международной базы GenBank (рис. 2).
KX679397.1 Pasteurella multocida strain PMb2 AY788893.1 Pasteurella multocida type 4 fimbriae gene JX139093.1 Pasteurella multocida strain IndPm111 PtfA (ptfA) gene AY644678.1 Pasteurella multocida type 4 fmbrial protein(ptfA) gene KX161902.1 Pasteurella multocida strain D35 JX139092.1 Pasteurella multocida strain IndPm94 PtfA (ptfA) gene Pasteurella/Saigas/2010/ZKÜ/KZ
^_ CP003313.1 Pasteurella multocida subsp. multocida str. HN06
Pasteurella/Saigas/2012/ZKÜ/KZ Pasteurella/Saigas/2011/ZKO/KZ
I— DQ788723.1 Pasteurella multocida seragroup D: 1 type L- DQ788724.1 Pasteurella multocida serograup F:3 type ^ AF154834.1 Pasteurella multocida type 4 fimbriae subunit (ptfA) gene p CP003022.1 Pasteurella multocida 36950 L Saigachiy/88 A Saigachiy/88/tel
Рис. 2. Сравнительный филогенетический анализ гена ptfA P. multocida казахстанских штаммов, выделенных из сайгаков, с данными GenBank.
Видно, что казахстанские штаммы Pasteurella/saigas/2010/ZKO/KZ, Pasteurella/saigas/ 2011/ZKO/KZ и Pasteurella/saigas/2012/Kostanay/KZ близкородственны штаммам бактерии P. multocida серотипа В из базы данных GenBank с номерами P. multocida _AY788893.1, AY644678.1_strain P52 и KX679397.1_strain PMb2, выделенными от КРС больных септицемией, соответственно в Малайзии, Индии и Иране. Штаммы Saigachiy/88 и Saigachiy/88/tel, выделенные из сайгаков в 1988 г. образовали одну группу, где близким к этим штаммам является штамм CP003022_ strain 36950, обнаруженный у КРС в Германии.
Идентичность казахстанских штаммов Pasteurella/Saigas/2010/ZKO/KZ, Pasteurella/Saigas/ 2011/ZKO/KZ, Pasteurella/Saigas/2012/ Kostanai/KZ, Saigachiy/88 и Saigachiy/88/tel по нуклеотидным последовательностям гена ptfA составляет 100% (рис. 3).
Молекулярно-генетический анализ нуклеотид-ных последовательностей гена ptfA казахстанских штаммов и штаммов из базы данных GenBank показал, что первые отличаются от вторых наличием шести нуклеотидных замен: А на Т в позиции 155, Т на С в позиции 170, G на А в позиции 180, Т на С в позиции 305, А на Т в позиции 350 и Т на G в позиции 387. Идентичность казахстанских штаммов Pasteurella/Saigas/2010/ZKO/KZ, Pasteurella/Saigas/ 2011/ZKO/KZ, Pasteurella/Saigas/2012/Kostanay/KZ,
Saigachiy/88 и Saigachiy/88/tel по нуклеотидным последовательностям гена ptfA составляет 100% (рис. 3).
Рис. 3. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена ptfA P. multocida и данных GenBank.
Обсуждение и выводы
Белок, кодируемый геном ptfA, играет основную роль в процессе колонизации и адгезии на поверхности бактерии [12, 13]. Фимбрия - это особая конструкция патогенной бактерии, которая может участвовать в инвазии, расселении и пролиферации патогенных микроорганизмов [14]. Этот ген был изолирован от серотипов А, В и D бактерии P. multocida и охарактеризован как фактор вирулентности [9, 13]. Фимбриальный белок P. multocida, кодируемый геном ptfA, считается потенциальным антигеном для создания субъединичных вакцин против пастереллезной инфекции.
В данном исследовании генетически охарактеризованы последовательности фимбриального гена ptfA казахстанских штаммов бактерии P.multocida, выделенных из тканей погибших сайгаков в 20102012 гг. Также в качестве сравнения были изучены последовательности гена ptfA коллекционных штаммов НИИПББ Saigachiy/88 и Saigachiy/88/tel, выделенных в 1988 г.
По результатам полученных данных, казахстанские штаммы показали 100% идентичность между собой по последовательности гена ptfA . Близкородственными к казахстанским штаммам оказались штаммы AY788893.1_ strain P. multocida, AY644678.1_strain P52, KX679397.1_ strain PMb2, CP003022_ strain 36950, которые выделены, соответственно в Малайзии, Индии, Иране и Германии от КРС больных септицемией. Все эти штаммы относятся к бактерии P. multocida и серотипу В.
При проведении сравнительного анализа нук-леотидных последовательностей гена ptfA было обнаружено, что казахстанские штаммы бактерии P. multocida, выделенные от сайгаков отличаются от штаммов из международной базы GenBank наличием шести нуклеотидных замен А(155)Т (аденин ^ ти-мин), Т(170)С (тимин ^ цитозин), G(180)A (гуанин ^ аланин), Т(305)С (тимин ^ цитозин), А(350)Т (аденин ^ тимин) и T(387)G (тимин ^ гуанин).
Таким образом, по нуклеотидной последовательности фимбриального гена ptfA штаммы Pasteurella/Saigas/2010/ZKO/KZ, Pasteurella/Saigas/ 2010/ZKO/KZ, Pasteurella/Saigas/2012/ZK0/KZ, выделенные из внутренних органов и крови погибших
сайгаков в 2010-2012 гг., и Saigachiy/88 и Saigachiy/88/tel, выделенные из сайгаков в 1988 г., отличаются от штаммов из базы данных GenBank. Нуклеотидная последовательность гена ptfA казахстанского штамма Pasteurella/Saigas/2010/ZK0/KZ была депонирована в базу GenBank под идентификационным номером KT238894.1.
ЛИТЕРАТУРЫ
1. Орынбаев М. Б., Рыстаева Р. А., Керимбаев А. А., Копеев С. К., Коспанова М. Н., Кыдырбаев Ж. К. Случаи массовой гибели уральской популяции сайгаков в Казахстане // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. 2013, №1, С. 20-26.
2. Dancer A., Pinion V., Kock R., Orynbayev M., Karlstetter M., Singh N. J., Robinson S., Sarsenova B., Milner-Gulland E. J. Remote and in situ analyses of the potential causes of saiga antelope die-offs in Western Kazakhstan // Saiga News. 2013. V. 16. Р.16-18.
3. Rimler R. B. and Rhoades K. R. Pasteurella multocida // Pas-teurella and Pasteurellosis: Edited by C. F. Adlam and J. M. Rutter. London: Academic Press, 1989. P. 37-73.
4. Hunt M. L., Adler B. and Townsend K. M. The molecular biology of Pasteurella multocida // Veterinary Microbiology. 2000. V. 72. Р. 3-25.
5. Carter G. R., de Alwis M. C. L. Haemorrhagic septicaemia // Pasteurella and Pasteurellosis: Edited by C. F. Adlam and J. M. Rutter. London: Academic Press, 1989. P. 131 -160.
6. Glorioso J. C., Jones G. W., Rush H. G., Pentler L. J., Darif C. A., Coward J. E. Adhesion of type A Pasteurella multocida to rabbit pharyngeal cells and its possible role in rabbit respiratory tract infections // Infection and Immunity. 1982. V. 35. Р. 1103-1109.
7. Ruffolo C. G., Tennent J. M., Michalski W. P., Adler B. Identification, purification and characterization of the type 4 fimbriae
of Pasteurella multocida // Infect. and Immun. 1997. P. 339343.
8. Siju J., Kumar A. A., Shivachandra S. B., Chaudhuri P., Sri-vastava S. K. and Singh V. P. Cloning and characterization fim-brial gene (ptfA) of Pasteurella multocida serogroup B:2 (strain P52) // Veterinary Research Communications. 2007. V. 31. P. 397-404.
9. Doughty S. W., Ruffolo C. G., Adler B. The type 4 fimbrial subunit gene of Pasteurella multocida // Vet. Microbiol. 2000. V. 72. P. 79-90.
10. Hatfaludi T., Al-Hasani K., Boyce J. D. Outer membrane proteins of Pasteurella multocida // Vet. Microbiol. 2010. V. 144. P. 1-17.
11. Harper M., Boyce J. D., Adler B. Pasteurella multocida pathogenesis: 125 years after Pasteur // FEMS Microbiol Lett. 2006. V. 265. P. 1 -10.
12. Shivachandra S. B., Kumar A., Yegisharadhya R., Ramakrishnan М. A. and Viswas K. N. Carboxyl terminus heterogeneity of type IV fimbrial subunit protein of Pasteurella multocida isolates // Vet. Res. Commun. 2013. V. 37. P. 267-275.
13. Dalrymple B. and Mattick J. S. An analysis of the organization and evolution of type4 fimbrial subunit proteins // J. Mol. Evol. 1987. Р. 261-269.
14. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., and Kumar S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. // Mol. Biol. and Evol. 2013. V. 30. Р. 2725-2729.
15. Craig, L., Pique, M. E., Tainer, J. A., Type IV pilus structure and bacterial pathogenicity // Nature Rev. Microbiol. 2004. V. 2. P. 363-378.
16. Sellyei B., Banyai K., Magyar T. Characterization of the ptfA gen of avian Pasteurella multocida strains by allele-specific pol-ymerase chain reacation // J. Vet. Diagnos. Investig. 2010. V. 22. P. 607-610.
17. Gong Q., Qu N., Niu M. F. Evaluation of immunogenicity and protective efficacy of recombinant ptfA of avian // Iran. J. Vet. Res. 2016. V. 17. Р. 84-88.
Поступила в редакцию 06.06.2017 г.
CHARACTERISTICS OF FIMBRIAL GENE PTFA OF BACTERIA PASTEURELLA MULTOCIDA EXTRACTED FROM SAIGAS IN KAZAKHSTAN
© K. A. Shoraeva, V. M. Strochkov, S. O. Sadikalieva*, M. B. Orynbaev, N. T. Sandybaev, A. R. Sansyzbai, K. T. Sultankulova
Research Institute for Biological Safety Problems 080409 Gvardeiskii Village, Jambyl Region, Republic of Kazakhstan.
Phone: +7 (72636) 722 28.
*Email: sadikalieva86@mail. ru
The fimbrial gene ptfA plays a major role in the colonization and adhesion process on the surface of the Pasteurella multocida bacterium. The protein encoded by the ptfA gene is considered as a potential candidate for the creation of subunit vaccines. The nucleotide sequences of the ptfA gene of the Pasteurella multocida bacterium isolated in 2010-2012 are studied. The strains Pasteurella/Saigas/2010/ZK0/KZ, Pasteurella/Saigas/2010/ZK0/KZ, Pasteurella/Saigas/2012/ZKO/KZ were extracted from internal organs and blood of dead saigas of endangered species in Kazakhstan; the aim of the extraction was to determine genetic differences between strains using the GenBank international database. Both Saigachiy/88 and Saigachiy/88/tel extracted in 1988 on the territory of the Republic of Kazakhstan are identical by 100% according to the sequence of the ptfA gene. Kazakhstan strains of Pasteurella multocida bacteria extracted from saigas differ from strains from the GenBank database by the presence of six nucleotide substitutions: A(155)T (Adenines-Thymine), T(170)C (Thy-minesCytosine), G(180)A (GuaninesAlanine), T(305)C (ThyminesCytosine), A(350)T (Adenines-Thymine) and T(387)G (Thymines-Guanine).
Keywords: Pasteurella multocida, saiga, fimbrial gene, phylogenetic analysis. Published in Russian. Do not hesitate to contact us at bulletin_bsu@mail.ru if you need translation of the article.
REFERENCES
1. Orynbaev M. B., Rystaeva R. A., Kerimbaev A. A., Kopeev S. K., Kospanova M. N., Kydyrbaev Zh. K. Aktual'nye voprosy veterinarnoi biologii. 2013, No. 1, Pp. 20-26.
2. Dancer A., Pinion V., Kock R., Orynbayev M., Karlstetter M., Singh N. J., Robinson S., Sarsenova B. Saiga News. 2013. Vol. 16. Pp. 16-18.
3. Rimler R. B. and Rhoades K. R. Pasteurella and Pasteurellosis: Edited by C. F. Adlam and J. M. Rutter. London: Academic Press, 1989. Pp. 37-73.
4. Hunt M. L., Adler B. and Townsend K. M. Veterinary Microbiology. 2000. Vol. 72. Pp. 3-25.
5. Carter G. R., de Alwis M. C. L. Pasteurella and Pasteurellosis: Edited by C. F. Adlam and J. M. Rutter. London: Academic Press, 1989. Pp. 131-160.
6. Glorioso J. C., Jones G. W., Rush H. G., Pentler L. J., Darif C. A., Coward J. E. Infection and Immunity. 1982. Vol. 35. Pp. 1103-1109.
7. Ruffolo C. G., Tennent J. M., Michalski W. P., Adler B. Infect. and Immun. 1997. Pp. 339-343.
8. Siju J., Kumar A. A., Shivachandra S. B., Chaudhuri P., Srivastava S. K. and Singh V. P. Veterinary Research Communications. 2007. Vol. 31. Pp. 397-404.
9. Doughty S. W., Ruffolo C. G., Adler B. Vet. Microbiol. 2000. Vol. 72. Pp. 79-90.
10. Hatfaludi T., Al-Hasani K., Boyce J. D. Vet. Microbiol. 2010. Vol. 144. Pp. 1-17.
11. Harper M., Boyce J. D., Adler B. FEMS Microbiol Lett. 2006. Vol. 265. Pp. 1-10.
12. Shivachandra S. B., Kumar A., Yegisharadhya R., Ramakrishnan M. A. and Viswas K. N. Vet. Res. Commun. 2013. Vol. 37. Pp. 267-275.
13. Dalrymple B. and Mattick J. S. J. Mol. Evol. 1987. Pp. 261-269.
14. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., and Kumar S. Mol. Biol. and Evol. 2013. Vol. 30. Pp. 2725-2729.
15. Craig, L., Pique, M. E., Tainer, J. A. Nature Rev. Microbiol. 2004. Vol. 2. Pp. 363-378.
16. Sellyei B., Banyai K., Magyar T. J. Vet. Diagnos. Investig. 2010. Vol. 22. Pp. 607-610.
17. Gong Q., Qu N., Niu M. F. Iran. J. Vet. Res. 2016. Vol. 17. Pp. 84-88.
Received 06.06.2017.
