CC BY
25
Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 13, No. 4, 2017, pp. 74-80 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2017 by Axenov-Gribanov, Protasov, Voytsekhovskaya, Shatilina, Rzhechitskiy, Dimova, Kostka, Lubyaga and Timofeyev
OPEN ACCESS
ORIGINAL ARTICLE
Haemolymph of Cold-Adapted Baikal Endemic Amphipods as a Promising Source for Screening of
Novel Natural Products
Axenov-Gribanov D.V. 12*, Protasov E.S. 1, Voytsekhovskaya I.V. 1, Shatilina Z.M. 12, Rzhechitskiy Y.A. 1, Dimova M.D. 1, Kostka D.V. 1, Lubyaga Y.A. 12, Timofeyev M.A. 1
11nstitute of Biology at Irkutsk State University, Irkutsk, 3 Lenin str., Russia
2 Baikal Research Centre, Irkutsk, 21 Lenin str., Russia
*E-Mail: denis.axengri@gmail.com
Received September 2, 2017
The aim of this study was to assess the possibility to use Baikal endemic amphipods as a source for screening of novel natural products. Analysis of amphipod's E. verrucosus hemolymph by HPLC-MS was performed for the first time. A number of natural products with new molecular mass for Baikal endemic macroinvertebrates were found. We found a compound as chrysin by comparison of MS1, MS2 profiles and molecular mass of natural products registered in Dictionary of Natural Products and MZ-cloud databases. Also, we found new compound with mass 493.80277 Da, circulating in the amphipod's hemolymph.
Key words: amphipoda, hemolymph, dereplication, Baikal, natural products
В последние годы возросла потребность общества в новых лекарственных препаратах. Среди ключевых причин необходимости разработки новых препаратов — стремительный рост множественной резистентности микроорганизмов к ранее разработанным и внедренным в медицинскую практику антибиотикам (Jenke-Kodama, Dittman, 2009). Стоит отметить, что проблема антибиотикорезистентности микроорганизмов
является одной из важнейших в современной фармацевтике и биомедицине (Laxminarayan et al., 2013). Существует ряд причин развития антибиотикоустойчивости микроорганизмов, которые сводятся к адаптациям генетического аппарата микроорганизмов, происходящим вследствие бесконтрольного применения антибиотиков и лекарственных препаратов (Blair et al., 2015).
В связи с этим, были сформированы ряд глобальных трендов, направленных на ограничение распространения антибиотикорезистентности
микроорганизмов (Stadler, Dersch, 2017). Для решения данной задачи требуется комплексный и мультидисциплинарный подход, в т.ч.: (1) профилактика и контроль инфекций, вызванных антибиотикорезистентными патогенами; (2) развитие новых лекарственных препаратов; (3) модификация и усовершенствование современных и новых антибиотиков (Stadler, Dersch, 2017).
Одной из основных задач является разработка новых лекарственных соединений на основе новых источников и биологических ресурсов. Одним из таких уникальных биологических ресурсов выступает экосистема озера Байкал и его обитатели. Байкал представляет собой одну из самых необычных экосистем планеты, как со стороны структурной сложности, эндемизма и таксономического разнообразия населяющей его фауны, так и стороны специфичного (подчас экстремального) характера условий среды, в которых вынуждены обитать представители фауны озера. По своему возрасту (25-30 млн. лет) Байкал существенно отличается от большинства других водоемов, существование которых ограничено не более чем несколькими десятками тысяч лет (Berkin et al., 2009). Фауна
Байкала чрезвычайно разнообразна и широко представлена большим количеством форм и видов. По последним данным, в Байкале описано 2638 видов и подвидов животных (Rusinek et al., 2012). Большинство обитателей озера Байкал эндемики, обладающие специализированными экофизиоло-гическими характеристиками и адаптированные к обитанию в экстремальных условиях: холодной, низкоминерализованной и насыщенной (зачастую перенасыщенной) кислородом среде
(Kozhova, Izmest'eva, 1998; Rusinek et al., 2012).
Всю толщу Байкала - от уреза воды до максимальных глубин - населяют эндемичные (в том числе экстремофильные) организмы, формирующие в зонах каждой из глубин свои уникальные сообщества. Доминантными обитателями Байкала, как по составу, так и по численности видов, являются сообщества многочисленных бентосных макробеспозвоночных, в частности - амфипод (Amphipoda, Crustacea).
В то же время, работ, направленных на оценку состава специфических природных соединений, синтезируемых эндемичными амфиподами озера Байкал или входящими в состав их гемолимфы, проведено не было.
MATERIALS AND METHODS
Объектом настоящего исследования были выбраны байкальские эндемичные амфиподы вида Eulimnogammarus verrucosus (Gerstf., 1858). Для исследования использовали взрослых особей, которых вылавливали в литоральной зоне озера Байкал (0-1,5 м) в районе пос. Листвянка с использованием гидробиологического сачка.
Данный вид является одним из самых широко распространенных в Байкале и является типичным обитателем литорали, встречается повсеместно под камнями, начиная с глубины в несколько сантиметров до 10-15 м. E. verrucosus является фитофагом и имеет зимний период размножения (Bazikalova, 1945).
В рамках данного исследования у амфипод проводили отбор гемолимфы с применением скарификаторов и микрокапилляров. Полученные
образцы гемолимфы смешивали с метанолом в соотношении 1:5. Образцы центрифугировали в течение 3 минут при 14 000 rpm. Далее полученный экстракт анализировали с применением подходов высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе Ultimate 3000 (Dionex), сопряженном с масс-спектрометром высокого разрешения LTQ Orbitrap (Thermo Fisher Scientific). Для разделения применяли линейный градиент растворителей (вода : ацетонитрил) от 5% до 95% в течение 18 минут на колонке Acquity UPLC BEH C18, 130Ä, 1.7 цт, 2.1 mm X 100 mm. Детекцию масс в диапазоне 160-2500 Да проводили при положительной ионизации. Поиск и идентификацию соединений проводили с применением базы данных Dictionary of natural products (CRC-press) и базы данных масс-спектров MS2 M/Z-Cloud с точностью до 5 ppm и применением алгоритма HighChem HighRes. Для идентификации соединений в качестве источника выделения природных метаболитов указывали источник «ракообразные» и/или «гемолимфа». Анализ каждого образца проведен трехкратно.
RESULTS AND DISCUSSION
Хроматограмма масс соединений, обнаруженных в гемолимфе амфипод E. verrucosus представлена на рис. 1.
Согласно материалам, полученным в ходе проводимых работ, в гемолимфе амфипод обнаружено 25 основных пиков (соединений). При этом 10 пиков характеризовались массой, превышающей 2500Да.
В табл. 1 приведены массы обнаруженных пиков (соединений) и их основные аддукты. Так, согласно крупнейшей базе данных природных соединения -Dictionary of Natural products, объединяющей информацию по более чем 250 000 природных соединений, установлено, что 14 из найденных нами соединений ранее не были обнаружены в ракообразных или гемолимфе иных организмов. Кроме того, выявлено, что в гемолимфе амфипод вида E. verrucosus присутствует один пик (соединение), характеризующийся новой массой -493.80277 Да. Данная масса не зарегистрирована в базе данных Dictionary of natural products.
Природные соединения, выделенные из макробеспозвоночных, зачастую обладают множественной биологической активностью. Так, из краба Hyas araneus был выделен пептид, состоящий из 37 аминокислот - Аразин 1, который обладает антимикробным действием (Stensvag et al., 2008). Другим примером пептидов с биологической активностью, являются соединения семейства панеидины (panaeidins), выделенные ранее из гемолимфы креветок Litopenaeus vannamei и Penaeus setiferus, обладающие как антибактериальной, так и противогрибковой активностью (Destoumieux et al., 1997, 2000), а также нейропептиды пенеустатины (penaeustatins), выделенные из Panaeus monodon (Kwok et al., 2006).
Помимо антагонистических эффектов, у ракообразных были обнаружены соединения, обладающие биолюминесцентными свойствами, например - Ципридина билюциферол ^ypridina biluciferol), выделенный из остракод Cypridina sp. Также, были выделены иммуно- и нейромодуляторы Val(1)-SIF амид и SDRNFLRF амид из лобстера Homarus americanus (Christie et al., 2006; Weimann et al, 1993).
В настоящее время в базе данных Dictionary of Natural products зарегистрировано всего 178 соединений, выделенных из различных ракообразных. При этом лишь одно соединение -Эхиненон - Echinenone, 3',4'-Дегидро-р,р-каротин-4-ол. 3',4'-Дегидро-4-гидрокси-р-каротин (MM 550.866) -было выделено из байкальского эндемичного вида амфипод Pallasea cancelloides (Czeczuga, 1980).
Оценивая схожесть MS1 и MS2 профилей соединений, указанных в табл. 1 и 2, и массу соединения (с аддуктами), было предварительно установлено, что в гемолимфе байкальских эндемичных амфипод E. verrucosus может присутствовать соединение Хризин (chrysin, 5,7-Dihydroxyflavone). Стоит отметить, что ранее данное соединение было обнаружено в цветах растений Passiflora incarnata, Oroxylum indicum, грибах Pleurotus ostreatus и сотах пчел. Данное природное соединение обладает выраженной противогрибковой активностью, подавляет рост бактерий Pseudomonas
2001). Вероятно, присутствие хризина у
исследованного нами E. verrucosus можно объяснить поступлением его вместе с растительной пищей, так как данные амфиподы являются фитофагами.
aeruginosa и Ralstonia solanacearum. Кроме того, хризин является вазорелаксантом (Duarte et al.,
Figure 1. Хроматограмма масс соединений, обнаруженных в гемолимфе амфипод вида E. verrucosus.
Table 1. Массы природных соединений и их аддукты, обнаруженные в экстракте гемолимфы вида E. verrucosus.
N Время удержания, мин. Macca, Дa Обнаруженные аддукты
1 6.82 254.14859 [M+NH4]
2 8.87 482.34409 [M+Na], [M+NH4]
3 9.79 540.38614 [M+Na], [M+NH4]
4 10.55 598.4278 [M+Na], [M+NH4]
5 10.84 414.20301 [M+Na], [M+NH4]
6 11.32 656.47037 [M+Na], [M+NH4]
7 12.79 334.2711 [M+Na]
8 13.77 504.32578 [M+NH4]
9 15.06 399.37009 [M+NH4]
10 16.3 330.27613 [M+Na], [M+NH4]
11 16.79 493.80277 [M+NH4]
12 17.84 358.30707 [M+Na], [M+NH4]
13 18.09 662.4455 [M+Na]
14 18.77 320.30698 [M+NH4]
Table 2. Число возможных природных соединений, обнаруженных в экстракте гемолимфы вида E. verrucosus.
N Macca, Дa Число возможных соединений, выделенных из растений, бактерий и / или грибов Число возможных соединений, выделенных из ракообразных
1 254.14859 ± 10ppm 110 0
2 482.34409 ± 10ppm 100 0
3 540.38614 ± 10ppm 11 0
4 598.4278 ± 10ppm 17 0
5 414.20301 ± 10ppm 145 0
6 656.47037 ± 10ppm 2 0
7 334.2711 ± 10ppm 27 0
8 504.32578 ± 10ppm 420 0
9 399.37009 ± 10ppm 18 0
10 330.27613 ± 10ppm 34 0
11 493.80277 ± 10ppm 0 0
12 358.30707 ± 10ppm 59 0
13 662.4455 ± 10ppm 17 0
14 320.30698 ± 10ppm 2 0
Figure 2. Структурная формула, MS1 и MS2 профили соединения хризин.
Таким образом, в ходе проведённых работ мы
Работа выполнена в рамках Госзадания №
6.9654.2017/8.9, а также при частичной финансовой
поддержке проектов РФФИ № 16-34-00686, 16-3400687, 16-34-60060, РНФ № 17-14-01063 и ФГБОУ
ВО «ИГУ».
REFERENCES
Axenov-Gribanov D., Bedulina D., Shatilina Z., Jakob L., Vereshchagina K., Lubyaga Y., Gurkov A., Shchapova E., Luckenbach T., Lucassen M., Sartoris F. J., Pörtner H.-O., Timofeyev M. (2016) Thermal preference ranges correlate with stable signals of universal stress markers in Lake Baikal endemic and Holarctic amphipods. PloS one, 11(10), e0164226.
Bazikalova A.Y. (1945) The amphipods of Lake Baikal. Proc Baikal Limnological Station 11:1-440. - (in Russian)
Bedulina D., Meyer M. F., Gurkov A., Kondratjeva E., Baduev B., Gusdorf R., Timofeyev M. A. (2017) Intersexual differences of heat shock response between two amphipods (Eulimnogammarus verrucosus and Eulimnogammarus cyaneus) in Lake Baikal. PeerJ, 5, e2864.
Berkin N.S., Makarov A.A., and Rusinek O.T. (2009) Bajkalovedenie. - (in Russian)
Blair J. M., Webber M. A., Baylay A. J., Ogbolu D. O., Piddock L. J. (2015) Molecular mechanisms of antibiotic resistance. Nature reviews. Microbiol, 13(1), 42.
Christie A.E., Stemmler E.A., Peguero B., Messinger D.I., Provencher H. L., Scheerlinck P., Hsu Y.-W.A., Guiney M.E., de la Iglesia H.O., Dickinson P. S. (2006) Identification, physiological actions, and distribution of VYRKPPFNGSIFamide (Val1-SIFamide) in the stomatogastric nervous system of the American lobster Homarus americanus. J Comp
Neurol, 496(3), 406-421.
Czeczuga B. (1980) Changes occurring during the annual cycle in the carotenoid content of Gammarus lacustris G.O. Sars (Crustacea: Amphipoda) specimens from the river Narew. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 66(4), 569-572.
Destoumieux D., Bulet P., Loew D., Van Dorsselaer A., Rodriguez J., Bachére E. (1997) Penaeidins, a new family of antimicrobial peptides isolated from the shrimp Penaeus vannamei (Decapoda). J Biol Chem, 272(45), 28398-28406.
Destoumieux D., Munoz M., Bulet P., Bachere E. (2000) Penaeidins, a family of antimicrobial peptides from penaeid shrimp (Crustacea, Decapoda). Cell mol life sci, 57(8-9), 1260-1271.
Duarte J., Jiménez R., Villar I. C., Pérez-Vizcaíno F., Jiménez J., Tamargo J. (2001) Vasorelaxant effects of the bioflavonoid chrysin in isolated rat aorta. Planta med, 67(06), 567-569.
Gerstfeldt G. (1858) Über einige zum Theil neue Arten Platoden, Anneliden, Myriapoden und Crustaceen Sibiriens, namentlich seines östlichen Theiles und des Amur-Gebietes. Buchdruckerei der Kaiserlichen Akademie der Wissenschaften.
Jakob L., Axenov-Gribanov D.V., Gurkov A. N., Ginzburg M., Bedulina D.S., Timofeyev M.A., Luckenbach T., Lucassen M., Sartoris F.J., Pörtner H.O. (2016) Lake Baikal amphipods under climate change: thermal constraints and ecological consequences. Ecosphere, 7(3), e01308.
Jeffery N.W., Yampolsky L., Gregory T.R. (2016) Nuclear DNA content correlates with depth, body size, and diversification rate in amphipod crustaceans from ancient Lake Baikal, Russia. Genome, 60(4), 303309.
Jenke-Kodama H., and Dittmann E. (2009) Bioinformatic perspectives on NRPS/PKS megasynthases: advances and challenges. Nat prod rep, 26(7), 874883.
Kozhova O.M, and Izmest'eva L.R. (1998) Lake Baikal — evolution and biodiversity. Leiden: Backhuys.
Kwok R., Chan S.M., Tobe S. S. (2006) Crustacean
показали, что фауна ракообразных озера Байкал является уникальной и неисследованной с точки зрения альтернативных источников поиска новых природных соединений.
ACKNOWLEDGEM ENT
bioactive peptides. Handbook of Biologically Active Peptides, 221-228.
Laxminarayan R., Duse A., Wattal C., Zaidi A. K., Wertheim H.F., Sumpradit N., Greko C. (2013) Antibiotic resistance — the need for global solutions. Lancet infect dis, 13(12), 1057-1098.
Rusinek O.T., Takhteev V.V., Gladkochub D.P., Khodzher T.V., Budnev N.M., editors. (2012) Baicalogy. Novosibirsk: Nauka. - (in Russian)
Stadler M., and Dersch P. (2017) How to overcome the antibiotic crisis. Springer international.
Stensvag K., Haug T., Sperstad S. V., Rekdal 0., Indrevoll B., Styrvold O. B. (2008) Arasin 1, a proline-arginine-rich antimicrobial peptide isolated
from the spider crab, Hyas araneus. Dev Com Immunol, 32(3), 275-285.
Timofeyev M.A. (2016) Monitoring: safeguarding the world's largest lake. Nature, 538(7623), 41.
Timoshkin O.A. (2001) Lake Baikal: fauna diversity, problems of its "immiscibility" and origin, ecology and "exotic" communities. In: Timoshkin O.A., editor. Index of animal species inhabiting Lake Baikal and its catchment area. Novosibirsk: Nauka Publishers.
Weimann J.M., Marder E., Evans B.R.U.C.E., Calabrese R. L. (1993) The effects of SDRNFLRFamide and TNRNFLRFamide on the motor patterns of the stomatogastric ganglion of the crab Cancer borealis. J Exp Biol, 181(1), 1-26.
