CC BY
0Научно - производственный журнал «Зернобобовые и крупяные культуры» № 4 (52) 2024 г. DOI: 10.24412/2309-348X-2024-4-5-12 УДК: 633.358:631.52
ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА СЕМЯН АБИССИНСКОГО
ГОРОХА
С.В. БОБКОВ, кандидат сельскохозяйственных наук, E-mail: [email protected], http://orcid.org/0000-0002-8146-0791
У.И. ОНУЧИНА, E-mail: [email protected], http://orcid.org/0009-0001-3829-4513
ФГБНУ ФНЦ ЗЕРНОБОБОВЫХ И КРУПЯНЫХ КУЛЬТУР
Аннотация. Изучено содержание белка и проведен электрофоретический анализ белков семян у образцов абиссинского гороха к-2759, к-9932 и сортов посевного гороха Гамбит и Ягуар. Образцы абиссинского гороха характеризовались высоким содержанием белка, наличием оригинальных изоформ легумина и высокой долей в белковом комплексе непроцессированного вицилина.
Ключевые слова: горох посевной, горох абиссинский, белок, запасной белок, конвицилин, вицилин, легумин.
Для цитирования: Бобков С.В., Онучина У.И. Характеристика белкового комплекса семян абиссинского гороха. Зернобобовые и крупяные культуры. 2024; 4(52):5-12. DOI: 10.24412/2309-348X-2024-4-5-12
CHARACTERISTICS OF PROTEIN COMPLEX OF ABYSSINIAN PEA SEEDS
S.V. Bobkov, U.I. Onuchina
FSBSI FEDERAL SCIENTIFIC CENTER OF LEGUMES AND GROAT CROPS
Abstract: Protein content and electrophoretic analysis of seed proteins of Abyssinian pea samples k-2759, k-9932 and field pea varieties Gambit and Jaguar were studied. Abyssinian pea samples were characterized by high protein content, the presence of original legumin isoforms and a high proportion of non-processed vicilin in the protein complex.
Keywords: field pea, Abyssinian pea, protein, spare protein, convicilin, vicilin, lehumin.
Введение
Успешная селекционная работа строится на использовании генетического разнообразия исходного материала. При этом, чем дальше эволюционное расстояние между посевным горохом и представителями других таксонов, тем выше полиморфизм вариантов генов, необходимый для успешного отбора растений с высокой семенной продуктивностью.
Представители различных таксонов рода гороха Pisum L. можно рассматривать в качестве потенциальных источников генов хозяйственно ценных признаков, ранее не вовлеченных в селекционный процесс. Гибридизация между представителями различных таксонов является мощным инструментом комбинирования генетического материала для успешного отбора. Молекулярные исследования выявили следы гибридизации между представителями различных таксонов (Weeden, 2018). Гибриды, полученные в результате отдаленных скрещиваний, могут обладать достаточным полиморфизмом вариантов генов для эффективного отбора на устойчивость к экстремальным условиям среды и патогенам, в конечном счете - на высокую семенную продуктивность.
Из литературных источников известно, что дикий вид красно-желтого гороха (Pisum fulvum Sibth. еt Smith.) является источником генов устойчивости к абиотическим стрессорам, аскохитозу, мучнистой росе, ржавчине, заразихе и гороховой зерновке, а также источником аллелей нетрадиционных изоформ запасных белков [1, 2, 3]. Внутривидовые таксоны гороха
(Pisum sativum L.): ssp. elatius, asiaticum, syriacum, transcaucasicum и abyssinicum (классификация Макашевой Р.Х., 1979) менее изучены, но также являются ценным источником генетических вариантов, влияющих на агрономические признаки [4, 5].
Абиссинский горох является обособленным таксоном неопределенного происхождения и не имеет диких форм [6, 7, 8]. По классификации Р.Х. Макашевой (1979) абиссинский горох является подвидом (abyssinicum) вида гороха Pisum sativum L. Она не указывала разновидностей, но по окраске оболочки семян выделила три подразновидности: subvar. abyssinicum (фиолетово-крапчатая окраска семян), subvar. vavilovianum (темнофиолетовая) и subvar. viridulogriseum (зеленовато-сероватая) (цит. по [5]). По общему габитусу абиссинский горох напоминает горох посевной, а отличается от гороха посевного зубчатыми листочками и глянцевой семенной оболочкой. Абиссинский горох культивируют в Йемене и Эфиопии вместе с горохом посевным (Pisum sativum L. ssp. sativum).
Абиссинский горох в сравнении с красно -желтым горохом исследован с меньшей интенсивностью. Однако он может представлять практический интерес для селекционеров благодаря своей скороспелости и устойчивости к бактериальной гнили, вызываемой Pseudomonas syringae pv. pisi (без специфичности к расе паразита) [6], а также в качестве компонента скрещиваний для увеличения генетического разнообразия гороха посевного, необходимого для увеличения эффективности отбора отдаленных гибридов на высокую семенную продуктивность. Исследование различий в белковом комплексе позволит определить направления использования абиссинского гороха в селекционном процессе.
Цель исследования - изучение содержания белка в семядолях абиссинского гороха, электрофоретического изучения компонентного состава запасных белков для поиска и использования в селекции на качество нетрадиционных изоформ запасных белков.
Материал и методика исследования Для электрофоретического анализа белков использовали семена образцов абиссинского гороха (Pisum sativum L. ssp. abyssinicum) к-2759 (рис. 1) и к-9932 коллекции ВИР, а также сорта гороха посевного (P. sativum L.ssp. sativum) Гамбит и Ягуар.
Рис. 1. А - взрослое растение (слева) образца к-2759 абиссинского гороха (Pisum sativum L. ssp. abyssinicum) коллекции ВИР в сравнении с растением посевного гороха сорта
Саламанка, Б - семена образца к-2759
Для получения муки семена сои, абиссинского и посевного гороха разрушали с помощью молотка, отделяли и удаляли семенные оболочки. Фрагменты семядолей растирали в муку с помощью фарфоровых ступки и пестика.
Содержание белка определяли в муке, полученной из изолированных семядолей, по методу Къельдаля с использованием дигестора DK 8 и аппарата ЦОК 152 производства Velp Scientifica (Италия). Коэффициент перевода общего азота в белок равнялся 6,25.
Белки для электрофоретического анализа экстрагировали из муки изолированных семядолей индивидуальных семян абиссинского и посевного гороха и сои сорта Ланцетная. Для установления различий между абиссинским и посевным горохом по компонентному составу белковых спектров дополнительно проводили экстракцию белков в смесях муки образцов (к-9932+к-2759) и сортов (Ягуар+Гамбит).
Для экстракции брали 2,7 мг муки индивидуальных семян и помещали в ячейки микро -титр планшетки. Экстракцию запасных белков проводили с использованием ТРИС-глицинового буфера (ТРИС, лицин, додецилсульфат натрия, рН=8,8) в течении 20 часов при температуре 4°С.
Десять микролитров экстракта смешивали с равным объемом буфера нанесения (ТРИС-НС1, глицерин, додецилсульфат натрия, Р-меркаптоэтанол, бромфеноловый синий). Затем 10 микролитров полученной смеси помещали в заполненные буфером ячейки 5% концентрирующего геля в камере для вертикального электрофореза "УЬ-4 (Хеликон, Россия). Разделение белков происходило в 12% геле.
Локализацию запасных белков конвицилина, непроцессированного вицилина и а-субъединицы легумина на электрофоретических пластинах оределяли с использованием набора маркеров с молекулярной массой 6,5-200 кДа (Sigma-Aldrich, США). Содержание указанных белков в компонентах электрофоретических спектров определяли денситометрическим методом. Нормализацию содержания а-субъединицы белка легумина проводили на общее содержание белка в электрофоретическом спектре. Статистическую обработку данных проводили с использованием описательных статистик и однофакторного дисперсионного анализа. Коррекцию статистической значимости на множественные сравнения средних проводили с использованием ЖО Тьюки.
Результаты исследований
Высокое содержание белка является важной характеристикой для использования в селекции на высокое качество зерна. Накопление белка, преимущественно, происходит в семядолях семян гороха. Признаки «толщина семенных оболочек» и «содержание белка в семядолях» контролируются различными генами. Поэтому информацию о содержании белка в семядолях гороха можно рассматривать как более ценную в сравнении с его содержанием в целом семени. Учитывая, что абиссинский горох, как и горох посевной характеризуется тонкими семенными оболочками [5, 8], полученные данные о различиях в содержании белка в семядолях можно экстраполировать на привычное содержание белка в целых семенах.
Дисперсионный анализ выявил существенные различия по содержанию белка в изолированных семядолях образцов абиссинского и сортов посевного гороха с выраженным размером эффекта ^(3,41)=14,633; р<0,001; ц2=0,517). В таблице 1 приведены данные о высоком в сравнении с сортами содержании белка в семядолях абиссинского гороха.
По содержанию белка в семядолях образец к-9932 существенно (р<0,001) превышал сорт Ягуар на 6,5%, а сорт Гамбит - на 5,8%. Образец к-2759 по содержанию белка статистически значимо превышал сорта Ягуар (р=0,003) и Гамбит (р=0,019) на 4,2% и 3,5% соответственно.
Проводили анализ компонентного состава белков как индивидуальных семян (изолированных семядолей) абиссинского и пасевного гороха, так и смеси муки образцов абиссинского гороха (к-9932+к-2759) и сортов посевного гороха (Ягуар+Гамбит). Применение смеси муки позволяет провести более тонкие различия между абиссинским и посевным горохом, не обращая внимания на полиморфизм между отдельными образцами и сортами.
Таблица 1
Содержание белка в семенах образцов абиссинского и сортов _посевного гороха, урожай семян 2023 г._
Образец, сорт Среднее содержание белка, % 95% доверительный интервал
нижняя граница верхняя граница
к-2759 30,5±0,8 28,8 32,1
к-9932 32,8±0,8 31,1 34,4
Ягуар 26,3±0,8 24,8 27,9
Гамбит 27,0±0,8 25,4 28,6
Существенные различия по содержанию белка
Сравниваемые пары Разница в содержании белка, % p-value
к-9932 минус Ягуар +6,5 <0,001
к-9932 минус Гамбит +5,8 <0,001
к-2759 минус Ягуар +4,2 0,003
к-9932 минус Гамбит +3,5 0,019
Электрофоретический анализ белков семян смеси муки абиссинского и посевного гороха выявил 39 позиций размещения компонентов, среди них 13 (33,3%) были полиморфными, 7 (17,9%) по наличию-отсутствию и 6 (15,4%) по интенсивности окрашивания (рис. 2).
/Г «Г У
г'
* V V
^ > л* л* у ¿> V» >> * * У У у л'
^ -V ^ ^ ^ </ <»■» с?
/
1 2 3 4 5
Г 8 9 10 11 12 1Э 14 15 1С 1Г 1« 19
ИТ 1 1 I III 1 1 ¡1 1 II 11 1 1 III 1 1 П 1
щцр ** -вР
ЧР —• __ —
Рис. 2. Электрофоретические спектры белков семян абиссинского и посевного гороха.
На первой дорожке приведена нумерацияреперных компонентов спектра сои (сорт Ланцетная). Цифрой 1 на электрофоретическом геле обозначены изоформы
а-субъединицы легумина
В электрофоретическом спектре из смеси белков 2 образцов абиссинского гороха (спектр 9) в области 16 позиции по шкале соевого спектра (рис. 2) обнаружены 2 белковых компонента, нижний компонент образца к-9932, а верхний - образца к-2759. Наличие двух компонентов свидетельствовало о наличии полиморфизма по изоформам конвицилина у образцов абиссинского гороха. При этом, у сортов Ягуар и Гамбит полиморфизм по изоформам конвицилина не наблюдался.
В области 32 компонента соевой шкалы (рис. 2) у абиссинского и посевного гороха локализованы белковые компоненты непроцессированного вицилина. У абиссинского гороха компоненты конвицилина были более компактными и содержали больше белка в сравнении с компонентами посевного гороха.
В области 43 компонента по соевой шкале располагались компоненты а-субъединицы легумина. В электрофоретических спектрах посевного гороха явно присутствовали 2 изоформы указанного белка, как у индивидуальных семян, так и в смешанном образце (рис. 2, спектр 10). Спектры а-субъединицы легумина каждого из образцов абиссинского гороха состояли из одного компонента. Возможно, в компонентах присутствовало более 2 белков, но из-за высокой наполненности компонентов белком их нельзя было дифференцировать. Электрофоретический анализ индивидуальных семян показал, что в образцах абиссинского гороха к-9932 и к-2759 присутствовали различные изоформы а-субъединицы легумина. Соответственно, в спектре смешанного образца (рис. 2, спектр 9) абиссинского гороха (к-9932+к-2759) присутствовали 2 компонента а-субъединицы легумина, верхний образца к-2759 и нижний образца к-9932 (рис. 2). Присутствие в спектрах посевного гороха 2 изоформ а-субъединицы легумина является индикатором экспрессии 2 различных генов, кодирующих запасной белок легумин. Следует обратить внимание, что в спектре номер 13 сорта Ягуар присутствовал только 1 компонент (изоформа) а-субъединицы легумина.
Использование шкалы маркеров 94,7; 66, 55 и 45 кДа из стандартного набора Sigma-Aldrich позволило определить молекулярную массу компонентов (изоформ) а-субъединицы легумина в спектрах из смешанных белков семян образцов к-9932, к-2759 (на рисунке 2 обозначен как Abyss pooled) и сортов Ягуар и Гамбит (Sativum pooled) (табл. 2).
Таблица 2
Молекулярная масса изоформ а-субъединицы легумина у абиссинского и посевного
гороха, кДа
Компонент а-субъединицы легумина в спектре 9 Номер дорожки электрофоретического спектра на рис. 1 Компонент а-субъединицы легумина в спектре 10
9 (к-9932+к-2759) 10 (Ягуар+Гамбит)
48,9 1
1 47,2 46,7 2
2 45,6
Результаты анализа показали, что в смешанном спектре абиссинского гороха присутствовали 2 изоформы указанного белка с молекулярными массами 47,2 и 45,6 кДа Изоформа с молекулярной массой 47,2 кДа принадлежала образцу к-2759, а изоформа 45,6 кДа - образцу к-9932. В смешанном образце и, соответственно, в белках индивидуальных семян посевного гороха присутствовали 2 изоформы а-субъединицы легумина с молекулярными массами 48,9 и 46,7 кДа. При этом одно из семян сорта Ягуар (рис. 2, спектр 13) содержало 1 изоформу а-субъединицы легумина с молекулярной массой 46,7 кДа. Следует обратить внимание, что изоформа а-субъединицы легумина образца к-2759 и нижняя изоформа сортов Ягуар и Гамбит имели близкую молекулярную массу 47,2 кДа и 46,7 кДа, что может указывать на гомологию локусов, кодирующих указанный белок.
Основными запасными белками гороха являются конвицилин, вицилин и легумин [9]. Конвицилин не подвергается посттрансляционному процессингу, вицилин может быть процессированным и непроцессированным, а молекула легумина разделяется на две субъединицы, а и р. Для определения соотношения запасных белков в семенах гороха выбрали конвицилин, непроцессированный вицилин и а-субъединицу легумина, находящихся в компонентах с наиболее интенсивными компонентами электрофоретических спектров (рис. 2). На рисунке 2 компоненты конвицилина гороха располагались напротив 16 компонентов
спектра сои, компоненты непроцессированного вицилиан в районе 32, а компоненты а-субъединицы легумина - напротив 43 компонента сои.
Результаты анализа показали, что сорта посевного и образцы абиссинского гороха различались между собой по доле запасных наиболее многочисленных запасных белков: конвицилина, непроцессированного вицилина и а-субъединицы легумина (рис. 3).
Рис. 3. Доля наиболее многочисленных запасных белков в семенах сортов посевного и
образцов абиссинского гороха
Процентная доля конвицилина от суммарного содержания конвицилина, непроцессированого вицилина и а-субъединицы легумина варьировала от 31,3% (к-2759) до 43,9% (Ягуар). Доля непроцессированного вицилина изменялась от 21,0 % (Ягуар) до 38,0% (Гамбит), а доля и а-субъединицы легумина - от 32,6 (к-2759) до 38, 0% (Гамбит) (табл. 3).
Таблица 3
Процентная доля белка в наборе из трех запасных белков: конвицилина,
непроцессированного вицилина и а-субъединицы легумина
Образец, сорт Доля белка, % 95% доверительный интервал
нижняя граница верхняя граница
Конвицилин
к-2759 31,3±3,7 23,740 38,781
к-9932 33,4±3,7 25,871 40,911
Ягуар 43,9±2,9 38,024 49,675
Гамбит 35,4±3,7 27,907 42,948
Непроцессированный вицилин
к-2759 36,2±3,7 28,668 43,709
к-9932 33,2±3,7 25,660 40,701
Ягуар 21,0±2,9 15,213 26,864
Гамбит 26,5±3,7 19,018 34,059
а-субъединица легумина
к-2759 32,6±3,7 25,031 40,072
к-9932 33,4±3,7 25,908 40,949
Ягуар 35,1±2,9 29,286 40,937
Гамбит 38,0±3,7 30,513 45,554
Существенные различия по доле белка
Сравниваемые пары Разница в доле белка, % НЕБ Тьюки, р-уа1ие
Непроцессированный вицилин
к-2759 минус Ягуар 15,2 0,027
к-9932 минус Ягуар 12,2 0,043
к-9932 минус Гамбит 6,7 0,045
Научно - производственный журнал «Зернобобовые и крупяные культуры» № 4 (52) 2024 г.
Дисперсионный анализ не выявил существенных различий по доле конвицилина в наборе из 3 основных белков (F(3,10)=3,49; p=0,058; д2=0,511). По процентной доле конвицилина сорт Ягуар значительно, но статистически не значимо превышал образцы к-2759, к-9932 и сорт Гамбит на 12,6%; 10,5% и 8,4% (HSD Тьюки, p=0,068; 0,145 и 0,282 соответственно).
По доле непроцессированного вицилина дисперсионный анализ выявил существенные разлития между сортами и образцами гороха (F(3,10)=9,5; p=0,016; ^2=0,704). Доля непроцессированного вицилина у образца абиссинского гороха к-2759 существенно (на 15,1%) превышала долю указанного белка у сорта Ягуар, а образец к-9932 по доле непроцессированного вицилина существенно превышал сорта гороха посевного Ягуар и Гамбит на 12,1 и 6,6% соответственно (табл. 3).
Дисперсионный анализ не вывил существенных различий между сортами и образцами абиссинского гороха по процентной доле а-субъединицы легумина (F(3,10)=0,276; p=0,841; ц2=0,0,077).
Заключение
Изучено содержание белка и проведен электрофоретический анализ белков семян у образцов абиссинского гороха к-2759, к-9932 и сортов посевного гороха Гамбит и Ягуар. Образцы абиссинского гороха по содержанию белка в семядолях существенно превышали сорта на 3,5-6,5 %. Электрофоретический анализ выявил у абиссинского гороха к-9932 и к-2759 отличные от посевного гороха изоформы а-субъединицы легумина. Образцы абиссинского гороха существенно не отличаются от посевного гороха по процентной доле легумина, но характеризуются существенно более высокой долей непроцессированного вицилина.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования в рамках Государственного задания ФГБНУ ФНЦ ЗБК по разделу FGZZ-2022-0003 "Физиолого-биохимическое изучение генетических ресурсов зернобобовых и крупяных культур для использования в селекционном процессе".
Литература
1. Fondevilla S, Torres AM, Moreno MT, Rubiales D. Identification of a new gene for resistance to powder mildew in Pisum fulvum a wild relative of pea. Breed sci. 2007;57(2):181-184. https://doi.org/10.1270/jsbbs.57.181
2. Barilli E, Satovic Z, Rubiales D, Torres A. Mapping of quantitative trait loci Controlling partial resistance against rust incited by uromyces pisi (Pers.) Wint. in a Pisum fulvum L. intraspecific cross. Euphytica. 2010. 175(2):151-159. https://doi.org/10.1007/s10681-010-0141-z
3. Бобков С.В., Бычков И.А., Селихова Т.Н., Семенова Е.В., Вишнякова М.А. Анализ интрогрессивных линий межвидовых гибридов гороха по компонентному составу белков семян // Экологическая генетика. - 2020. - Т. 18. - № 1. - С. 79-88. https://doi.org/10.17816/e
4. Hollaway G.J., Bretag T.W., Price T.V. The epidemiology and management of bacterial blight (Pseudomonas syringae pv. pisi) of field pea Pisum sativum) in Australia: a review. Aust. J. Agric. Res. 2007. 58:86-1099. http://dx.doi.org/10.1071/AR06384
5. Костерин О.Э. Горох абиссинский (Lathyrus schaeferi Kosterin nom. nov. pro Pisum abyssinicum A. Br.) - проблематичный таксон // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2017;21(2):158-169 DOI 10.18699/VJ17.234
6. Бобков С.В., Башкирова К.А. Содержание фотосинтетических пигментов в различных органах растений дикого и культурного гороха // Зернобобовые и крупяные культуры. - 2021. - № 4 (40). - С. 15-23.
7. Weeden, N. F. (2018). Domestication of Pea (Pisum sativum L.): The Case of the Abyssinian Pea. Frontiers in Plant Science, 9. https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00515
8. O'Kane, F.E., Happe, R.P., Vereijken, J. M., Gruppen, H., & Van Boekel M.A.J.S. (2004) Characterization of pea vicilin. 2. Consequences of compositional heterogeneity on heat-induced gelation behavior. J. Agric. Food Chem., 52, 3149-3154.
9. Tzitzikas E.N., Vincken J.P., Groot J., Gruppen H., & Visser R.G. (2006) Genetic variation in pea seed composition. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 425-433.
References
1. Fondevilla S, Torres AM, Moreno MT, Rubiales D. Identification of a new gene for resistance to powder mildew in Pisum fulvum a wild relative of pea. Breed sci. 2007;57(2):181-184. https://doi.org/10.1270/jsbbs.57.181
2. Barilli E., Satovic Z., Rubiales D., Torres A. Mapping of quantitative trait loci controlling partial resistance against rust incited by uromyces pisi (Pers.) Wint. in a Pisum fulvum L. intraspecific cross. Euphytica. 2010;175(2):151-159. https://doi.org/10.1007/s10681-010-0141-z
3. Bobkov S.V., Bychkov I.A., Selikhova T.N., Semenova E.V., Vishnyakova M.A. Analysis of introgressive lines of interspecific pea hybrids on the component composition of seed proteins. Ekologicheskaya genetika. 2020, Vol. 18, no 1, pp. 79-88. https://doi.org/10.17816/e
4. Hollaway G.J., Bretag T.W., Price T.V. The epidemiology and management of bacterial blight (Pseudomonas syringae pv. pisi) of field pea Pisum sativum) in Australia: a review. Aust. J. Agric. Res. 2007;58:86-1099. http://dx.doi.org/10.1071/AR06384
5. Kosterin O.E. Abyssinian pea (Lathyrus schaeferi Kosterin nom. nov. pro Pisum abyssinicum A. Br.) is a problematic taxon. Vavilovskii zhurnal genetiki i selektsii. 2017;21(2):158-169 DOI 10.18699/VJ17.234 (In Russian)
6. Bobkov S.V., Bashkirova K.A. Photosynthetic pigment content in different organs of wild and cultivated pea plants. Zernobobovye i krupyanye kul'tury. 2021, no. 4 (40), pp. 15-23. (In Russian)
7. Weeden N. F. (2018). Domestication of Pea (Pisum sativum L.): The Case of the Abyssinian Pea. Frontiers in Plant Science, 9. https://doi.org/10.3389/fpls.2018.00515
8. O'Kane F.E., Happe R.P., Vereijken J. M., Gruppen H., & Van Boekel M.A.J.S. (2004) Characterization of pea vicilin. 2. Consequences of compositional heterogeneity on heat-induced gelation behavior. J. Agric. Food Chem., 52, 3149-3154.
9. Tzitzikas E.N., Vincken J.P., Groot J., Gruppen H., & Visser R.G. (2006) Genetic variation in pea seed composition. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 425-433.
