CC BY
57
УДК 619:616.995.132.6-074/-076
Небещук Л.В., астрант, ([email protected]) ®
Быоцершеський нацюнальний аграрный утеерситет
ХАРАКТЕРИСТИКА Б1ЛКОВОГО СКЛАДУ СОМАТИЧНОГО ТА ЕКСКРЕТОРНО-СЕКРЕТОРНОГО АНТИГЕН1В ЛИЧИНОК
TOXOCARA CANIS
Отримано соматичний та екскреторно-секреторний антигены личинок Toxocara canis, охарактеризовано быкоеий склад цих антигете. Встаноелено, що iмунореактиеними быками соматичного антигену е протети, ят мають молекулярну масу 30-32, 37, 46, 50, 70 та 110 kDa, екскреторно-секреторного -47 та 70 kDa.
Ключовi слова: токсокароз, антигени Toxocara canis, електрофорез, iмуноблотинг
Вступ. Токсокарозна iнвазiя м'ясо!дних характеризуемся наявшстю 2-х фаз розвитку T. canis, а отже 2-х форм клмчного переб^у: м^рацшно! та кишково!. Якщо для дiагностики останньо! використовують гельмiнтологiчнi методи дослiджень (флотацшш, комбiнованi), то виявити мiграцiйну форму гельмштозу,обумовлену паразитуванням личинок токсокар, як в тканинах, так i кровi хворо! тварини чи людини, досить складно [1].
Одним iз перспективних i високоефективних методiв зажиттев! дiагностики "visceral larvae migrans" е iмуноферментний аналiз (тест ELISA) [2, 3]. Вш дозволяе виявити в сировотщ кровi на раннiх стадiях швази чи в iнших рiдинах оргашзму антитiла чи циркулюючi антигени збудника.
Чутливкть та специфiчнiсть будь-якого серолопчного тесту, у тому числi iмуноферментного аналiзу, мае важливе значення i залежить, в першу чергу, вщ якостi антигену, основного компоненту дiагностичного набору для iмуноферментного аналiзу [4].
Науковi дослiдження щодо розробки тест-систем за токсокарозно! швази у людей свщчать про використання соматичних антигешв личинок Toxocara canis. При використанш цих антигенiв, як повiдомляють вчеш, можливе виникнення перехресних реакцiй, якщо в макроорганiзмi паразитують i iншi гельмiнти.
Вiдомо, що iнвазiйнi личинки токсокар в органiзмi живителя видшяють продукти свое! життедiяльностi (екскрети та секрети). Ui речовини також використовують, як антигени в серолопчних реакщях. 1х називають екскреторно-секреторними антигенами Toxocara canis [5]. Використання екскреторно-секреторних антигешв личинок токсокар в ELISA дае можливють виготовляти ефективш дiагностикуми, що виявляють iнвазiю у тварин та людини на рiзних стадiях !! розвитку. Антигени отримують шляхом культивування личинок токсокар у стерильних умовах на спещальних
® Небещук Л.В., 2010
225
живильних середовищах. Продукти метаболiзму, яю продукують личинки in vitro, мають високу чутливкть (92-95 %) та специфiчнiсть (73-78 %) [6].
Матер1ал i методи. Матерiалом для наших дослiджень були личинки T. canis першо! стади. 1х отримували пiсля культивування яець токсокар, видшених з матки статевозрiлих самок, до швазшн! стади. З метою руйнування оболонки кортикального шару яець у пробiрки, де знахоилися швазшш яйця, вносили водний розчин хлору (14% активного хлору), а поим суспензш декортикованих яець помщали в гомогешзатор Поттера, в якому завершувався процес руйнування яйцевих оболонок. Для звшьнення отримано! культури вщ яйцевих оболонок водний розчин з хлором перецщжували через металеве ситечко з розмiром вiчок 20 мкм. Оболонки яець затримувалися на ситечку, а очищеш личинки проходили через вiчка ситечка. Чистi личинки T. canis слугували матерiалом для виготовлення антигешв.
Соматичний антиген отримували шляхом екстрагування бшюв личинок токсокар протягом 16 годин при +4 оС тсля !х гомогешзаци в 0,1 М буферному розчиш Tris-HCl рН 8,2 з вмктом 0,01 М PMSF. Шсля цього гомогенат центрифугували 30 хв при 15 тис. об/хв. Надосадкову рщину використовували як антиген.
Для отримання екскреторно-секреторного антигену проводили культивування личинок токсокар першо! стадп на живильному середовищi DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) з пенщилшом, стрептомiцином по 100 ОД/мл, а фунпзоном (5,6 мкг/мл). Концентращя личинок у живильному середовищi була 5000 екз. на 1 мл. Культивування проводили протягом 1 тижня при 37 оС в СО2-iнкубаторi з умктом 5 % CO2.
Пiсля закiнчення шкубаци личинки токсокар видаляли з середовища фiльтрацiею через паперовий фiльтр з наступним центрифугуванням протягом 10 хв при 15 тис. об/хв. Надосадову рщину концентрували в 100 разiв пiд тиском через фiльтри „Nanosep 10k" фiрми „PALL Corporation" (США) з мембраною, що затримуе бiлки молекулярною масою 10000 Da i бiльше.
Концентрацiю бшюв у антигенах визначали спектрофотометром EPPENDORF при довжинi хвилi 280 нм. Отримаш антигени фасували у флакони по 1 мл та збер^али при -70 оС.
Бiлковий склад отриманих антигешв визначали шляхом роздшення !х за молекулярною масою електрофорезом в денатуруючих умовах з концентращею полiакриламiдного гелю (ПААГ) 12 % за методом U.K. Laemmli. Для контролю отриманих бшюв використовували проте!новий маркер з 7 бшками молекулярною масою вщ 14,4 до 116 kDa („Fermentas □, Литва).
1муноблот проводили за методикою, описаною H. Towbin et al. [7]. Перенесення бшюв з ПААГ здiйснювали на PVDF мембрану Amerham Hybond-P за допомогою спещального модуля апарату „Hoefer mini VE' (Amerham Biosciences Corporation, USA) упродовж 1 год за сили струму 200 мА.
Для контролю ефективност пересення бiлкiв з ПААГ частину мембрани, на якш знаходився маркер, вiдрiзали та фарбували фарбою Amido Black. 1ншу частину мембрани блокували протягом 1 год при 37 оС у фосфатно-сольовому
226
буферi (ФСБ) з 3 % сухого знежиреного молока та 0,05 % Твшу 20, висушували та рiзали на смужки (стрипи).
Протягом 1 години стрипи шкубували при юмнатнш температурi з позитивними та негативними на токсокароз сироватками кров^ розведеними 1:100 у ФСБ з 5 % сухого знежиреного молока та 0,05 % Твшу 20. Шсля закшчення шкубацп стрипи промивали вщ антитш, що не зв'язалися.
Комплекси антиген-антитiло, якi утворилися на мембраш, виявляли за допомогою коньюгату рекомбiнантного бiлка А золотистого стафшокока, коньюгованого з колощним золотом. Результат реакци оцiнювали вiзуально. У позитивному випадку на стрипах виявляли червош смужки, якi вiдповiдали бшкам антигену з тieю чи шшою молекулярною масою.
Результати дослщжень. Були виготовлеш два антигени з личинок нематоди Toxocara canis: соматичний та екскреторно-секреторний. Аналiз результатiв електрофорезу отриманих антигешв в ПААГ, показав, що соматичний антиген складався з ряду проте!шв з молекулярною масою вщ 15 до 120 kDa, однак мажорними (найбшьш ефективними) були бшки з молекулярною масою 27 kDa, 32, 37, 46, 50 та 70 kDa. До бшкового спектру екскреторно-секреторного антигену входили протеши, молекулярна маса яких коливалася в межах вщ 25 до 120 kDa. Основним компонентом екскреторно-секреторного антигену були бшки з молекулярною масою 32, 37 i 70 kDa (рис. 1).
1 2 3
кШ 116,0
60,2
45,0 35,(1
25,0
18,4 14,4
Рис. 1. Електрофорез в ПААГ антигешв личинок T. canis:
1 - маркер молекулярно! маси бшюв; 2 - екскреторно-секреторний антиген; 3 -
соматичний антиген
227
Виявлення значного спектру бшюв з рiзною молекулярною масою в екскреторно-секреторному антигеш може виникати в результат загибелi личинок токсокар тд час !х культивування на живильному середовищi та вивiльнення в середовище соматичних антигенiв.
Дослiдження в iмуноблотингу соматичного антигену з позитивними сироватками кровi собак, природно швазованих токсокарами, а також отриманих вщ експериментально заражених та негативними сироватками кровi тварин вiльних вiд личинок токсокар, було встановлено, що екстракт iз личинок T. canis мае декшька бiлкових фракцiй, з якими специфiчно зв'язуються протитоксокарознi антитiла. 1мунорективними проте!нами даного антигену е бшки, що мають молекулярну масу 30-32, 37, 46, 50, 70 1 110 Ша (рис. 2).
I II
к Па
к1>а
116,0
116,0
66,2
66,2
45,0
45,0
35,0
35,1)
25,0
25,0
18,4
14,4
14,4
М
А
М
I X з
Рис. 2. 1муноблотинг з антигенами личинок Т. canis:
I - соматичний антиген; II - екскреторно-секреторний антиген; М - маркер молекулярно! маси бшюв; 1 - сироватка кров^ отримана вщ собаки на 28 добу експериментально! швази T. canis; 2 - сироватка кровi собаки, природньо заражено! T. canis; 3 - сироватка кровi собаки, вшьно! вщ гельмшив.
У екскреторно-секреторного антигену T. canis з позитивними сироватками кровi специфiчно взаемодiяв цiлий спектр iмунореактивних бiлкiв, якi знаходилися в межах 37-120 Юа. Iмунореактивнiсть щодо антитоксокарозних антитш мали бiлковi фракцi! з молекулярною масою 32, 37, 46-50 i 70 Юа. Однак, специфiчними виявилися проте!ни, що мали молекулярну масу 47 та 70 Юа. Даш компоненти екскреторно-секреторного антигену реагували з антитшами сироваток кровi тварин, як експериментально заражених, так i природно швазованих нематодами T. canis.
228
Висновки.
1. В результат проведених дослщжень нами отримано 2 антигени личинок токсокар: соматичний та екскреторно-секреторний. Визначено ïx бшковий склад, встановлено iмунореактивнiсть окремих бшкових фракцш антигешв.
2. 1мунореактивними бшками соматичного антигену е протеïни, що мають молекулярну масу 30-32, 37, 46, 50, 70 та 110 kDa, екскреторно-секреторного 47 та 70 kDa.
3 Продовжуеться дослщження з вивчення чутливост та специфiчностi отриманих антигешв в iмуноферментному аналiзi.
Л1тература
1.Burke T.M. Prenatal and lactational transmission of Toxocara canis and Ancylostoma caninum : experimental infection of the bitch before pregnancy / Т.М. Burke, E.L. Roberson // Int. J. Parasitol.-1985 - Vol. 15. - P. 71-75.
2.Despommier D. Toxocariasis: clinical aspects, epidemiology, medical ecology, and molecular aspects / D. Despommier // Clin Microbiol Rev. - Apr. 2003. - Vol.16. - №. 2. - P. 265-72.
3.Константинова T.H. Циркулирующие иммунные комплексы, общие IgE и специфические IgE-антитела у больных токсокарозом / Т.Н. Константинова //Мед. паразитол, - 1998. - №2. - С.32-34.
4.Lewis J. W., Maizels R. M. Toxocara and Toxocariasis, clinical, epidemiological and molecular perspectives / J.W. Lewis, R.M. Maizels // British Society for Parasitology and Institute of Biology, - 1993. - P. 49-53.
5.Savigny D. H. In vitro maintenance of Toxocara canis larvae and a simple method for the production of Toxocara ES antigens for use in serodiagnostic tests for visceral larva migrans / D.H. Savigny // J. Parasitol., - 1975. - Vol. 61. - P. 781-782.
6.Pollard Z.F. ELISA for diagnosis of ocular toxocariasis / Z.F.Pollard, W.H. Jarrett, W.S. Hagler et al. // Opthalmology. - 1979. - Vol. 86. - P. 743-749.
7.Towbin H., Staehlin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications / H. Towbin, T. Staehlin, J. Gordon // Proc. Natl. Acad. Sa. USA. 1979. - Vol. 76. - P. 4350 - 4354.
Summary Nebeshchuk L.
THE CHARACTERISTIC OF PROTEINS COMPOSITION OF SOMATIC AND EXCRETORY-SECRETORY ANTIGENS OF TOXOCARA CANIS
LARVAE
The somatic and excretory-secretory antigens of Toxocara canis larvae is produced. The proteins composition of these antigens is described. It is set that the immune reactivity of somatic antigen are proteins which have molecular weight is 30-32, 37, 46, 50, 70 and 110 kDa, and excretory-secretory antigen - proteins which molecular weight 47 and 70 kDa.
Стаття надшшла до редакцИ' 7.04.2010
229
