CC BY
44
Клиническая онкогематология. 2020;13(2):115-22
Clinical oncohematology. 2020;13(2):115-22
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
EXPERIMENTAL STUDIES
Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор и технология CAR-T при солидных опухолях в эксперименте
Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor and CAR-T Technology for Solid Tumors in Experiment
Д.В. Зайцев1, Е.К. Зайковаг2, А.С. Головкин1, Э.Р. Булатов3, А.Х. Валиуллина3, Р.М. Миргаязова3, А.А. Дакс2, А.Ю. Зарицкий1, А.В. Петухов12
1 ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России,
ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341
2 ФГБУН «Институт цитологии РАН», Тихорецкий пр-т, д. 4, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 194064
3 ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», ул. Кремлевская, д. 18, Казань, Российская Федерация, 420008
DVZaytsev1, EKZaikova12, AS Golovkin1,
ER Bulatov3, AKh Valiullina3, RM Mirgayazova3, AA Daks2,
AYu Zaritskey1, AV Petukhov12
1 VA Almazov National Medical Research Center,
2 Akkuratova str., Saint Petersburg, Russian Federation, 197341
2 Institute of Citology, 4 Tikhoretskii pr-t, Saint Petersburg, Russian Federation, 194064
3 Kazan (Privolzhskii) Federal University, 18 Kremlevskaya str., Kazan, Russian Federation, 420008
РЕФЕРАТ
Актуальность. Цитокины являются важными факторами, способствующими повышению эффективности CAR T-клеточной терапии. Кроме того, это ключевые элементы патогенеза синдрома высвобождения цитоки-нов и нейротоксичности при использовании технологии CAR-T. Однако в настоящее время эффекты цитокинов в контексте CAR T-терапии изучены недостаточно. Цель. Проведение количественной оценки секреции цитокинов методом мультиплексного анализа при совместной инкубации CAR T-лимфоцитов анти-СЭ19 с эпителиальными клетками линий HeLa и A431, экс-прессирующими на своей поверхности CD19. Материалы и методы. Т-лимфоциты подвергнуты трансдукции лентивирусным вектором, содержащим ген анти-CD^-CAR. Экспрессия CAR проверена по репортеру GFP методом проточной цитометрии. С целью подтвердить специфическую активацию CAR T-клеток в ответ на опухолевый антиген проведен иммунофер-ментный анализ на определение уровня интерлейкина-2, интерферона-Y и фактора некроза опухолей-а. Цито-токсическая активность полученных CAR T-лимфоцитов изучалась при их прямом совместном культивировании с клетками-мишенями. Сравнение уровня цитокинов, выделенных до и после инкубации мишеней с CAR T-клетка-ми, выполнено методом мультиплексного анализа. Результаты. Отмечено повышение уровня провоспали-тельных цитокинов (интерлейкина-6, интерлейкина-1р, интерферона-Y) (Р < 0,01). Разница в уровне противовоспалительных цитокинов (интерлейкина-4, интерлей-кина-10) оказалась незначительной, а в эксперименте на клеточной линии HeLa — статистически незначимой
ABSTRACT
Background. Cytokines are considered as important factors that enhance the efficacy of CAR-T cell therapy. Besides, they are key elements of the pathogenesis of cytokine release syndrome and neurotoxicity in applying the CAR-T technology. However, cytokine effects in the context of CAR-T therapy have not yet been properly studied. Aim. To quantitatively assess cytokine secretion using multiplex assay with co-incubation of anti-CD19 CAR-T lymphocytes with epithelial HeLa and A431 cell lines expressing CD19 on their surface.
Materials & Methods. T-lymphocytes were transduced with the lentiviral vector containing anti-CD19-CAR gene. CAR expression was tested based on GFP reporter using flow cytometry. To confirm a specific CAR-T cell activation response to tumor antigen, the levels of interleukin-2, interferon-Y, and tumor necrosis factor-a were measured by means of immunoassay. Cytotoxic activity of CAR-T lymphocytes obtained was examined with their direct co-culturing with target cells. The levels of cytokines isolated prior to and after incubation of targets with CAR-T cells were compared using multiplex assay.
Results. The level of some proinflammatory cytokines (in-terleukin-6, interleukin-1p, interferon-Y) (P < 0.01) increased. The difference in the levels of anti-inflammatory cytokines (interleukin-4, interleukin-10) was inconsiderable, and in the HeLa cell line experiment it was insignificant (p > 0.05). The concentration of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) was many times higher after incubation with CAR-T lymphocytes (p < 0.01).
Conclusion. The trial revealed multiple enhancement of GM-CSF, one of the key elements of the pathogenesis of cy-
© 2020 практическая медицина
115
(p > 0,05). Выявлено многократное увеличение концентрации гранулоцитарно-макрофагального колониести-мулирующего фактора (ГМ-КСФ) после инкубации с CAR T-лимфоцитами (p < 0,01).
Заключение. Выявлено многократное повышение уровня ГМ-КСФ, являющегося одним из ключевых звеньев патогенеза синдрома высвобождения цитокинов и CAR T-ассоциированной нейротоксичности. Данные, полученные в дальнейших исследованиях ГМ-КСФ при использовании технологии CAR-T, могут привести к повышению эффективности CAR T-терапии при значимом снижении ее токсичности.
Ключевые слова: CAR T-клетки, ГМ-КСФ, цитоки-
ны, иммунотерапия.
tokine release syndrome and CAR-T-associated neurotoxicity. The results of further studies of GM-CSF can contribute to improving the efficacy of CAR-T therapy with considerably lower toxicity.
Keywords: CAR-T cells, GM-CSF, cytokines, immunotherapy.
Получено: 10 января 2020 г. Принято в печать: 28 марта 2020 г.
Received: January 10, 2020 Accepted: March 28, 2020
Для переписки: Даниил Владиславович Зайцев,
ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341;
тел.: +7(981)727-16-74; e-mail: zaicev_daniil@mail.ru
Для цитирования: Зайцев Д.В., Зайкова Е.К., Головкин А.С. и др.
Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
и технология CAR-T при солидных опухолях в эксперименте.
Клиническая онкогематология. 2020;13(2):115-22.
DOI: 10.21320/2500-2139-2020-13-2-115-122
For correspondence: Daniil Vladislavovich Zaytsev, 2 Akkuratova str., Saint Petersburg, Russian Federation, 197341; Tel.: +7(981)727-16-74; e-mail: zaicev_daniil@mail.ru For citation: Zaytsev DV, Zaikova EK, Golovkin AS, et al. Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor and CAR-T Technology for Solid Tumors in Experiment. Clinical oncohematology. 2020;13(2):115-22 (In Russ).
DOI: 10.21320/2500-2139-2020-13-2-115-122
ВВЕДЕНИЕ
Цитокины представляют собой белковые молекулы с молекулярной массой 6-70 кДа [1], секретируемые различными клетками и участвующие в процессах межклеточных взаимодействий и коммуникаций. Важным представляется тот факт, что один и тот же тип цитокинов может секретироваться различными по происхождению клетками, так же как и один цитокин может оказывать множество различных воздействий на разные типы клеток, т. е. обладать плейотропным свойством [2].
Известно, что цитокины являются важными регуляторами иммунного ответа и способны модифицировать противоопухолевый эффект клеток иммунной системы. Они принимают участие не только в регуляции естественного противоопухолевого иммунитета, но и оказывают влияние на эффективность иммунотерапии, в т. ч. адоптивной Т-клеточной [3]. Однако в контексте терапии Т-лимфоцитами с химерным антиген-рецептором (CAR-T) эффекты цитокинов в настоящее время изучены недостаточно [3].
Очевидна способность ряда цитокинов усиливать пролиферативную способность и цитотоксическую активность CAR T-лимфоцитов [4]. С другой стороны, именно цитокины являются главными факторами, ответственными за развитие иммунотоксичности, связанной с CAR T-терапией, главным образом в виде синдрома высвобождения цитокинов и нейротоксичности [5].
Проблема повышения эффективности при одновременном снижении токсичности приобретает
особое значение в CAR T-терапии солидных опухолей, при которых в отличие от гематологических опухолей до сих пор не отмечено значимых достижений [6]. Неудачи в CAR T-терапии солидных опухолей связаны со сложностью выбора таргетного антигена, трудностями доставки CAR T-клеток в опухолевый очаг, а также с опухолевым микроокружением, оказывающим значимое супрессивное действие на иммунные клетки. [7]. В такой ситуации цитокины могут служить факторами преодоления проблемы иммуносупрессии микроокружения солидных опухолей. Так, например, получены данные о повышении числа и активности иммунных клеток в опухолевых очагах при локальном применении интерлейкина-12 (ИЛ-12) [8], а также о повышении цитотоксической активности CAR T-клеток при добавлении ИЛ-15 и ИЛ-21 [3].
Кроме того, секреция цитокинов может служить одним из маркеров, характеризующих функциональную активность CAR T-клеток, а исследование уровня секреции цитокинов может косвенно отражать эффективность CAR T-лимфоцитов в отношении таргетных клеток-мишеней in vitro [9].
Для тестирования продукции цитокинов CAR T-клетками на доклиническом этапе разработки используются in vitro и in vivo модели взаимодействия опухоли и эффектора. В качестве in vitro модели может применяться опухолевая клеточная линия, экспрессирующая таргетный антиген. Такую линию принято называть мишенью или просто опухолью по отношению к CAR T-клеткам-эффекторам.
В качестве мишеней в данной работе были выбраны клеточные линии эпителиальных опухолей: аденокарциномы шейки матки HeLa [10] и эпидермо-
идного рака кожи A431 [11], прошедшие генетическую модификацию и экспрессирующие экзогенный (привнесенный) ген CD19, кодирующий соответствующую молекулу белка.
Цель нашего эксперимента — количественная оценка секреции цитокинов при совместной инкубации CAR T-лимфоцитов анти-CD^ с эпителиальными клетками линий HeLa и A431, экспрессирую-щими на своей поверхности CD19.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культивирование клеточных линий
Клеточные линии HeLa, А431 и HEK293T культивировали в среде DMEM с глутамином («ПанЭко», Россия), дополненной 10%-й фетальной бычьей сывороткой (Hyclone, США), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Указанные клеточные линий были любезно предоставлены лабораторией регуляции экспрессии генов Института цитологии РАН. Т-лимфо-циты периферической крови человека культивировали в среде RPMI-1640 с глутамином («ПанЭко», Россия), дополненной 10%-й фетальной бычьей сывороткой (Hyclone, США) с добавлением 300 ед. акт./мл человеческого рекомбинантного ИЛ-2 («Биотех», Россия).
Получение клеточных линий HeLa и А431,
стабильно экспрессирующих CD19
Последовательность гена CD19 была амплифи-цирована с кДНК клеточной линии CLL-HG3 и клонирована в вектор pUltra-Hot, предоставленный д-ром Malcolm Moore [12] и используемый для последующей лентивирусной трансдукции клеточных линий HeLa и A431. В качестве отрицательного контроля вместо гена CD19 использовали ген рецептора LNGFR. Селекция проводилась инкубированием с пуромицином в концентрации 2 мкг/мл в течение 1 нед.
Определение экспрессии антигена CD19
Наличие рецептора CD19 натрансдуцированных клетках линий HeLa и A431 оценивали методом проточной цитометрии на приборе Guava EasyCyte8 (Millipore, США) с применением антител против антигена CD19, конъюгированного с PE (BD Biosciences, США). В качестве контроля использовали нетрансду-цированные клетки, окрашенные человеческими анти-CD19-PE-антителами. Окраску проводили в соответствии с рекомендациями производителя.
Выделение и активация Т-лимфоцитов
Т-лимфоциты выделяли из фракции монону-клеаров периферической крови здорового донора, полученных путем центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque («ПанЭко», Россия). Для этого кровь разбавляли равным объемом раствора DPBS («БиолоТ», Россия), затем наслаивали на раствор Ficoll-Paque и центрифугировали при 400 g в течение 40 мин при комнатной температуре. Отбирали фракцию мононуклеаров, дважды промывали раствором DPBS и ресуспендировали в среде. Т-лимфо-циты выделяли и активировали с помощью Dynabeads Human T-activator CD3/CD28 (Invitrogen, США).
Создание целевой лентивирусной плазмиды
Целевую плазмиду получали посредством клонирования кассеты CAR_CD19-T2A-EGFP в лентиви-русный вектор pLVT1 («Евроген», Россия) под контролем промотора EF-1a, обеспечивающего высокую и стабильную экспрессию в первичных Т-лимфоцитах [13]. Последовательность CAR была аналогична FMC63-28ZCAR [9] и уже использовалась нами в предыдущих исследованиях [14].
Получение рекомбинантных псевдовирусных
частиц
За день до трансфекции клетки HEK293T рассевали на 10-см пластиковые чашки Петри по 2,5 х 106 клеток на чашку. По достижении 70%-й конфлюэнтности в пробирке смешивали 3 плазмиды (из расчета на одну 10-см чашку Петри): psPAX2 (9,75 мкг), pMD2.G (5,27 мкг), целевая лентивирусная плазмида (15 мкг). К полученной смеси добавляли реагент для трансфекции PEI MAX (Sigma-Aldrich, США) в соотношении PEI/ДНК = 2:1 и перемешивали в мешалке Vortex. Трансфекционную смесь инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре, затем по каплям добавляли в чашку Петри с клетками HEK293T и 7 мл среды.
Утром среду меняли. Свежая среда содержала 2 ммоль/л бутирата натрия. Через 48 ч супернатант, содержащий вирусные частицы, был собран и сконцентрирован посредством центрифугирования в модулях «Амикон Ультра-15, 100 кДа» (Millipore, США).
Трансдукция и экспансия Т-лимфоцитов
Через 48 ч после активации проводили лентиви-русную трансдукцию путем добавления очищенных рекомбинантных вирусных частиц в количестве 50 MOI и 50 мг/мл протамина сульфата.
Экспансия CAR T-клеток проводилась в течение 5 дней. Экспрессия CAR T-клеток проверена по репортеру GFP (зеленый флюоресцентный белок) методом проточной цитометрии. Фенотипирование осуществляли на проточном лазерном цитометре Cytoflex S (Beckman Coulter, США).
Оценку результатов фенотипирования выполняли с помощью программного обеспечения Kaluza 2.0 (Beckman Coulter, США).
Иммуноферментный анализ
Иммуноферментный анализ был проведен с помощью наборов «Интерлейкин-2-ИФА-БЕСТ», «Гамма-Интерферон-ИФА-БЕСТ» и «Альфа-ФНО-ИФА-БЕСТ» («Вектор-Бест», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя после 24-часовой совместной инкубации CAR T-клеток с клетками-мишенями в соотношении 1:1.
Оценка цитотоксичности в режиме реального
времени
Влияние CAR T-клеток (эффектора) на линию HeLa (мишень) оценивали на клеточном анализаторе xCelligence S16 (ACEA Biosciences, США). Таргетные клетки рассевали в количестве 5000 клеток на лунку планшета, инкубировали в течение 13 ч, после чего добавляли эффектор в соотношении мишень/эффектор, равном 2:1. По прошествии 35 ч совместной
инкубации останавливали эксперимент и анализировали полученные данные.
Анализ выброса цитокинов
Уровень цитокинов в клеточных культурах определяли с помощью лазерного анализатора для мультиплексного анализа Bio-Plex® 200 (Bio-Rad, США) через 48 ч после добавления CAR T-клеток, следуя инструкциям производителя. Для количественного определения аналитов (цитокинов/хемокинов) использовалась панель Bio-Plex Pro Human Chemokine (40-Plex), позволяющая одновременно выявлять 40 цитокинов.
Образцы были проанализированы в трех повторах, калибровочные кривые для каждого аналита были получены с использованием стандартов, предоставленных производителем.
Желтая флюоресценция, HLog
Желтая флюоресценция, HLog
Рис. 1. (А, Б) Экспрессия СР19 в полученных клеточных линиях. Отсутствие экспрессии СР19 в нетрансдуцированных клеточных линиях
Fig. 1. (A, £) CD19 expression in the cell lines obtained. No CD19 expression in non-transduced cell lines
Результаты парных образцов (определение уровня цитокинов в клеточной линии после инкубации с CAR T-клетками и без таковой) сравнивали с использованием критерия Уилкоксона. Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета программ SPSS vi7.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Наличие на поверхности трансдуцированных клеток-мишеней (HeLa и A431) экзогенного рецептора CD19 подтверждали методом проточной лазерной цитометрии (рис. 1).
Эффективность трансдукции Т-лимфоцитов составила 89,62 % по данным проточной цитометрии от-
Трансдукция
Рис. 2. Гистограмма эффективности трансдукции Т-лимфоцитов
Fig. 2. Histogram of T-lymphocyte transduction effectiveness
107-
106-
£
i 105, <
00 О
О
104"
103-
102-
Рис. 3. Субпопуляции CAR T-клеток после трансдукции
Fig. 3. CAR-T subpopulations after transduction
CD4-CD8+: 27,85 % уУ/^ДД HKf'r' CD4+CD8+: 0,19 %
■ CD4-CD8-: 1,14 % 4 CD4+CD8-: 70,82 %
T—........I .......I—........I .......I—.......l—.......1
101 102 103 104 105 106 107 CD4 APC
носительно репортерного гена GFP (рис. 2). При этом среди прошедших трансдукцию и экспансию клеток почти все экспрессировали общий лейкоцитарный антиген CD45, из которых 97 % клеток были Т-лимфо-цитами (положительными по CD3-антигену).
После экспансии оценивали фенотип CAR T-клеток посредством окрашивания антителами против маркеров CD4 и CD8; соотношение CD4/CD8 составляло 2,5 (рис. 3).
С целью подтвердить специфическую активацию CAR T-клеток в ответ на экзогенный опухолевый антиген CD19 был проведен иммуноферментный анализ уровней ИЛ-2, интерферона-у (ИФН-у) и фактора некроза опухолей-a (рис. 4). Многократное повышение уровня указанных выше цитокинов в линии CD19-HeLa+, но не в линии LNGFR-HeLa+ (служащей отри-
цательным контролем) после совместной инкубации с CAR T-клетками свидетельствует о специфическом противоопухолевом ответе активированных CAR T-лимфоцитов.
Специфическую цитотоксичность CAR T-лимфоци-тов подтверждали также в режиме реального времени на приборе xCelligence. Регистрировали подавление роста и пролиферации CD^-позитивной линии (рис. 5).
Для поиска сверхпродуцируемых CAR T-клетками цитокинов, предположительно имеющих перспективное значение в клинической практике для оценки эффективности CAR T-терапии, использовалась скри-нинговая мультиплексная панель.
В проведенном исследовании на клеточной линии HeLa отмечалось значимое повышение уровня провоспалительных цитокинов, а именно выявлено
ИФН-Y
10000
8000
6000
н
X
ф
4000
о
2000
8552
205
414
1600 1400 1200 1000
5 800
® 600 х
2 400 200 0
CAR-T LNGFR-HeLa + CD19-HeLa +
CAR-T
CAR-T
585 rîn
ИЛ-2
1365
320 -ï-
В
180
160
С 140 Е
Ц 120
! 100 л & 80
я- 60
х
о
* 40
CAR-T LNGFR-HeLa + CD19-HeLa +
CAR-T
CAR-T
ФНО-а
130
CAR-T LNGFR-HeLa + CAR-T
CD19-HeLa + CAR-T
Рис. 4. Изменение уровня (А) интерферона-Y (ИФН-y), (Б) интерлейкина-2 (ИЛ-2) и (В) фактора некроза опухолей-а (ФНО-а) после добавления CAR T-лимфоцитов к клеточным линиям, экспрессирующим специфический экзогенный опухолевый антиген CD19, выявленное методом иммуноферментного анализа
Fig. 4. Change in the levels of (А) interferon-Y (ИФН-y), (Б) interleukin-2 (ИЛ-2), and (В) tumor necrosis factor-а (ФНО-а) after adding the CAR-T lymphocytes to the cell lines expressing CD19, the specific exogenous tumor antigen, identified by immunoassay
0
• CD19-HeLa
• LNGFR-HeLa + CAR-
• CD19-HeLa + CAR-T
• CAR-T
9,6 14,4 19,2 24,0 28,8 33,6 38,4 43,2 Время, ч
Рис. 5. График зависимости нормализованного клеточного индекса от времени
Fig. 5. Normalized cell index-time curve
повышение уровня ИЛ-6 в 5,4 раза (p < 0,01), ИЛ-lß в 2,6 раза (p < 0,01), ИФН-у в 18,9 раза (p < 0,01). Уровень противовоспалительных цитокинов увеличился незначительно, разница в секреции цитокинов до и после добавления CAR T-клеток оказалась статистически незначима. Так, секреция ИЛ-4 и ИЛ-10 возросла в 1,1 и 1,9 раза соответственно (p > 0,05) (рис. 6).
В ходе данного исследования отмечено многократное увеличение продукции гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ). На линии HeLa уровень этого цитокина увеличился в 22,4 раза после добавления CAR T-клеток (рис. 7).
Для подтверждения полученных данных мы также провели инкубацию CAR T-клеток с CD^-позитивной линией А431 с последующим мультиплексным анализом, который также показал многократное увеличение уровня ГМ-КСФ в среде при добавлении CAR T-лимфоцитов. Уровень данного цитокина на опухолевой клеточной линии А431 увеличился в 7,6 раза (p < 0,01) (рис. 8).
При этом в эксперименте на данной клеточной линии отмечается тенденция к изменению уровня ци-токинов в целом, сходная с полученной на клеточной линии HeLa. Так, уровень ИЛ-6 повысился в 6,4 раза (p < 0,01), ИЛ-lß — в 3,2 раза (p < 0,01), ИФН-у —
CD19-HeLa
CD19-HeLa + CAR-T
CD19-A431
CD19-A431 + CAR-T
4500 4000 3500
л
t: 3000 с
ия, 2500 ц
а
тр 2000
1500 1000 500 0
ИФН-у ИЛ-^
ИЛ-10
ИЛ-4
ИЛ-6
о
250
200
150
100
50
Рис. 6. Изменение уровня цитокинов на клеточной линии HeLa после инкубации с CAR T-лимфоцитами и без таковой, выявленное методом мультиплексного анализа ИЛ — интерлейкин; ИФН-у — интерферон-у.
Fig. 6. Change in the cytokine levels on the HeLa cell line after incubation with CAR-T lymphocytes and without it, identified by multiplex assay ИЛ — interleukin; ИФН-у — interferon-y.
ГМ-КСФ
Рис. 8. Изменение уровня гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) на клеточной линии А431 после инкубации с CAR T-лимфоцитами и без таковой
Fig. 8. Change in the levels of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (ГМ-КСФ) on the А431 cell line after incubation with CAR-T lymphocytes and without it
0
CD19-HeLa
CD19-HeLa + CAR-T
CD19-A431
CD19-A431 + CAR-T
1200 г
1000
р
т н
е
о
70 г
60
50
800
600
400
200
ГМ-КСФ
Рис. 7. Изменение уровня гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) на клеточной линии HeLa после инкубации с CAR T-лимфоцитами и без таковой
Fig. 7. Change in the levels of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (ГМ-КСФ) on the HeLa cell line after incubation with CAR-T lymphocytes and without it
g 40 ци
а р
30
е
£ 20
10 0
ИФН-у ИЛ-^ ИЛ-4
ИЛ-6
ИЛ-10
Рис. 9. Изменение уровня цитокинов на клеточной линии A431 после инкубации с CAR T-лимфоцитами и без таковой, выявленное методом мультиплексного анализа ИЛ — интерлейкин; ИФН-у — интерферон-у.
Fig. 9. Change in the cytokine levels on the А431 cell line after incubation with CAR-T lymphocytes and without it, identified by multiplex assay ИЛ — interleukin; ИФН-у — interferon-y.
в 3,9 раза (р < 0,01). Секреция ИЛ-4 и ИЛ-10 на клеточной линии А431 увеличилась всего в 1,8 и 2,1 раза соответственно (р < 0,01) (рис. 9).
ОБСУЖДЕНИЕ
В нашем экспериментальном исследовании продемонстрировано значимое увеличение секреции провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-1^, ИФН-у) в ответ на добавление в опухолевую клеточную линию CAR T-лимфоцитов анти-CD19.
Как известно, секреция провоспалительных цитокинов является ключевым элементом в запуске и поддержании одного из главных угрожающих жизни осложнений CAR T-терапии — синдрома высвобождения цитокинов (СВЦ) [15]. Одним из основных цитокинов, ответственных за развитие СВЦ, является ИЛ-6. Блокада рецептора ИЛ-6 в клинической практике приводит к значительному снижению частоты возникновения и интенсивности проявлений синдрома [16]. Имеются сведения о существенном вкладе и ИЛ-1 в развитие СВЦ [17]. Используемые в настоящее время лечебные подходы (применение моно-клональных антител к ИЛ-6, ИЛ-1 и их рецепторам, глюкокортикоидов) обусловливают дополнительную токсичность терапии [18], а в ряде случаев они не способны предотвратить развитие развернутых форм СВЦ или тяжелых проявлений нейротоксичности и связанной с ними летальности [19, 20].
С другой стороны, к настоящему времени получены достаточные экспериментальные данные о влиянии на развитие СВЦ, другого, ранее не имевшего заслуженного внимания цитокина — ГМ-КСФ [21, 22]. Важно отметить, что в проведенном нами эксперименте отмечено многократное (в 7,6 и 22,4 раза на модифицированных опухолевых клеточных CD-позитивных линиях A431 и HeLa соответственно) повышение уровня ГМ-КСФ при добавлении CAR T-лимфоцитов анти-CDW в отсутствие клеток иного происхождения.
ГМ-КСФ представляет собой провоспалительный цитокин, принимающий участие в созревании и активации миелоидных клеток [23]. Роль ГМ-КСФ в патогенезе воспаления доказана для ряда воспалительных и аутоиммунных заболеваний [24]. Секреция данного цитокина может активировать миелоидные клетки in vivo, увеличивая тем самым системную иммунотоксичность [23]. Важным является и тот факт, что рецептор ГМ-КСФ высоко экспрессируется на клетках центральной нервной системы, а именно клетках микроглии, астроцитах, макрофагах, расположенных в головном мозге [25]. В одном из исследований показано, что более 80 % активированных CD4-позитивных CAR T-клеток экспрессируют ген CSF2, кодирующий ГМ-КСФ, однако точный механизм, объясняющий преобладание CAR T-клеток с ГМ-КСФ-положительным фенотипом, до сих пор остается не до конца ясным [26].
Было показано, что ГМ-КСФ может продуцироваться непосредственно активированными CAR T-лим-фоцитами [21] в отличие, например, от ИЛ-6 и ИЛ-1, секретируемых преимущественно клетками миело-идного происхождения [17, 27]. Повышение уровня
ГМ-КСФ наблюдалось уже менее чем через 4 ч после инкубации на опухолевой клеточной линии с CAR T-клет-ками. Это представляется фактором, способствующим секреции других провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-6, которые служат маркерами СВЦ [21]. Так, при добавлении ГМ-КСФ к CAR T-клеткам концентрация ИЛ-6 значимо возрастала. Напротив, при нейтрализации данного цитокина или блокировании рецептора ГМ-КСФ специфическими моноклональными антителами происходило ингибирование секреции ИЛ-6 [21]. Кроме того, показано, что нейтрализация ГМ-КСФ также приводила к снижению уровня таких провоспалительных цитокинов, как MCP-1 и ИЛ-8, и не оказывала значимого влияния на уровень фактора некроза опухолей-а, ИФН-у и ИЛ-10 [21]. Отмечается, что TALEN-опосредованная инактивация ГМ-КСФ в CAR T-лимфоцитах снижает секрецию ИЛ-6 клетками миелоидного происхождения и при этом не оказывает влияния на пролиферацию, активацию и эффективность CAR T-лимфоцитов [21]. Помимо этого, согласно одному исследованию, проведенному на ксеномодели острого лимфобластного лейкоза, нейтрализация ГМ-КСФ приводит к снижению CAR-T-опосредованной нейротоксичности, а применение CAR T-клеток анти-CD19, нокаутных по ГМ-КСФ, позволяет предотвратить такие проявления СВЦ, как потеря массы тела и энцефалопатия [22]. Авторы показали увеличение общей выживаемости у мышей с NALM6-клетками, получавших терапию CAR Т-клетками анти-CD19, нокаутными по ГМ-КСФ. Нейтрализация ГМ-КСФ с помощью специфического моноклонального антитела лензилумаба привела к повышению пролиферативной способности и функциональной активности CAR T-клеток, а использование ГМ-КСФ-дефицитных CAR T-клеток продемонстрировало увеличение общей выживаемости в сравнении с применением ГМ-КСФ-недефицитных CAR T-лимфоцитов [22]. Таким образом, данный цитокин представляет собой большой интерес для оценки активности CAR T-клеток как in vitro, так и в клинической практике в качестве раннего маркера СВЦ и как потенциальная мишень, воздействуя на которую можно добиться значимого снижения токсичности и повышения эффективности CAR T-терапии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Были получены CAR T-лимфоциты анти-CD19 с достаточной работоспособностью. Показано увеличение концентрации преимущественно провоспалительных цитокинов в отсутствие значимого повышения противовоспалительных цитокинов в ответ на добавление к CD19-позитивным клеточным эпителиальным линиям полученных CAR T-лимфоцитов анти-CD19. Выявлено многократное повышение уровня ГМ-КСФ, служащего одним из ключевых звеньев патогенеза СВЦ и CAR T-ассоциированной нейротоксичности.
КОНФЛИКТЫ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.
ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ
Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта РФФИ в рамках научного проекта № 18-31500049 и гранта РНФ № 19-75-10059.
ВКЛАД АВТОРОВ
Концепция и дизайн: Д.В. Зайцев, А.В. Петухов. Сбор и обработка данных: Д.В. Зайцев, Е.К. Зайкова, А.В. Петухов, А.А. Дакс.
Анализ и интерпретация данных: Д.В. Зайцев, Е.К., Зайкова А.В. Петухов.
Подготовка рукописи: Д.В. Зайцев, Е.К. Зайкова. Предоставление материалов исследования: Е.К. Зайкова, А.В. Петухов, А.С. Головкин, Э.Р. Булатов, А.Х. Валиуллина, Р.М. Миргаязова. Окончательное одобрение рукописи: А.В. Петухов, А.Ю. Зарицкий.
AMTEPATyPA/REFERENCES
1. Stenken JA, Poschenrieder AJ. Bioanalytical Chemistry of Cytokines - a review. Analyt Chim Acta. 2015;853:95-115. doi: 10.1016/j.aca.2014.10.009.
2. Zhang JM, An J. Cytokines, Inflammation and Pain. Int Anesthesiol Clin. 2007;45(2):27-37. doi: 10.1097/AIA.0b013e318034194e.
3. Xu XJ, Song DG, Poussin M, et al. Multiparameter comparative analysis reveals differential impacts of various cytokines on CART cell phenotype and function ex vivo and in vivo. Oncotarget. 2016;7(50):82354-68. doi: 10.18632/ oncotarget.10510.
4. DeRenzo C, Gottschalk S. Genetic Modification Strategies to Enhance CAR T Cell Persistence for Patients With Solid Tumors. Front Immunol. 2019;10:218. doi: 10.3389/fimmu.2019.00218.
5. Shimabukuro-Vornhagen A, Godel P, Subklewe M, et al. Cytokine release syndrome. J Immunother Cancer. 2018;6(1):56. doi: 10.1186/s40425-018-0343-9.
6. Schmidts A, Maus MV. Making CAR T Cells a Solid Option for Solid Tumors. Front Immunol. 2018;9:2593. doi: 10.3389/fimmu.2018.02593.
7. Martinez M, Moon EK. CAR T Cells for Solid Tumors: New Strategies for Finding, Infiltrating, and Surviving in the Tumor Microenvironment. Front Immunol. 2019;10:128. doi: 10.3389/fimmu.2019.00128.
8. Chinnasamy D, Yu Z, Kerkar SP, et al. Local delivery of interleukin-12 using T cells targeting VEGF receptor-2 eradicates multiple vascularized tumors in mice. Clin Cancer Res. 2012;18(6):1672-83. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-11-3050.
9. Kochenderfer JN, Feldman SA, Zhao Y, et al. Construction and Preclinical Evaluation of an Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor. J Immunother. 2009;32(7):689-702. doi: 10.1097/cji.0b013e3181ac6138.
10. Masters JR. HeLa cells 50 years on: the good, the bad and the ugly. Nat Rev Cancer. 2002;2(4):315-9. doi: 10.1038/nrc775.
11. Bortolomai I, Canevari S, Facetti I, et al. Tumor initiating cells: Development and critical characterization of a model derived from the A431 carcinoma cell line forming spheres in suspension. Cell Cycle. 2010;9(6):1194-206. doi: 10.4161/ cc.9.6.11108.
12. Sanjana NE, Shalem O, Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Meth. 2014;11(8):783-4. doi: 10.1038/nmeth.3047.
13. Milone M, Fish J, Carpenito C, et al. Chimeric Receptors Containing CD137 Signal Transduction Domains Mediate Enhanced Survival of T Cells and Increased Antileukemic Efficacy In Vivo. Mol Ther. 2009;17(8):1453-64. doi: 10.1038/ mt.2009.83.
14. Петухов A.B., Маркова B.A., Моторин Д.В. и др. Получение CAR T-лим-фоцитов, специфичных к CD19, и оценка их функциональной активности in vitro. Клиническая онкогематология. 2018;11(1):1-9. doi: 10.21320/2500-21392018-11-1-1-9.
[Petukhov AV, Markova VA, Motorin DV, et al. Manufacturing of CD19 Specific CAR T-Cells and Evaluation of their Functional Activity in Vitro. Clinical oncohema-tology. 2018;11(1):1-9. doi: 10.21320/2500-2139-2018-11-1-1-9. (In Russ)]
15. Yanez L, Sanchez-Escamilla M, Perales MA. CAR T Cell Toxicity: Current Management and Future Directions. HemaSphere. 2019;3(2):e186. doi: 10.1097/ HS9.0000000000000186.
16. Barrett DM, Teachey DT, Grupp SA. Toxicity management for patients receiving novel T-cell engaging therapies. Curr Opin Pediatr. 2014;26(1):43-9. doi: 10.1097/MOP.0000000000000043.
1l. Giavridis T, van der Stegen SJC, Eyquem J, et al. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by IL-1 blockade. Nat Med. 2018;24(6):731-8. doi: 10.1038/s41591-018-0041-7.
1S. Jones G, Ding C. Tocilizumab: A review of its safety and efficacy in rheumatoid arthritis. Clin Med Ins Arthrit Musculoskel Dis. 2010;3:81-9. doi: 10.4137/ cmamd.s4864.
19. Davila ML, Riviere I, Wang X, et al. Efficacy and toxicity management of 19-28z CAR T cell therapy in B cell acute lymphoblastic leukemia. Mol Ther. 2014;22:s295-s296. doi: 10.1016/s1525-0016(16)35779-3.
20. Hunter BD, Jacobson CA. CAR T-cell associated neurotoxicity: Mechanisms, clinicopathologic correlates, and future directions. J Nat Cancer Inst. 2019;111(7):646-54. doi: 10.1093/jnci/djz017.
21. Sachdeva M, Duchateau P, Depil S, et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor inactivation in CAR T-cells prevents monocyte-de-pendent release of key cytokine release syndrome mediators. J Biol Chem. 2019;294(14):5430-7. doi: 10.1074/jbc.AC119.007558.
22. Sterner RM, Sakemura R, Cox M, et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 2019;133(7):697-709. doi: 10.1182/blood-2018-10-881722.
23. Becher B, Tugues S, Greter M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 2016;45(5):963-73. doi: 10.1016/j. immuni.2016.10.026.
24. Wright HL, Bucknall RC, Moots RJ, et al. Analysis of SF and plasma cytokines provides insights into the mechanisms of inflammatory arthritis and may predict response to therapy. Rheumatology. 2012;51(3):451-9. doi: 10.1093/ rheumatology/ker338.
25. Donatien P, Anand U, Yiangou Y, et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor expression in clinical pain disorder tissues and role in neuronal sensitization. Pain Rep. 2018;3(5):e676. doi: 10.1097/ PR9.0000000000000676.
26. Xhangolli I, Dura B, Lee G, et al. Single-cell Analysis of CAR-T Cell Activation Reveals A Mixed TH1/TH2 Response Independent of Differentiation. Genom Proteom Bioinform. 2019;17(2):129-39. doi: 10.1016/j.gpb.2019.03.002.
2l. Singh N, Hofmann TJ, Gershenson Z, et al. Monocyte lineage-derived IL-6 does not affect chimeric antigen receptor T-cell function. Cytotherapy. 2017;19(7):867-80. doi: 10.1016/j.jcyt.2017.04.001.
