CC BY
13
Науковий вкник Л^вського нацюнального ушверситету ветеринарно! медицини та бютехнологш iMeHi С.З. Гжицького.
CepiH: Ветеринарнi науки
Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies. Series: Veterinary sciences
ISSN 2518-7554 print ISSN 2518-1327 online
doi: 10.32718/nvlvet9608 http://nvlvet.com.ua
UDC 619:616:981:25
Characterization of the biological properties of bacteriophages Staphylococcus aureus variant bovis
Yu.V. Horiuk
State Agrarian and Engineering University in Podilya, Kamianets-Podilskyi, Khmelnytskyi region, Ukraine
Article info
Received 02.10.2019 Received in revised form
03.11.2019 Accepted 04.11.2019
State Agrarian and Engineering University in Podilya, Schevchenko Str., 13, Kamianets-Podilskyi, Khmelnytskyi region, 32300, Ukraine. Tel.: +38-097-661-79-64 E-mail: goruky@ukr.net
Horiuk, Yu. V. (2019). Characterization of the biological properties of bacteriophages Staphylococcus aureus variant bovis. Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies. Series: Veterinary sciences, 21(96), 47-52. doi: 10.32718/nvlvet9608
Cattle mastitis is the main cause of economic losses in milk production worldwide, and Staphylococcus aureus is the pathogen that causes it most. Bacteriophages may be an alternative treatment for this disease. In this study, we studied the effect of temperature and pH on the lytic activity of bacteriophages isolated from cows with signs of mastitis. The isolation and production of pure phage lines were performed on an indicator culture of Staphylococcus aureus var. bovis 1491f conventional methods. The following phages were isolated and labeled: Phage SAvB07, Phage SAvB08, Phage SAvB12, Phage SAvB14. To determine the effect of temperature and pH, aliquots after the action of these factors were sown by the double agar method at regular intervals. The study found that phage lytic activity was temperature dependent. Thus, under the influence of temperature 45 °C after 30 minutes of action, it decreased by 3.0-3.4 times for bacteriophages Phage SAvB07, Phage SAvB08, Phage SAvB12 and after one hour was 2.4-12.6%. Phage SAvB14 strain was more resistant to temperature. Its activity decreased by only 67.6% during the analyzed period. With higher temperatures (55-65 °C), the intensity of phage infection decreased significantly, but remained stable. The most resistant to the effects of temperature was Phage SAvB14 - its activity was on average higher by 15.6-33.9% compared with other phages taken in the experiment. The results of our studies on the effect of pH on the reproduction of phages showed that the maximum number of phage virions was observed at pH 6 7. However, the most resistant to acidity was the phage strain Phage SAvB14, compared with other strains taken in the experiment. Therefore, the bacteriophage Phage SAvB14 exhibited the greatest stability and has considerable potential for in vivo use in the treatment of mastitis of cows caused by Staphylococcus
Key words: mastitis, bacteriophages, Staphylococcus aureus, lytic activity, temperature, pH.
Характеристика бюлопчних властивостей бактерюфапв Staphylococcus aureus variant bovis
Ю.В. Горюк
Подтъсъкий державный аграрно-техтчнийутверситет, м. Кам 'янець-Подыьський, Хмельницька обл., Украгна
Мастит великоi рогатоi худоби е основною причиною економгчних втрат у виробництвг молока в усьому ceimi, а золотистий стафтокок - збудник, який найчастше його викликае. Бактерюфаги можуть бути альтернативним методом л^вання цього захворювання. В даному дослгджент ми вивчали вплив температури i рН середовища на лтичну актившсть бактергофаггв, видг-лених вгд коргв з ознаками маститу. Видтення та отримання чистих лтш фаггв проводили на тдикаторшй культург Staphylococcus aureus var. bovis 1491f загальноприйнятими методами. Видыено i позначено наступш фаги: Phage SAvB07, Phage SAvB08, Phage SAvB12, Phage SAvB14. Для визначення впливу температури та рН алжвоти тсля дп зазначених чинниюв виЫвали методом подвтного агару через певш промiжки часу. За результатами до^дження встановлено, що фагова лтична актившсть залежала вiд температури. Так, за впливу температури 45 °С через 30 хвилин дй вона знизилася в 3,0-3,4 разу для бакmерiофагiв
Phage SAvB07, Phage SAvB08, Phage SAvB12, i через одну годину була в межах 2,4-12,6%. СтшкШим до впливу температури був штам Phage SAvB14. Його активтсть знизилася лише на 67,6% протягом аналiзованого перюду. За впливу вищих температур (55-65 °С) ттенсивтсть фаговоЧ шфекци значно знижувалася, проте залишалася стабтьною. Найбтьш стшким до впливу температури виявився Phage SAvB14 - його активтсть була в середньому вища на 15,6-33,9% порiвняно з тшими фагами, взятими в до^д. Результати наших до^джень щодо впливу рН на репродукцЮ фагiв показали, що максимальна ктьюсть фагових вiрiонiв спостер^алася при рН 6-7. Проте найбтьш стшким до змти кислотностi був штам фагу Phage SAvB14, порiвняно з тшими штатами, взятими в до^д. Отже, бактерюфаг Phage SAvB14 проявляв найбтьшу стабтьтсть i мае значний потенщал для застосування in vivo при л^вант маститiв корiв, спричинених золотистим стафтококом.
Ключовi слова: мастит, бактерюфаги, золотистий стафтокок, лШична активтсть, температура, pH.
Вступ
Багато pi3Hm видiв бактерш мають здатшсть ви-кликати шфекцш молочно! залози велико! рогато! худоби, i реакщя оргашзму на щ шфекци - це те, що ми називаемо маститом. Золотистий стафшокок -поширений i небезпечний збудник, що викликае pi3Hi шфекцшш захворювання, включаючи мастити у корiв (Kukhtyn et al., 2016; Horiuk et al., 2018). Лшування цього захворювання стае все складшшим через поши-рення полiрезистентних шташв стафшокошв (Horiuk et al., 2019). Тому юнуе нагальна потреба в розробщ нових терапевтичних засобiв, спрямованих проти цього патогенна (O'Flaherty et al., 2005a; Jensen et al., 2015; Moodley et al., 2019).
1снуе багато альтернативних методiв лiкування маститiв у корiв, так як використання вакцин
Адсорбщя фагу
Проте на даний час дослвдники звертають недоста-тньо уваги на можливють використання специфiчних бактерiофагiв, видшених з вогнища iнфекцi!, проти конкретного захворювання. Особливо це стосуеться такого захворювання, як субклшчний мастит корiв, що завдае значних економiчних збитшв через розви-ток антибiотикорезистентностi у збуднишв та необ-хiднiсть бракування молока (Hanlon, 2007; Kukhtyn et al., 2016; Kovalenko et al., 2018).
Хоча кожне дослвдження мало вагомi результати, варто зазначити, що юнують певнi обмеження при використаш !х in vivo. Фагова шактиващя може бути викликана молочними бiлками та жирами (O'Flaherty et al., 2005b), агрегащею клiтин S. aureus всередиш залози (O'Flaherty et al., 2005a) та iмунними факторами само! корови (O'Flaherty et al., 2005b). Тому кнуе необхщшсть вивчення впливу рiзних факторiв на актившсть фагiв для правильного застосування фагових препарапв внутрiшньовименно та !хню здатнiсть дiяти в iнтрамамальному середовищг
(Gogoi-Tiwari et al., 2015), рослинних екстракпв (Karreman, 2007), фаготерапiя (Lin et al., 2017; Horiuk, 2018). Враховуючи рiзноманiття шформацп, фаготе-рашя е однiею з найбiльш надшних засобiв боротьби з маститом велико! рогато! худоби.
Вченi видели та дослiджували рiзнi фаги з логичною дiею щодо S. aureus (Dias et al., 2013; Jensen et al., 2015; Moodley et al., 2019). Антибаш^альний ефект препарапв бактерюфапв обумовлений впроваджен-ням генома фага в бактерiальну клтшну з подальшим його розмноженням i лiзисом iнфiковано!' клiтини (Hanlon, 2007). Фаги, що вийшли в зовшшне середо-вище в результатi лiзису бактери, повторно iнфiкують i лiзують iншi бактерiальнi клiтини, дшчи до повного знищення патогенних бактерiй у вогнищi запалення (рис. 1) (Mahony et al., 2011).
; ödKiepiajibHGi КШТПШ1
Основною метою цього дослiдження е вивчення чутливостi фагiв до температури та рН середовища in vitro для моделювання ситуацй' при застосуванш !х in vivo.
MaTepia™ i методи дослiджень
Для видшення та нарощення титру бактерiофагiв використовували штам золотистого стафiлококу Staphylococcus aureus var. bovis 1491f, який видшений зi зразка секрету молочно! залози ВРХ, хворо! субкль нiчною формою маститу, та первюно депонований в Депозитарп Державного науково-контрольного шсти-туту бiотехнологi!' i штамiв мiкроорганiзмiв тд номером 736 (Свiдоцтво на штам ввд 05.03.2019).
Видiлення фапв проводили зi зразкiв молока з умютом соматичних клiтин понад 400 тис/см3. Пер-винне видiлення та отримання чистих лiнiй бактерюфапв проводили за методикою, розробленою Oliveira et al. (Merabishvili et al., 2009). Дослвджуваний матерь ал заавали в МПБ. Одночасно в живильне середови-
Ро'змноженна фаггв J
в серелиш бактерй
Рис. 1. Життевий цикл лiтичного бактерiофага
ще вносили 0,2-0,5 мл, або повну бактер1альну петлю добово! культури S. aureus var. bovis. Флакони з пось вами ставили в термостат при 37 °С, на 18-20 годин. Шсля шкубацп вмют флакошв ф1льтрували через фшьтри для звшьнення ввд мехашчних домшок. Шс-ля цього вмют розливали в стерильш проб1рки, центрифугували при 3000 об./хв протягом 30 хвилин. Надосад очищували ввд сторонньо! мшрофлори, вико-ристовуючи двоступеневу фшьтрацш: мембранш фшьтри з д1аметром пор 0,45 мкм (Sartorius, Шмечи-на); Отриманий фагол1зат дослвджували на наявнють фапв. Лггичну актившсть бактерюфапв, а також мор-фолопю негативних колонш вивчали за методом Гра-ща. Для цього готували 1,5% МПА i розливали в ста-ндартш чашки Петрi по 25,0-30,0 мл. Агар тдсушу-вали в термостат протягом 30 хвилин. Окремо готували 0,7% МПА (нашврщкий), розливали його в про-бiрки i стерилiзували звичайним методом. В пробiрки з 0,7% МПА розплавленим i охолодженим до 45 °С додавали по 1 мл фаголiзату i 0,2 мл добово! бульйон-но! iндикаторноl культури. Вмiст пробiрок перемiшу-вали i наливали подвшним шаром в чашки Петрi з 1,5% МПА. Поави iнкубували за температури (37 ± 1) °С упродовж 18-24 год. Таким чином, видше-но i позначено так фаги: Phage SAvB07, Phage SAvB08, Phage SAvB12, Phage SAvB14.
Для визначення впливу високих температур на ак-тившсть видшених фагiв готували розведення кожного штаму з розрахунку 105 БУО/мл. Кожне розведення помiщали у водяну баню за рiзних температур: 35 (контроль), 45, 55, 65 °С. Через кожш 10 хвилин проводили в^^р певно! ал^оти дослiджуваних зразк1в, додавали тест-культуру i висiвали методом двошаро-вого агару. Чашки шкубували за температури 37 °С протягом 18-24 год. Дослщження проводили в трьох повторах.
Для визначення впливу рН середовища на актив-нiсть фапв поживний бульйон було вiдкалiбровано (використовуючи 1 М HCl) вiдповiдно до таких дiапа-
-Phage SAxB07-Phage SA\B08
-Phage SA\B12-Phage SA\BI4
зошв pH: 2, 4, 6, 8, 10, 12 i 14. Кожне розведення бактерюфапв додавали до вiдкалiброваного бульйону з розрахунку, щоб в шнцевому результатiв вмiст фапв був 105 БУО/мл. Зразки витримували при кiмнатнiй температурi протягом 1 години. Попм вiдбирали аль квоти дослiджуваних зразк1в, додавали чутливу добо-ву культуру i висiвали методом двошарового агару. Чашки iнкубували за температури 37 °С протягом 1824 год. Дослвдження проводили в трьох повторах.
Статистичну обробку результата здiйснювали методами варiацiйно! статистики з використанням про-грами Statistica 9.0 (StatSoft Inc., USA). Застосовували непараметричнi методи дослiджень (критерп У!лкок-сона, Манна-У!тш). Визначали середне арифметичне (x), стандартну похибку середньо! величини (SE).
Результати дослiджень
За результатами дослвджень встановлено, що шд-вищення температури в поеднаннi зi збшьшенням часу впливу ще! температури знижуе лiтичну актив-нiсть видiлених фапв (рис. 2). Так, к1льк1сть активних фапв за впливу температури 45 °С протягом перших 10 хвилин знизилася на 40,7-27,6%. Лише шльшсть активного фагу Phage SAvB14 була майже незмшною. Температура 55-65 °С згубно дiяла на всi дослщжу-ванi штами бактерiофагiв. За першi 10 хвилин впливу кiлькiсть життездатних фагiв знизилася на 29,9-61,7 та 60,3-90,1% ввдповвдно. В подальшому фагова ре-продуктивна актившсть ввдносно стабшзувалася в усiх дiапазонах температур, але залишалася низькою. Крiм того, були вщзначенш вiдмiностi мiж кожним фагом. Найб№ш стiйким до впливу температури виявився Phage SAvB14 - його актившсть була в сере-дньому вища на 15,6-33,9% порiвняно з шшими фагами, взятими в дослщ.
Усi дослiджуванi фаги (Phage SAvB07, Phage SAvB08, Phage SAvB12, Phage SAvB14) виявилися чутливими до змши рН середовища (рис. 3).
-Phage SAxBO'-Phage SAvBOS
# -Phage SA\B12-PhageSAvBM
■Э 100
TO
I 80 |
1 60
к
я 40 p
ы
2 20 p
о
О 10 20 30 40 50 60 Час впливу, хвилнни
И 0 10 20 30 40 50 60
Час впливу, xbiитини
А
Б
Рис. 2. Вплив температури на лггачну актившсть бактерюфапв: А - температура 35 ± 2 °С (контроль); Б - 45 ± 2 °С; В - 55 ± 2 °С; Г - 65 ± 2 °С. Даш подано як середне значення ± стандартне ввдхилення
-Phage SAxB07 -Phage SAv£08
£ -Phage SAxB12 -PhageSAxB 14
I
с v
¡5 2 4 6 8 10 12 14
pH
Рис. 3. Вплив pH на лггачну актившсть бактерюфапв. Даш подано як середне значення ± стандартне
ввдхилення
- Phage SAvB07 ■ ■PhageSAxB12 ■
Phage SAvBOS Phage SAvB 14
10 20 30 40 50 60
Час впливу. хвилйнн
В
100
s SO
о
'I
w ю Id
s
ш
P
И
Л
60
40
20
■ Phage SAxB 07-Phage SAxBOS
■ Phage SA\BI2-Phage SAxB 14
0 10 20 30 40 50 60 Час впливу, хвилинн
Згубно на актившсть фапв д1яли як низыа, так i висок1 значення рН. Найбшьшу стабiльнiсть вони проявили при значенш рН в межах 6-7, тобто близь-кому до нейтрального. Поза цими значеннями актившсть значно знижувалася.
Загалом отримаш результати дослщжень показали, що видiленi бактерiофаги в тш чи iншiй мiрi стшш до змiни температури та рН середовища. Проте найбiльш широкий дiапазон термiчноl та pH-стiйкостi проявив фаг Phage SAvB14.
Обговорення
Антибютикорезистентшсть S. аигеш та складнiсть лiкування викликаних ним захворювань свiдчать про необхщшсть альтернативно! терапii маститу корiв. Фаги пропонують цю альтернативу (Merabishvili et al., 2009; Moodley et al., 2019). Однак iснуе дек1лька проблем, пов'язаних iз застосуванням фапв в штрамама-льному середовищi через вплив на них рiзних еколо-
гiчних та хiмiчних факторiв (Dias et al., 2013; Moodley et al., 2019). Основною метою цього дослвдження було оцшити вплив температури та рН середовища на актившсть бактерюфапв in vitro.
Вплив температури на фагову актившсть мае ве-лике значення (Jensen et al., 2015; Rehman et al., 2016; Kukhtyn et al., 2017; Klopatek et al., 2018). При тесту-ванш впливу ступеня про^вання на фаги ошнюють 1хню здатшсть якнайдовше зберiгати сво! властивостi при найвищих температурах (Jensen et al., 2015; Rehman et al., 2016; Kukhtyn et al., 2017). Це поясню-еться тим, що в природних умовах застосування фапв вимагае толерантносп до коливання температурних режимiв. Змiна температури може виникнути через погодш умови при зберiганнi чи транспортуванш фагових препаратiв, фiзiологiчнi змши в органiзмi тварин. Усi дослщжеш нами фаги показали зниженя лггачно! активностi вже через 10 хв за температури 45 °C.
При промисловому виготовленш медикаментiв де-якi процеси можуть вимагати високого температурного режиму. Це важливо, особливо з точки зору комер-цiйного виробництва фагових препаратiв. Фаги на-самперед складаються з бiлка (Wills et al., 2005; Svircev et al., 2018) i будь-який тривалий вплив висо-ко! температури може спричинити денатурац1ю фагових бiлкiв, що вiдповiдають за iнфiкування бактерш-господарiв. Нашi результати спiввiдносяться з попе-реднiми дослiдженнями, де показано, що лггична здатнiсть фага знижуеться при тривалому впливi ви-соких температур (Hanlon, 2007; Mahony et al., 2011; Saglam et al., 2017).
рН середовища, в якому розмножуеться фаг, також е важливим чинником (O'Flaherty et al., 2005a; Saglam et al., 2017). Оптимальш значения водневого показни-ка для росту i розмноження бактерiофагiв в умовах in vitro мають бути максимально наближеними до природного середовища, з якого видшений даний фаг. рН молока перебувае в межах 6,6-6,7. Результати наших дослвджень показали, що максимальна реплжашя фапв ввдбулася при рН 6-7. Схожi результати були отримаш шшими вченими. Вивчалася стабiльнiсть щодо рН в буферах при дiапазонi рН 2-12. Фаг SLPW, який активний проти Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, показав ввдносно високий рь вень виживання (понад 80%) при рН ввд 6 до 10. Поза цими значеннями актившсть рiзко знижувалася (Wang et al., 2016).
Висновки
Проведенi дослiджения визначають оптимальнi умови для зберпання фагово! активностi бактерюфапв Phage SAvB07, Phage SAvB08, Phage SAvB12, Phage SAvB14. Ввдхилення вщ стандартних умов зберiгания фапв призвели до рiзкого зниження фагово! активности Проте фаг Phage SAvB14 стшшший до впливiв високих температур i коливання рН порiвняно з ш-шими дослiдженими фагами, а отже е кращим для створення препарату проти стафiлококового маститу корiв.
References
Dias, R.S., Eller, M.R., Duarte, V.S., Pereira, A.L., Silva, C.C., Mantovani, H.C., Oliveira, L.L., Silva, E. de A.M, & Paula, S.O. (2013). Use of phages against antibiotic-resistant Staphylococcus aureus isolated from bovine. Journal of Animal Science, 91(8), 3930-3939. doi: 10.2527/jas.2012-5884. Gogoi-Tiwari, J., Williams, V., Waryah, C.B., Eto, K.Y., Tau, M., Costantino, P., & Mukkur, T. (2015). Comparative studies of the immunogenicity and protective potential of biofilm vs planktonic Staphylococcus aure-us vaccine against bovine mastitis using non-invasive mouse mastitis as a model system. Biofouling, 31(7), 543-554. doi: 10.1080/08927014.2015.1074681. Hanlon, G.W. (2007). Bacteriophages: an appraisal of their role in the treatment of bacterial infections. In-
temational Journal of Antimicrobial Agents, 30(2), 118-128. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2007.04.006.
Horiuk, Y.V. (2018). Fagotherapy of cows mastitis as an alternative to antibiotics in the system of obtaining environmentally safe milk. Scientific Messenger of LNU of Veterinary Medicine and Biotechnologies. Se-ries: Veterinary Sciences, 20(88), 42-47. doi: 10.32718/nvlvet8807.
Horiuk, Yu., Kukhtyn, M., Kovalenko, V., Kornienko, L., Horiuk, V., & Liniichuk, N. (2019). Biofilm formation in bovine mastitis pathogens and the effect on them of antimicrobial drugs. Independent Journal of Management & Production, 10(7), 897-910. doi: 10.14807/ijmp.v10i7.1012.
Horiuk, Yu.V., Kukhtyn, M.D., Perkiy, Yu.B., & Horiuk, V.V. (2018). Distribution of main pathogens of mastitis in cows on dairy farms in the western region of Ukraine. Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies, 20(83), 115-119. doi: 10.15421/nvlvet8322.
Jensen, K.C., Hair, B.B., Wienclaw, T.M., Murdock, M.H., Hatch, J.B., Trent, A.T., & Berges, B.K. (2015). Isolation and host range of bacteriophage with lytic activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus and potential use as a fomite decontaminan! PLoS One, 10(7), e0131714. doi: 10.1371/journal.pone.0131714.
Karreman, H.J. (2007). Phytotherapy for dairy cows. Veterinary Herbal Medicine. SG Wynn and BJ Fougere, ed. Mosby, St. Louis, MO.
Klopatek, S., Callaway, T.R., Wickersham, T., Sheridan, T.G., & Nisbet, D.J. (2018). Bacteriophage Utilization in Animal Hygiene. Bacteriophages: Biology, Technology, Therapy, 1-28. doi: 10.1007/978-3-319-40598-8_30-1.
Kovalenko, V.L., Kovalenko, P.L., Ponomarenko, G.V., Kukhtyn, M.D., Midyk, S.V., Horiuk, Y.V., & Garkavenko, V.M. (2018). Changes in lipid composition of Escherichia coli and Staphylococcus areus cells under the influence of disinfectants Barez®, Biochlor® and Geocide®. Ukrainian Journal of Ecology, 8(1), 547-550. doi: 10.15421/2018_248.
Kukhtyn, M.D., Horyuk, Y.V., Horyuk, V.V., Yaroshen-ko, T.Y., Vichko, O.I., & Pokotylo, O.S. (2017). Biotype characterization of Staphylococcus aureus isolated from milk and dairy products of private production in the western regions of Ukraine. Regulatory Mechanisms in Biosystems, 8(3), 384-388. doi: 10.15421/021759.
Kukhtyn, M.D., Kovalenko, V.L., Horyuk, Y.V., Horyuk, V.V., & Stravskyy, Y.S. (2016). Bacterial biofilms formation of Cattle mastitis pathogens. Journal for Veterinary Medicine, Biotechnology and Biosafety, 2(4), 30-32. http://jvmbbs.kharkov.ua/archive/2016/ volume2/issue4/pJVMBBS_2016024_030-032.pdf.
Lin, D.M., Koskella, B., & Lin, H.C. (2017). Phage therapy: an alternative to antibiotics in the age of multi-drug resistance. World journal of gastrointestinal pharmacology and therapeutics, 8(3), 162. doi: 10.4292/wjgpt.v8.i3.162.
Lopetuso, L., Giorgio, M., Saviano, A., Scaldaferri, F., Gasbarrini, A., & Cammarota, G. (2019). Bacteriocins and Bacteriophages: Therapeutic Weapons for Gastrointestinal Diseases? International Journal of Molecular Sciences, 20(1), 183. doi: 10.3390/ijms20010183.
Mahony, J., McAuliffe, O., Ross, R.P., & van Sinderen, D. (2011). Bacteriophages as biocontrol agents of food pathogens. Current Opinion in Biotechnology, 22(2), 157-163. doi: 10.1016/j.copbio.2010.10.008.
Merabishvili, M., Pirnay, J. P., Verbeken, G., Chanishvili, N., Tediashvili, M., Lashkhi, N., Glonti, T., Krylov, V., Mast, J., Van Parys, L., Lavigne, R., Volckaert,
G., Mattheus, W., Verween, G., De Corte, P., Rose, T., Jennes, S., Zizi, M., De Vos, D., & Vaneechoutte, M. (2009). Quality-controlled small-scale production of a well-defined bacteriophage cocktail for use in human clinical trials. PLoS One, 4(3), e4944. doi: 10.1371/journal.pone.0004944.
Moodley, A., Kot, W., Nalgard, S., Jakociune, D., Neve,
H., Hansen, L. H., & Vogensen, F.K. (2019). Isolation and characterization of bacteriophages active against methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedi-us. Research in Veterinary Science, 122, 81-85. doi: 10.1016/j.rvsc.2018.11.008.
O'Flaherty S, Ross RP, Flynn J, Meaney WJ, Fitzgerald GF, Coffey A (2005a). Isolation and characterisation of two anti-staphylococcal bacteriophages specific for pathogenic Staphylococcus aureus associated with bovine infections. Letters in Applied Microbiology, 41, 482-486. doi: 10.1111/j.1472-765X.2005.01781.x.
O'Flaherty, S., Coffey, A., Meaney, W. J., Fitzgerald, G. F., & Ross, R.P. (2005b). Inhibition of bacteriophage
K proliferation on Staphylococcus aureus in raw bovine milk. Letters in Applied Microbiology, 41, 247279. doi: 10.1111/j.1472-765X.2005.01762.x.
Rehman, S., Khan, T., & Raza, S. (2016). Isolation of bacteriophage against Staphylococcus aureus causing mastitis. International Journal of Advanced Multidis-ciplinary Research, 3(4), 1393-1395.
Saglam, A. G., Sahin, M., Celik, E., Celebi, O., Akca, D., & Otlu, S. (2017). The role of staphylococci in subclinical mastitis of cows and lytic phage isolation against to Staphylococcus aureus. Veterinary World, 10(12), 1481. doi: 10.14202/vetworld.2017.1481-1485.
Svircev, A., Roach, D., & Castle, A. (2018). Framing the future with bacteriophages in agriculture. Viruses, 10(5), 218. doi: 10.3390/v10050218.
Topuzoglu, B, Bastan, A., & Salar, S. (2015). The effect of long term antibiotic treatment on bacteriological cure and somatic cell count at subclinical mastitis due to Staphylococcus aureu s in lactating dairy cows. Veterinary Journal of Ankara University, 62, 289294.
Wang, Z., Zheng, P., Ji, W., Fu, Q., Wang, H., Yan, Y., & Sun, J. (2016). SLPW: A virulent bacteriophage targeting methicillin-resistant Staphylococcus aureus in vitro and in vivo. Frontiers in microbiology, 7, 934. doi: 10.3389/fmicb.2016.00934.
Wills, Q. F., Kerrigan, C., & Soothill, J. S. (2005). Experimental bacteriophage protection against Staphylococ-cus aureus abscesses in a rabbit model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49(3), 1220-1221. doi: 10.1128/AAC.49.3.1220-1221.2005.
