Гуминовые вещества - фактор защиты биосистем от экотоксикантов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

615.838.7+577.11

ГУМИНОВЫЕ ВЕЩЕСТВА - ФАКТОР ЗАЩИТЫ БИОСИСТЕМ ОТ ЭКОТОКСИКАНТОВ

© 2009 Н.П. Аввакумова Самарский государственный медицинский университет

Изучена зависимость протекторных свойств в ряду гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей от их структурно-функциональных свойств. Установлено, что гумусовые кислоты выполняют уникальную функцию по поддержанию постоянства состава на макро и микроуровнях. Установлено, что гумусовые кислоты сохраняют экологическое равновесие в микро- и макробиосистемах.

Ключевые слова: гуминовые вещества, сульфидные грязи, экологическое равновесие

В последние годы исследователей различных областей науки все больше привлекают гуминовые вещества в связи с тем, что они, являясь природными соединениями, обладают широким биологическим спектром действия. Гумификация, как сложное биохимическое постмортальное изменение растительных и животных организмов, предохраняющее органические вещества от полной минерализации, является планетарным процессом. Гуминовые вещества присутствуют во всех природных средах планеты: воде, почве, горных породах, иловых отложениях, образуя жизненный фон человечества [1]. С ростом мирового производства увеличивается количество химических веществ, мигрирующих через атмосферу и гидросферу планеты, а в связи с этим все большее значение приобретает протекторная биосферная функция гуминовых веществ, которые практически необратимо поглощают многие токсиканты антропогенного происхождения, детоксицируя почвы, растения [2] и животные организмы [3]. В настоящее время доказано участие гуминовых веществ в детоксикации пестицидов, тяжелых металлов, радионуклидов [4, 5].

Цель исследования: изучить зависимость протекторных свойств в ряду гумино-вых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей от их структурно-фунциональных свойств.

Аввакумова Надежда Петровна, доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой общей, бионеорганической и биоорганической химии. E-mail: navvak@yandex.ru

Результаты исследования. Изучение гуминовых веществ пелоидов озер санатория «Сергиевские минеральные воды» выявило практически одинаковое их содержание по сезонам года и месторождениям, которое составляет 83,78% - 89,07% от общего органического вещества. Содержание гуминовых веществ находится в обратной зависимости от минерализации грязевого раствора. Исследуемые пелоиды характеризуются значительной степенью биогеотрансформации, высоким содержанием гуминовых кислот (СГК/СФК>2,0), высокой подвижностью (Сгу-

мина<20%).

Гуминовые кислоты и гумин проявляют себя своеобразным буфером в виде малодоступных устойчивых специфических органических веществ, поддерживающих стационарное состояние открытой термодинамической системы: неспецифические органические вещества ^ фульвокислоты ^ гиматомелановые кислоты ^ гуминовые кислоты ^ гумин. Степень смещения равновесия в этой сложной системе есть функция активности микрофлоры, климатических и гидрогеохимических условий.

В рамках полученных данных можно предположить, что распределение компонентов гуминовых веществ является итоговым показателем жизнедеятельности системы микроорганизмов, в которой продукт метаболизма одних представителей биоты служит источником пластического и энергетического материала для других. При этом наиболее подвижные группы гуминовых веществ - гиматомелановые и фульвокислоты - отличаются устойчивым количественным

постоянством и служат критерием жизнеспособности данной системы. Количество гумина находится в обратной зависимости от составляющих гумусовых кислот. Этот устойчивый малоактивный материал можно рассматривать как систему конечных продуктов биогеосинтеза, формой депонирования специфических органических веществ.

Многопрофильность функциональных групп обусловливает активное участие гу-миновых веществ в глобальных биогеохимических процессах при современной экологической напряженности. Нами установлена высокая комплексообразовательная способность гуминовых веществ пелоидов, возрастающая в ряду: фульвокислоты, гиматоме-лановые, гуминовые кислоты. Определена высокая корреляция между токсичностью металла и степенью его иммобилизации гумусовыми кислотами. Экспериментально установлено, что гидрофильные фракции гумусовых кислот обусловливают миграцию катионов, а гидрофобные компоненты способствуют связыванию металлов. Устойчивость образующихся соединений определяется содержанием азот- и кислородсодержащих функциональных групп, выраженностью системы сопряжения, величинами молекулярных масс, характером конфигурации и конформации макромолекул. Совокупность перечисленных факторов определяет приближенное подчинение известным законам химии комплексных и высокомолекулярных соединений. При этом ярко выражена корреляция между степенью биотичности ионов и их способностью к миграции в составе гумусовых кислот. Возникает уникальная картина природной избирательности ионов-биогенов и экотоксикантов. Особый интерес вызывает не только способность гу-миновых веществ удалять из организма различные экотоксиканты, но и возможность вводить в организм необходимые металлы-биогены в легкодоступной комплексной форме, что позволяет рассматривать их в качестве биологически активной добавки к пище и лекарственных препаратов. Отсутствие в организме специфических ферментов, разлагающих гумусовые кислоты, делает их устойчивыми, способными к пролонгированному действию.

С целью изучения природы гуминовых веществ нами получены инфракрасные спектры, анализ которых позволяет с достаточной определенностью выявить как общие

свойства всех представителей групп специфических органических веществ пелоидов, так и отличительные стороны. Все гумино-вые вещества имеют однотипный спектр в области 3600-600 см-1. Однако, несмотря на сходный характер ИК-спектров, четко просматриваются и закономерные различия. Фульвокислоты имеют максимальную интенсивность полос в области поглощения спиртовых гидроксилов и простых эфиров. Группа гиматомелановых кислот характеризуется наибольшей насыщенностью метиль-ными группами. Интенсивность полосы поглощения 1620-1600 см-1, характеризующая ароматическую структуру, возрастает в ряду: фульвокислоты, гиматомелановые кислоты, гуминовые кислоты.

При исследовании экопротекторной гуминовых веществ важной является информация о кислотно-основных свойствах этих соединений. Значения рН начальной и конечной точек титрования для всех препаратов лежат в области около 10,8 и 3,2, что свидетельствует об однотипности функциональных групп в образцах. На кривых обратного титрования выделены две точки эквивалентности в слабокислой и слабощелочной среде, в то время как прямое титрование для всех гумусовых кислот обнаруживает только одну точку эквивалентности в интервале 5,2-6,5 для разных компонентов. Полученные результаты свидетельствуют о содержании во всех исследуемых соединениях карбоксильных и фенольных групп, а отличие определяется их количественными соотношениями и электронными влияниями других заместителей. Кислотные свойства наиболее выражены у фульвокислот, где они обусловлены преимущественно карбоксильными группами. Кислотность гуминовых кислот определяется содержанием как карбоксильных групп, так и фенольных гидроксилов, которые в сумме составляют 7,02 ммоль-экв/г препарата. Для гиматомелано-вых кислот характерно более низкое содержание функциональных групп кислотной природы, составляющее 5,54 ммоль-экв/г. Компоненты гуминовых веществ пелоидов по возрастанию кислотных свойств образуют ряд: гиматомелановые, гуминовые, фульвокислоты. Гистерезис, на наш взгляд, обусловлен конформационными изменениями молекул полиэлектролита. При высоких значениях рН молекулы имеют разрыхленную форму в результате электростатического

отталкивания неионизированных групп. В кислой среде присутствие ионов водорода понижает отрицательный заряд на полимере, возможно свертывание макромолекул, их конформация приближается к глобулярной, дополнительно стабилизированной за счет внутримолекулярных взаимодействий между функциональными группами. В результате этого часть групп блокируется во внутреннем объеме и становится нереакционноспо-собной. При прямом титровании добавление небольших порций титранта не восстанавливает вытянутую конформацию молекул полностью, поэтому количественно определяется меньшее число групп, способных к ионизации, чем при обратном титровании.

До настоящего времени нет однозначного решения вопроса о молекулярной структуре гуминовых веществ, поэтому важно изучение фракционного состава этих полидисперсных соединений. Гель-хроматографически установлена гетерогенность гуминовых веществ пелоидов по значениям молекулярных масс. В группах гу-миновых и фульвокислот выделено две фракции, в гиматомелановых - три. В суммарном препарате обнаружены 5 фракций с различными молекулярными массами.

Результаты исследования гидрофильно-гидрофобных свойств пелоидопрепаратов свидетельствуют об однотипности фракционного состава. В гиматомелановых, гуми-новых кислотах и в суммарном препарате выделено по 6 фракций; в фульвокислотах обнаружено 4 фракции, что подтверждает генетическую однотипность структуры всех гумусовых кислот, в то время как индивидуальность отдельных представителей заключается в варьировании входящих в них фракций. В ряду: фульвокислоты, гиматоме-лановые, гуминовые кислоты, - гидрофоб-ность возрастает от 11,54% до 73,6%. Различающиеся по амфифильным свойствам представители гуминовых веществ выполняют в биосфере различную функциональную нагрузку: компоненты с преобладанием гидрофильных свойств обусловливают миграцию органических и минеральных веществ в биосубстратах, в то время как гидрофобные компоненты влияют на иммобилизацию различных соединений.

Исследование гуминовых веществ методом капиллярного электрофореза также подтверждает однотипность строения всех гумусовых кислот и позволяет отнести их к

полиэлектролитам с различной выраженностью заряженных фрагментов. Кислотные свойства наиболее выражены у фульвокис-лот. Следует отметить, что суммарный препарат проявляет себя как самостоятельный полиэлектролит, а не как сумма входящих в его состав компонентов, что свидетельствует о сложности строения макромолекул.

Методом дифференциально-термического анализа установлено наличие полисопряженного ароматического ядра и алифатических периферических цепочек различной степени выраженности у всех гумусовых кислот. Характер термограмм подтверждает существование межмолекулярных связей между отдельными группами гумусовых кислот, что повышает их термодинамическую устойчивость при совместном присутствии.

Характер ЭПР-спектров свидетельствует о наличии парамагнитных центров со значением g-фактора, равного 2,00 и обусловленного наличием свободных электронов во всех гуминовых веществах. Являясь полигетерофункциональными соединениями, они содержат как электронодонорные, так и электроноакцепторные заместители, за счет чего возможно перераспределение электронной плотности с образованием комплексов с переносом заряда, что и приводит к возникновению парамагнитных центров. Содержание их возрастает в ряду: фульво-кислоты, гиматомелановые, гуминовые кислоты.

Коэффициенты самодиффузии гуми-новых веществ пелоидов, установленные методом ядерно-магнитного резонанса с импульсным градиентом магнитного поля, несколько возрастают в ряду: гиматомелано-вые, гуминовые, фульвокислоты, хотя имеют близкие значения. Данный факт подтверждает близость, но не идентичность строения этих соединений. Все гумусовые кислоты ведут себя в водных растворах как гомогенные системы, в них не выделены компоненты, движущиеся с различными скоростями. Значения коэффициентов самодиффузии пе-лоидопрепаратов выше, чем чистой воды, и это позволяет прогнозировать лучшую проницаемость через биомембраны.

Изучение адсорбционных свойств гу-миновых веществ характеризует их как высокоактивные природные сорбенты, в которых отсутствуют латеральные взаимодействия. Если адсорбционная способность гима-томелановых, фульвокислот и суммарного

препарата описывается уравнением Ленгмю-ра, то изотерма адсорбции воды на гумино-вых кислотах согласуется с уравнением Генри, что можно объяснить значительным вкладом хемосорбционных процессов и наличием фуллереновых структур.

Изучение биологической активности фульвокислот, гиматомелановых, гуминовых кислот, суммарного препарата в широком диапазоне концентраций на модели острого каррагенинового воспаления выявило полимодальную зависимость действия всех препаратов от дозы. Сравнение противовоспалительной активности с влиянием 2,5% раствора диклофенака натрия показало более выраженное действие гуминовых пелоидо-препаратов.

Влияние фульвокислот, гиматомелано-вых, гуминовых кислот и суммарного препарата на динамику хронического воспаления изучали в экспериментальной модели адъю-вантного артрита. Полученные результаты свидетельствуют о сложном полимодальном воздействии всех пелоидопрепаратов гуми-нового ряда на различные стадии воспалительного процесса. Реакция организма на отдельные компоненты гумусовых кислот в исследуемых дозах неоднозначна, но все изученные соединения способствуют нормализации общего баланса окислительно-восстановительных процессов в организме. Динамика изменения гематологических и иммунологических показателей при введении гуминовых кислот животным с развившимся адъювантным полиартритом отражает снижение выраженности воспалительного процесса с аутоиммунным компонентом, при этом терапевтический эффект нарастал с увеличением курсовой дозы.

Изучение биологического действия препаратов гуминового ряда на молекулярном уровне in vitro проводилось в условиях полиферментных, полисубстратных систем на основе выяснения метаболической активности. Экспериментальная модель включала клеточные популяции печени и скелетных мышц крыс, индикаторами эффективности препаратов служила активность дегидроге-наз. Установлено, что на активность ферментов из ткани печени изученные препараты практически не оказывают влияния. Исключение составляют гуминовые кислоты, которые вызывают уменьшение активности малатдегидрогеназы на 18,7% (р<0,05).

При изучении ферментативных реакций в гомогенате мышечной ткани воздействие пелоидопрепаратов более значимо. Максимальный эффект воздействия наблюдается под влиянием гуминовых кислот, что приводит к уменьшению скорости реакции на 21,98% (р<0,02) через 1 минуту и почти на 29% (р<0,04) по истечении 5 минут инкубации, оставаясь в дальнейшем на этом уровне. Суммарный препарат достоверно (р<0,01) изменяет скорость ферментативной реакции, но эффект его действия менее выражен, чем у гуминовых кислот, и в среднем составляет 21,42%.

При исследовании реакций, контролируемых лактатдегидрогеназой в мышцах, выявлено, что фульвокислоты изменяют удельную активность фермента в среднем на 17,05%, причем действие нарастает с увеличением срока инкубации. Изменение активности фермента при взаимодействии гима-томелановых кислот несколько увеличивается, составляя в среднем 19,14%, при этом зависимость процесса от срока инкубации аналогична предыдущим. Максимально выражено влияние на активность лактатдегид-рогеназы у гуминовых кислот. Здесь оно достигает 36,63% (р<0,001).

Влияние гуминовых веществ на структурно-функциональные показатели натив-ных и модифицированных клеток с различными функциями осуществлялось через систему крови в условиях in vitro. Воздействие осуществлялось пелоидопрепаратом на основе гуминовых кислот, проявивших наиболее выраженное влияние на ферментативную дегидрогеназную активность. Установлено, что если в обычных условиях гуминовые кислоты ведут себя относительно индифферентно к клеткам крови, то в экстремальных условиях они нивелируют повреждающее воздействие и способствуют поддержанию гомеостаза. Совокупность данных, полученных в экспериментах, свидетельствует о сложности изменений в системе крови, происходящих в условиях окислительного стресса и вмешательства пелоидопрепарата в этот процесс. Характер влияния гуминовых кислот на систему крови подтверждает их антиоксидантные свойства в качестве ловушек свободных радикалов, а также протекторное действие, направленное на поддержание нормального функционирования системы в целом.

Изучение действия гуминовых веществ на репродуктивную функцию проводилось на основе влияния гуминовых кислот на кинетические показатели спермоплазмы в норме и в условиях окислительного стресса. Совокупность сведений, полученных в результате проведенных экспериментов, свидетельствует об индифферентном отношении пелоидопрепарата к эякуляту в физиологических условиях. Не оказывая влияния на состояние биосистемы в норме, гуминовые кислоты способствуют восстановлению физиологических функций при их нарушении. Установлено, что характер ответа на моделированный окислительный стресс, вызванный пероксидом водорода, не однозначен со стороны отдельных образцов биоматериала, что свидетельствует о сложности и многофакторности физиологической реакции в экстремальных условиях. Гуминовые кислоты проявляют протекторное действие и защищают мужские гаметы от токсического действия пероксида водорда.

Выводы: на основе всей совокупности полученных экспериментальных данных можно утверждать, что гуминовые вещества пелоидов образуют генетический ряд биологически активных веществ, сходственных по структуре и свойствам. Это динамичные макромолекулярные системы нерегулярного строения, способные к внутреннему перераспределению электронной плотности по системе сопряженных связей. Гуминовые вещества выполняют уникальную функцию по поддержанию постоянства состава на макро- и микроуровнях. Они сохраняют экологическое равновесие в макросистемах,

связывая экотоксиканты различной природы и способствуя миграции и усвоению биоэлементов, поддерживают круговорот веществ в глобальном масштабе. Сложная динамичная система гуминовых веществ поддерживает внутренний гомеостаз биосистем на организменном, клеточном и субклеточном уровнях, способствуя восстановлению физиологических функций при патологических состояниях и в экстремальных ситуациях.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Орлов, Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. М., Наука, 1993. -325 с.

2. Спринчак, Д. В. К вопросу о детоксикации рапса гуминовми препаратами / Д.В. Спринчак, Т.И. Бокова // Сб. матер. II Международной научно-практической конференции: Пища. Экология. Качество. - Новосибирск., 2002. - С. 351-352.

3. Бокова, Т.И. Влияние различных детоксикан-тов на остаточное содержание свинца в тканях цыплят / Т.И. Бокова, О.Г. Грачева // Сибирский экологический журнал. - 2000. - № 3. - С. 257-261.

4. Буряк, А.К. Определение приоритетных эко-токсикантов органической и минеральной природы в пелоидах Самарского региона / А.К. Буряк, Н.П. Аввакумова // Сборник научных трудов «Гуминовые вещества в биосфере», М., Изд: МГУ, 2004. - С. 149-153.

5. Аввакумова, Н.П. Гуминовые кислоты как перспективная матрица для введения в организм металлов-биогенов / Н.П. Аввакумова, М.А. Кривопалова, И.В. Фомин // Материалы II Всероссийского съезда фармацевтических работников. - Сочи, 2005. - С. 90-92.

HUMIN SUBSTANCES - THE FACTOR OF BIOSYSTEMS PROTECTION FROM ECOTOXICOGENIC SUBSTANCES

© 2009 N.P. Avvakumova Samara State Medical University

Dependence of protecting properties in a number humin substances from low-mineralised silt sulphidic muds from their structurally functional properties is studied. It is established, that humic acids carry out unique function on maintenance of a constancy of structure on macro- and microlevels. It is established, that humic acids keep ecological equilibrium in micro- and macrobiosystems.

Keywords: humin substances, sulphidic muds, ecological equilibrium

Nadezchda Avvakumova, Doctor of Biology, Professor, Head of the Common, Bioinorganic and Bioorganic Chemistry Department. E-mail: navvak@yandex.ru