CC BY
66
НАУЧНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ fiT
Групповая заболеваемость норовирусными гастроэнтеритами в Республике Беларусь и молекулярная эпидемиология возбудителей
Поклонская Н.В.1, Амвросьева Т.В.1, Дедюля К.Л.1, Клюйко Н.Л.2, Ходин Д.В.3, Дашкевич А.М.4, Кишкурно Е.П.5, Богуш З.Ф.1, Казинец О.Н.1
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии, Минск, Беларусь 21ородская детская инфекционная клиническая больница, Минск, Беларусь 323-й санитарно-эпидемиологический центр Вооруженных Сил Республики Беларусь, Минск 4Минский городской центр гигиены и эпидемиологии, Беларусь 5Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск
Paklonskaya N.V.1, Amvrosieva TV.1, Dziadzula K.L.1, Kluiko N.L.2, Hodin D.V.3, Dashkevich A.M.4, Kishkurno E.P.5, Bogush Z.F, Kazinetz O.N1
'Republican Research and Practical Center for Epidemiology and Microbiology, Minsk, Belarus 2City Children's Clinical Hospital of Infectious Diseases, Minsk, Belarus 323th Sanitary-Epidemiological Center of the Armed Forces of the Republic of Belarus, Minsk 4Minsk City Centre of Hygiene and Epidemiology, Minsk, Belarus 5Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk
Norovirus group morbidity in the Republic of Belarus and molecular epidemiology of causative agents
Резюме. Подтверждена доминирующая роль норовирусов II геногруппы в возникновении групповой заболеваемости вирусными гастроэнтеритами в 2009-2013 гг. в Республике Беларусь. Этиологические агенты вспышек принадлежали к 4 различным генотипам (GII.4, GII.b-GII.', GII.3, GII.6) норовирусов. Все эпизоды групповой заболеваемости были вызваны глобальными эпидемическими геновариантами, ранее не циркулировавшими в стране. Впоследствии многие этиологические агенты вспышек распространились в популяции и стали причиной спорадических случаев вирусного гастроэнтерита.
Ключевые слова: норовирус, групповая заболеваемость, молекулярная эпидемиология, генотип, эпидемический вариант, вирусный гастроэнтерит.
Медицинские новости. - 2013. - №12. - С. 78-81. Summary. The present results prove the leading role of genogroup II norovirus as a causative agent of viral gastroenteritis outbreaks in 2009-2013 in the Republic of Belarus. Etiologic agents of outbreaks belonged to four different genotypes (GII.4, GII.b-GII.', GII.3, GII.6) of norovirus. All episodes of group morbidity were caused by global epidemic genovariants which did not circulate in the country before. After outbreaks many of norovirus agents spread in population and caused sporadic cases of viral gastroenteritis.
Keywords: norovirus, outbreak, molecular epidemiology, genotype, epidemic variant, viral gastroenteritis. Meditsinskie novosti. - 2013. - N12. - P. 78-81.
Норовирусная инфекция представляет серьезную проблему для здравоохранения в современном мире, что обусловлено ее доминирующей ролью в формировании групповой заболеваемости. Так, в 1997-2000 гг. норовирусы (НВ) вызвали 93% всех вспышек острых кишечных инфекций (ОКИ), зарегистрированных в США, и 85% - в странах Европы [3]. Средств вакцинопрофилактики в отношении данных возбудителей не существует, поэтому главной эффективной мерой для снижения норовирусной заболеваемости является регулярный эпидемиологический надзор с проведением соответствующих противоэпидемических мероприятий. В различных странах мира активно разрабатываются и внедряются национальные системы эпиднадзора за НВ, основанные на результатах молеку-лярно-эпидемиологических исследований. С помощью методов молекулярной эпидемиологии осуществляется анализ географического распространения наибо-
лее эпидемически значимых вариантов НВ, а также отслеживается процесс их смены и влияния на показатели заболеваемости в данном регионе. Основная цель моле-кулярно-эпидемиологического надзора за НВ - быстрое выявление геновариантов с высоким эпидемическим потенциалом и предотвращение их распространения.
Цель исследования - установление вклада норовирусов в групповую заболеваемость острыми гастроэнтеритами в Республике Беларусь за последние 5 лет и молекулярно-эпидемиологический анализ возбудителей. Материалы и методы Клинический материал (образцы фекалий) 88 пациентов был собран в ходе лабораторной расшифровки 12 эпизодов групповой заболеваемости острыми гастроэнтеритами (ОГЭ), имевших место в 2009-2013 гг. на территории Минска, Минской и Брестской областей.
Идентификация этиологического агента ОГЭ проводилась методами ПЦР
и ОТ-ПЦР с использованием тест-систем «АмплиСенс Rotavirus/Norovirus/Astrovirus-FL», «АмплиСенс ОКИ скрин-FL», «АмплиСенс Norovirus 1,2 genotypes-EPh», «АмплиСенс Enterovirus-FL» (Россия). Выявление РНК саповирусов проводили в ОТ-ПЦР с праймерами SLV5317 и SLV5749 с использованием состава реакционных смесей и условий постановки, предложенных разработчиками праймеров [10]. Для секвенирования участков генома норовирусов использовали фрагмент 340 нт, локализованный в пределах 3'RdRp и амплифицируемый с помощью праймеров JV12/JV13 [9], а также фрагмент 280 нт, локализованный в гене VP1, который накапливали с помощью праймеров CapC/CapD1/CapD3 [7]. Секвенирование участков ДНК проводили методом терминации цепи в термоциклической реакции на ДНК-анализаторе CEQ8000 c использованием набора DtCs Quick Start Kit (Beckman Coulter). Поиск гомологичных последовательностей осу-
Таблица Общая характеристика групповой заболеваемости вирусными кишечными инфекциями у обследованных пациентов в 2009-2012 гг.
Дата (месяц, год) Регион Диагноз Кол-во обследованных Возраст, лет Этиологииче-ский агент Доля пациентов, у которых выявлен этиологиический агент
Май, 2009 Минск ОГЭ* 8 18-20 Саповирус 75%
Февраль, 2010 Минская область ОГЭ 10 18-20 Саповирус Норовирус II Энтеровирус 60% 10% 30%
Март, 2010 Минск ОГЭ 8 45-86 Норовирус II 87,5%
Май, 2010 Минск ОГЭ 15 16-17 Норовирус II 86,6%
Февраль, 2011 Минск ОГЭ 5 18-25 Норовирус II Энтеровирус 80,0% 40,0%
Январь, 2012 Ляхови-чи ОГЭ 11 11-18 Норовирус II 81,8%
Май, 2012 Лунинец ПТИ** 5 7-8 Норовирус II 100%
Июль, 2012 Борисов ОГЭ 6 7-12 Энтеровирус 100%
Июль, 2012 Мядель ОГЭ 5 9-15 Норовирус I 80%
Июль, 2012 Минск ОГЭ 6 18-20 Норовирус II 33,3%
Октябрь, 2012 Лунинец ОГЭ 3 16-17 Норовирус II 66,6%
Июль, 2013 Минский район ОГЭ 7 6-13 Норовирус II Энтеровирус 85,7% 14,3%
П р и м е ч а н и е : * - острый гастроэнтерит, ** - пищевая токсикоинфекция
Рисунок 1
!'§ ° m § S
s О й
£ с S
5 Е- о ю
Участие различных вирусных агентов в формировании группо вой заболеваемости ОГЭ
3
80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0
%
75,0%
16,6%
8,4%
33,3%
Л
Саповирус Норовирус1 Норовирус2 Энтеровирус Этиологический агент
ществляли в базе данных NCBI с помощью программы BLAST [1], компьютерный анализ последовательностей проводили с помощью программы MEGA (Molecular evolutionary genetics analysis), версии 5.2 [8]. Для филогенетической реконструкции использовали метод максимального
правдоподобия (maximum likelihood, ML) [4], имплементированный в MEGA 5.2. Достоверность топологий филогенетических древ оценивали методом псевдореплик (bootstrapping). Для оценки достоверности топологии по каждому древу были проанализированы 1000 псевдореплик [5].
Результаты и обсуждение
Проведены лабораторные исследования по установлению этиологии 12 эпизодов групповой заболеваемости ОКИ, в ходе которых заболело более 150 человек (2009-2013 гг.). Диагностику проводили методом ПЦР у 88 пациентов в отношении шести родов кишечных вирусов: рота-, норо- (I и II геногруппы), астро-, адено-, сапо- и энтеровирусов. Изучаемая групповая заболеваемость (таблица) не имела сезонности (с равной частотой регистрировалась в течение всего года) и имела место в закрытых или полузакрытых коллективах (детские лагеря, интернаты, военные части и т.д.). Возрастной диапазон пациентов был достаточно широк - от 6 до 86 лет. Анализ этиологической структуры показал, что большинство эпизодов групповой заболеваемости протекало в виде моноинфекции (75%, 9/12) и только три ассоциировались со смешанной инфекцией, вызванной 2-3 вирусными агентами. Основным клиническим диагнозом групповой заболеваемости был ОГЭ.
По результатам генодиагностики (рис.1), доминирующими возбудителями оказались НВ II геногруппы: 83,3% эпизодов было вызвано НВ I и II геногрупп, в том числе 75% - НВ II геногруппы. С учетом сложившейся этиологической структуры был проведен молекулярно-эпидемиоло-гический анализ норовирусных возбудителей, направленный на решение следующих задач: молекулярное типирование и установление генотипов НВ, вызвавших групповую заболеваемость; сравнение их генетических характеристик с НВ, вызвавших спорадическую заболеваемость в нашей стране и за рубежом за тот же период времени; идентификация принадлежности «белорусских вспышечных» НВ к глобальным эпидемическим генова-риантам, получившим широкое распространение и вызвавшим многочисленные вспышки и эпидемии в различных странах мира. Для молекулярного типирова-ния был осуществлен филогенетический анализ «белорусских вспышечных» НВ и прототипных штаммов различных генотипов и геновариантов НВ II геногруппы по двум регионам генома - фрагментам гена УР1, кодирующего основной капсидный белок, и МЯр, кодирующего РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса. Для сравнения в филогенетический анализ также были включены НВ, вызвавшие спорадическую заболеваемость в нашей стране в тот же период времени.
По гену РНК-полимеразы проанализированы вирусы, вызвавшие три эпизода групповой заболеваемости: в марте
№12 • 2013
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ |79
| Филогенетическая реконструкция по фрагменту (250 нт) гена VP1 13 норовирусов, идентифицированных у пациентов в периоды групповой и спорадической заболеваемости в 2009-2013 гг.
и мае 2010 г. (город Минск), а также в июле 2013 г. (Минский район). По гену VP1 изучены вирусы, ставшие причиной групповой заболеваемости в мае 2010 г. (Минск), январе и июле 2012 г. (Ляховичи и Мядель соответственно).
Филогенетический анализ по гену РНК-полимеразы (рис. 2) показал, что НВ, вызвавшие два эпизода групповой заболеваемости (в марте и мае 2010 г.), принадлежали к генотипу GII.4, эпидемическому геноварианту GII.4 2009 New Orleans. Эпидемический геновариант New Orleans впервые был зарегистрирован в Австралии в 2008 г. и получил глобальное распространение в 2009-2012 гг. Несмотря на такое широкое распространение, данный геновариант не вызвал существенного подъема заболеваемости норовирусной инфекцией, как это имело место при появлении предшествующего геноварианта GII.4 2006b [11]. В Республике Беларусь, по результатам наших исследований, НВ геноварианта GII.4 2009 New Orleans впервые были зарегистрированы во время групповой заболеваемости
в закрытом коллективе в Минске в марте 2010 г. В предшествующий период (2009 г. и зима 2010 г.) в нашей стране имела место широкая циркуляция геноварианта GII.4 2006b (соответствующий кластер на рис. 2). Таким образом, два эпизода групповой заболеваемости в марте и мае 2010 г. не были связаны со спорадической заболеваемостью, регистрируемой до их возникновения, так же как не были связаны и между собой. Так, НВ, вызвавшие групповую заболеваемость в марте и в мае 2010 г., формировали на дендрограм-ме два обособленных монофилетических кластера в составе общего кластера, соответствующего геноварианту GII.4 2009 New Orleans. В состав этих кластеров входили также вирусы, идентифицированные у пациентов со спорадическими случаями ОКИ зимой 2011 г. Этот факт указывает на то, что НВ геноварианта GII.4 2009 New Orleans впервые появились на территории Беларуси в 2010 г., вызвав групповую заболеваемость, а впоследствии распространились в популяции, став причиной спорадических случаев ОКИ.
Филогенетический анализ НВ, вызвавших групповую заболеваемость в июле 2013 г. (штаммы Ни/МоУ/вН.д-в. II. 1/М№к11616/2013Щ Ни/МоУ/вИ.д-в. 11.1/М№к116/2013/БУ] рис. 2), показал, что они группировались в составе кластера, соответствующего генотипу вН.д, к которому на сегодняшний день относят только рекомбинантные НВ [2]. Исходя из этих данных, можно предположить, что НВ, вызвавшие групповую заболеваемость в июле 2013 г., были реком-бинантами по ОРС1/ОРС2,3. Описано два варианта рекомбинантных геномов, содержащих рНК-полимеразу генотипа вИ.д: рекомбинанты с генотипом вИ.12 (по МР1) и с генотипом вИ.1 (по МР1) [2]. НВ, обладающие рекомбинантным генотипом GII.g-GII.12, циркулировали в разных странах, в том числе в Беларуси, в 2010-2011 гг. на фоне спорадической заболеваемости. Однако на дендрограмме они группировались в отдельный кластер, не содержавший НВ, вызвавшие групповую заболеваемость в июле 2013 г. Этиологические агенты этой заболеваемости
были объединены в общий кластер с НВ, обладавшими рекомбинантным геномом GII.g-GlI.1 (на дендрограмме (рис. 2) штаммы Hu/GII/IPH2045-LIM008/2010/BE, Hu/GII.1/Ascension208/2010/USA). На основании этих данных можно предположить, что норовирусные возбудители групповой заболеваемости июля 2013 г. также были рекомбинантами GII.g-GII.1. Данный геновариант НВ вызвал многочисленные вспышки в странах Европы (Бельгия, Германия) в 2010-12 гг. [6].
Анализ результатов филогенетической реконструкции по фрагменту гена, кодирующего основной капсидный белок VP1 (рис. 3), показал, что вирусы, вызвавшие групповую заболеваемость в январе и июле 2012 г., принадлежали генотипам GII.3 и GII.6 соответственно, в то время как норовирусные возбудители групповой заболеваемости мая 2010 г. группировались в составе кластера, соответствующего эпидемическому варианту GII.4 2009 New Orleans, что полностью подтверждает данные, полученные для этих вирусов по гену РНК-полимеразы.
НВ генотипа GII.3, вызвавшие групповую заболеваемость в январе 2012 г., ни до, ни после этого не выявлялись на территории Беларуси. Максимальным сходством (98%) с ними обладали НВ, циркулировавшие в 2010-11 гг. в странах Азии (Китае и Тайване). Такая ситуация позволяет предположить занос на территорию нашей страны геноварианта НВ, вызвавшего групповую заболеваемость в январе 2012 г.
НВ генотипа 611.6, зарегистрированные в июле 2012 г. (штаммы Ни/ в11. 6/М1пэк10555/2012/БУ Ни/вШМпэк 10560/2012/БУ) в качестве этиологических агентов эпидемической но-ровирусной заболеваемости, группировались в составе кластера со штаммами, вызвавшими спорадические случаи ОКИ в тот же период времени (штаммы Ни/в11.6/Мтк10415/2012/БУ Ни/вИ. 6/М1пэк10620/2012/БУ Ни/вН. 6/ Мтк10528)/2012/БУ). Это единственный из всех проанализированных нами эпизодов групповой заболеваемости, вызванный геновариантом, активно циркулировавшим в то же время среди населения. Следует отметить, что данный эпизод групповой заболеваемости характеризовался достаточно низким уровнем (33,3%) идентификации норовирусных агентов у обследованных, тогда как в большинстве других эпизодов НВ выявлялись у 60-100% пациентов (см. таблицу). Эти данные позволяют предположить, что в этом случае имела место смешанная этиология групповой заболеваемости, а НВ были минорными этиологическими агентами.
Таким образом, представленные данные по молекулярной эпидемиологии возбудителей групповой и спорадической норовирусной заболеваемости в Республике Беларусь в течение последних 5 лет свидетельствуют о доминирующей роли НВ II геногруппы. Среди выявленных НВ наблюдалось значительное генетическое разнообразие - они принадлежали к че-
тырем различным генотипам. Все эпизоды групповой норовирусной заболеваемости были связаны с геновариантами, характеризующимися глобальным распространением и вызвавшими многочисленные вспышки или сезонные подъемы инфекции в других странах мира. Из пяти проанализированных эпизодов групповой заболеваемости только один (20%) был ассоциирован с НВ, активно циркулировавшим в тот же период среди населения на фоне спорадических случаев инфекции, 80% эпизодов были вызваны «новыми» для нашей страны, ранее не циркулировавшими геновариантами, которые в ряде случаев (40%) впоследствии распространились в популяции и стали причиной спорадических случаев ОКИ.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Altschul S, Gish W., Miller W. et al. // J. Mol. Biol. -1990. - Vol.215. - P.403-410.
2. BullR, Tanaka M, White P. // J. Gen. Virol. - 2007. -Vol.88 (Pt.12). - P.3347-3359.
3. Fankhauser R., Monroe S., Noel J. et al. // J. Infect. Dis. - 2002. - Vol.186. - P.1-7.
4. Felsenstein J. // J. Mo. Evol. - 1981. - Vol.17, N6. - P.368-376.
5. Felsenstein J. // Evolution - 1985. - Vol. 39. -P.783-791.
6. Hoffmann D., Mauroy A., Seebach J. et al. // J. Clin. Virol. - 2013. - Vol.58, N1. - P.24-30.
7. Kojima S, Kageyama T., Fukushi S. et al. // J. Virol. Meth. - 2002. -Vol.100. - P.107-114.
8. Tamura K., Peterson D., Peterson N. et al. // Mol. Biol. Evol. - 2011. - Vol.28, N10. - P.2731-2739.
9. Vinie J., Vennema H., Maunula L. et al. // J. Clin. Micr. - 2003. - Vol.41, N4. - P.1423-1433.
10. Yan H., Yagyu IF, Okitsu S. et al. // J. Virol. Meth. -2003. - Vol.114. - P.37-44.
11. Yen C., Wikswo M., Lopman B. et al. // Clin. Infect. Dis. - 2011. - Vol.53, N6. - P.568-571.
Поступила 25.09.2013 г.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОДТВЕРДИЛИ НЕОБХОДИМОСТЬ ДВУКРАТНОГО ВВЕДЕНИЯ ЭПИНЕФРИНА ДЕТЯМ С АНАФИЛАКТИЧЕСКИМИ РЕАКЦИЯМИ ВСЛЕДСТВИЕ ПИЩЕВОЙ АЛЛЕРГИИ
На сегодняшний день пищевой аллергией (ПА) страдает 6% детского населения развитых стран. В 2007 г. 3 млн школьников США имели ПА, что на 18% больше, чем в 1997 г. Высокие темпы роста патологии обуславливают возрастание частоты тяжелых форм ПА, в том числе анафилактических реакций, или 1дЕопосредованных реакций гиперчувствительности немедленного типа, которые характеризуются полиорганными проявлениями и могут представлять риск для жизни больного. Согласно современным практическим руководствам пациентам с анафилаксией (А) вследствие ПА в качестве неотложной помощи показано назначение эпинефрина (Э). Кроме того, все пациенты с А на пищу в анамнезе должны быть обучены самостоятельным инъекциям одной дозы Э.
В настоящее время опубликовано несколько небольших исследований, в которых показано, что у детей с А вследствие ПА самостоятельное введение нескольких доз Э более эффективно и с медицинской, и с экономической точки зрения. Американские исследователи провели многоцентровое
- ЭТО ПОЛЕЗНО ЗНАТЬ
обзорное исследование с целью изучения частоты и необходимости применения повторных доз Э у детей с А, обусловленной ПА.
Результаты многоцентрового исследования подтвердили, что эпинефрин - препарат неотложной помощи, который у 12% детей с жизнеугрожающими анафилактическими реакциями вследствие пищевой аллергии в отделения неотложной помощи вводится повторно. Учитывая полиорганный характер симптомов с развитием артериальной гипотензии при анафилаксии у детей с пищевой аллергией, назначение эпинефрина - адреномиметика, оказывающего прямое стимулирующее действие на а- и p-адренорецепторы, показано большинству больных. Полученные результаты подтвердили необходимость следовать современным руководствам. Детям, страдающим пищевой аллергией и имеющим риск развития анафилактических реакций, рекомендуется самостоятельное введение двух доз эпинефрина с помощью индивидуального шприца-ручки. Предпочтительный метод введения - внутримышечный.
Rudders S.A. et al. // Pediatrics. - 2010. - Vol. 125. -
P. e711-e718.
№12 • 2013
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ |в1
