CC BY
127
ГОРМОНАЛЬНЫЙ СТАТУС И СОДЕРЖАНИЕ СВОБОДНЫХ
АМИНОКИСЛОТ
В ПЛАЗМЕ КРОВИ КРЫС C ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ГИПОТИРЕОЗОМ ПРИ ТЕПЛОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
ГЛИННИК С.В.. РИНЕЙСКАЯ О.Н.. РОМАНОВСКИЙ И.В..
КРАСНЕНКОВА Т.П.*
УО «Белорусский государственный медицинский университет» Центральная научно - исследовательская лаборатория *
Резюме. Исследовано влияние теплового стресса на гормональный статус и содержание свободных аминокислот в плазме крови крыс с экспериментальным гипотиреозом. Обнаружено. что тепловое воздействие (на протяжении 2 - х часов при t 40 - 42 ° C) вызывало выраженную стрессовую реакцию организма экспериментальных животных. о чем свидетельствовали полученные данные исследования поведенческих реакций в тесте «открытое поле». а также увеличение уровня кортизола в сыворотке крови. Тепловой стресс у эутиреоид-ных животных сопровождался возрастанием концентраций большинства исследуемых аминокислот. Экспериментальный гипотиреоз (употребление животными в качестве питья 0.02 % раствора ПТУ в течение 14 суток) сопровождался выраженным увеличением содержания в плазме крови крыс исследуемых аминокислот (особенно. триптофана. фенилаланина. аспарагиновой и глутаминовой кислот). При тепловом стрессе на фоне гипотиреоза наблюдалось снижение адаптационных возможностей организма экспериментальных животных. что проявлялось в повышении уровня трийодтиронина. инсулина. отсутствии адекватного изменения уровня кортизола в сыворотке крови экспериментальных животных. а также изменении аминокислотного состава плазмы крови (уменьшении содержания глутаминовой и аспарагиновой кислот. метионина. серина. треонина).
Ключевые слова: тепловой стресс. экспериментальный гипотире-
оз. гормональный статус. свободные аминокислоты.
Abstrakt. It was studied hormonal state and concentration of free amino acids in serum of the blood at rats with experimental hypothyroidism at thermal stress. Thermal affect caused the expressed stress reaction at experimental animals (increasion of rectal temperature after thermal stress on 2.8 - 3.1 ° C. increasion of the corticosteroid hormones level in serum of the blood at rats with normal thyroid status). There was an increasion of the concentration of the most researching amino acides. It was observed increasion the level of tryptophan. phenylalanine. acparaginic acid and glutamic acid in serum of the blood at rats with experimental hypothyroidism. It was observed lowering possibility of adaptation of rats with experimental hypothyroidism at thermal stress (decreasion the level of the corticosteroid hormones and concentration of glutamic acid. acparaginic acid. methionine. serine. threonine in serum of the blood. increasion the level of insulin and T3).
Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь. 220116. г. Минск. пр. Дзержинского. д.83. БГМУ. кафедра биоорганиче-ской химии. тел. р. (017)297-65-74; м.т. 8029-393-71-81. 8-029-682-14-37; email ry-neiskaya@mail.ru - Ринейская О.Н.
Стресс является неотъемлемой частью повседневной жизни человека. Биологическая сущность этого состояния заключается прежде всего в усилении деятельности приспособительных механизмов. адаптирующих организм к новым условиям существования [1]. Однако сильный или слишком продолжительный стресс становится потенциально опасным для здоровья [2]. Известно. что стресс - реакции реализуются через систему механизмов. в которых особое место занимает эндокринная система. За последние годы накоплен значительный экспериментальный и клинический материал. свидетельствующий о том. что тиреоидный статус организма имеет важное значение в реализации адаптационно - приспособительных реакций. Тироксин и трийодтиронин способны мобилизовать резервы организма и тем самым участвовать в устранении нарушений гомеостаза. вызванных действием стрессового фактора. Так. работами Городецкой И.В.и соавт. показано. что в условиях гипотиреоза устойчивость организма к воздействию различных неблагоприятных факторов значительно снижается. Подавление функции щитовидной железы мерказолилом у экспериментальных животных предупреждало реализацию защитных эффектов адаптации короткими сеансами гипобарической гипоксии при острой гипоксии [3]. Также было обнаружено. что тиреоидный статус организма имеет существенное значение в развитии адаптационных эффектов при тепловых тренировках. ограничивающих гипертермию. ульцерацию слизистой оболочки желудка. изменения относительной массы надпочечников и селезенки. концентрации гормонов и метаболитов в крови. вызванные тепловым стрессом. [4]. Поскольку гормоны щитовидной железы имеют непосредственное отношение к регуляции температурного гомеостаза. то особенно важна их роль в реализации стресс
- реакции на тепловое воздействие [5. 6]. Учитывая также высокую распространенность врожденного и приобретенного гипотиреоза в Республике Беларусь. нам представляется целесообразным изучение особенностей формирования ответной реакции организма на стрессовое воздействие теплового фактора в условиях недостаточного содержания тиреоидных гормонов.
Актуальным и важным является также исследование аминокислотного состава тканей. поскольку аминокислоты не только являются структурными компонентами пептидов и белков. но и участвуют в синтезе многих эндогенных биологически активных соединений. некоторых гормонов. нейромедиаторов. Обмен аминокислот контролируется различными биохимическими и физиологическими механизмами. определяющими относительно постоянные концентрации аминокислот в крови и тканях. Поскольку аминокислотам также принадлежит роль посредников. связывающих между собой основные метаболиче-
ские пути - гликолиз. цикл Кребса. глюконеогенез - исследование аминокислотного состава плазмы крови может служить интегральным показателем функционального состояния регуляторных систем организма.
Целью настоящего исследования явилось изучение гормонального статуса и содержания аминокислот в плазме крови крыс с экспериментальным гипотиреозом при тепловом воздействии.
Материалы и методы
Работа выполнена на 48 белых крысах-самцах массой 180 - 200 г. содержавшихся на обычном рационе вивария БГМУ. Исследование включало 2 серии экспериментов. В 1 - й серии (16 животных) оценивалась степень выраженности теплового стресса по нарушению индивидуального поведения экспериментальных животных в тесте «открытое поле» [7]. Тепловой стресс вызывался путем помещения животных на 2 часа в суховоздушный термостат при 1 40 - 42 °С. Для оценки степени выраженности теплового стресса измеряли ректальную температуру при помощи электротермометра. Во 2 - й серии экспериментов животные (32 крысы) были разделены на 4 группы (по 8 особей): 1 - я группа (контроль) - интактные крысы. получавшие на протяжении эксперимента (14 суток) обычную воду; 2 - я группа (стресс) - крысы. получавшие на протяжении двух недель обычную воду и на 14 - е сутки подвергнутые тепловому стрессу; 3
- я группа (гипотиреоз) - крысы с экспериментальным гипотиреозом. который создавался при употреблении в качестве питья 0.02 % раствора пропилтиоура-цила (ПТУ) в течение 14 суток из поилок при постоянном доступе (0.78 мг ПТУ на 100 г массы тела в сутки); 4 - я группа (гипотиреоз + стресс) - крысы с экспериментальным гипотиреозом. подвергнутые на 14 - е сутки тепловому стрессу.
Животные умерщвлялись под тиопенталовым наркозом (60 - 80 мг/кг) забором крови из сонной артерии. Плазму получали центрифугированием гепа-
о
ринизированной крови при 1500 об/мин и 4 С в течение 15 минут. Кровь для исследования гормонального статуса забиралась в пробирку без консерванта и через 2 часа центрифугировалась в течение 10 минут при 1500 об/мин для получения сыворотки. У животных также забирали щитовидную железу. массу которой измеряли взвешиванием на электронных весах (Госметр. Россия). Содержание в сыворотке крови тироксина. трийодтиронина. кортизола и инсулина определялось методом радиоиммунного анализа с использованием наборов производства ИБОХ НАН Беларуси. Для анализа аминокислот (глицина. гистидина. таурина. серина. треонина. триптофана. фенилаланина. метионина. аргинина. аспарагиновой и глутаминовой кислот) в плазме крови использовался метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Подготовка образцов плазмы к ВЭЖХ и дериватизация аминокислот производилась по методу. описанному нами ранее [8]. Статистическая обработка выполнена с помощью програмного пакета 81айв11са 6.0. Полученные данные в таблицах представлены как медиана и 50 % интерквартильный размах. Для оценки достоверности различий между группами использовался тест Манна - Уитни (достоверными считались различия при р < 0.05).
Результаты и их обсуждение
Тепловой стресс. вызванный в указанных условиях. отличался значительной выраженностью. Ректальная температура экспериментальных животных. измеренная непосредственно после теплового воздействия. повысилась на 2.8 -3.1 ° С. О выраженности стресса судили по поведению животных в тесте «открытое поле». В ходе проведения теста было обнаружено снижение на 59.5 % двигательной активности (которая оценивалась по горизонтальной подвижности). на 41 % ориентировочно - исследовательской активности (этот показатель представлял собой сумму показателей вертикальной подвижности и исследования «норок») и снижение в 3.7 раза эмоциональности. При изучении гормонального статуса при тепловом стрессе у экспериментальных животных (табл.1) было обнаружено повышение уровня кортизола в сыворотке крови крыс на 23.5 %. Уровень инсулина в сыворотке крови крыс при тепловом стрессе снижался по сравнению с контрольной группой на 20.3 %. Отмечалась тенденция к снижению уровней гормонов щитовидной железы - трийодтиро-нина на 11.1 % и тироксина - на 8.7 %. Таким образом. полученные результаты свидетельствуют о значительной выраженности стресс - реакции организма на тепловое воздействие. так как согласно данным литературы [9] выраженность стрессорной реакции у крыс прямо пропорциональна эмоциональности и обратно пропорциональна величинам двигательной и ориентировочно - исследовательской активности.
Таблица 1
Гормональный статус крыс при тепловом стрессе, экспериментальном гипотиреозе и тепловом стрессе на фоне гипотиреоза
Группа животных Гормоны
Трийодтиро- нин, нмоль/л Тироксин, нмоль/л Кортизол, нмоль/л Инсулин, пмоль/л
Контроль 0.90 (0.72-1.20) 32.0 (26.0-37.1) 17.0 (10.0-21.0) 61.5 (54.0-90.0)
Стресс 0.80 (0.71-0.90) 2) 29.2 (29.0-31.1) 2) 21.0 (17.0-24.0) 2) 49.0 (34.0-53.0) 1)
Гипотиреоз 0.23 (0.18-0.28) 1) 2) 3.4 (2.9-3.5) 1) 10.0 (8.1-14.0) 21.5 (16.5-26.5) 1) 2)
Гипотиреоз + стресс 0.47 (0.40-0.69) 1) 3.0 (2.5-3.4) 1) 10.0 (9.0-16.0) 39.0 (29.0-44.0)
1) - различия достоверны по сравнению с группой контроля (р < 0.05)
2) - различия достоверны по сравнению с группой «гипотиреоз + стресс» (р <
0.05)
Для исследования реакции организма на тепловое стрессовое воздействие в условиях пониженного содержания гормонов щитовидной железы нами использовалась разработанная на кафедре биоорганической химии совместно с лабораторией экспериментальной медицины. фармакологии и токсикологии ЦНИЛа БГМУ пропилтиоурациловая модель гипотиреоза. [10]. Меха-
низм развития гипотиреоза обусловлен тем. что ПТУ ингибирует образование тиреоидных гормонов. главным образом. на этапе органификации йода - включения йода в тирозильные фрагменты тиреоглобулина [11]. Это обусловлено прямым ингибирующим действием на тиреопероксидазу. осуществляющую активацию йода и процесс йодирования ароматических колец тирозина в составе тиреоглобулина. ПТУ также ингибирует реакцию конъюгации моно - и дийод-тирозинов. ведущую к образованию йодтиронинов в составе тиреоглобулина. которая является заключительной стадией образования предшественников активных гормонов щитовидной железы. Кроме того. ПТУ обладает способно-
I
стью ингибировать 5-дейодиназы периферических тканей. которые катализируют превращение тироксина в трийодтиронин. Развитие гипотиреоза к 14 - м суткам приема 0.02 % - го раствора ПТУ подтверждалось снижением уровня тироксина на 89 %. трийодтиронина на 74 %. а также достоверным увеличением весового коэффициента щитовидной железы у крыс в 1.8 раза. Так. относительная масса щитовидной железы увеличилась с 0.10 (0.09 - 0.12) мг/кг (группа контроля) до 0.18 (1.16 - 0.21) мг/кг. Гипотиреоз у экспериментальных животных сопровождался также достоверным снижением в сыворотке крови уровня инсулина на 65 % и отмечалась тенденция к снижению концентрации кортизола.
При тепловом воздействии на животных с экспериментальным гипотиреозом было обнаружено увеличение содержания трийодтиронина более чем в 2 раза по сравнению с группой «гипотиреоз». Уровень кортизола был снижен на 41.2 % относительно контрольной группы и достоверно не отличался от аналогичного показателя в группе «гипотиреоз». Содержание инсулина в сыворотке крови гипотиреоидных крыс. подвергавшихся тепловому воздействию. превышало на 81.4 % уровень данного показателя у животных с экспериментальным гипотиреозом.
Результаты исследования содержания аминокислот в плазме крови эутиреоидных крыс (табл. 2) указывают на повышение концентраций большинства из них на 10 - 90 % в ответ на тепловой стресс.
Таблица 2
Содержание аминокислот (мкмоль/л) в плазме крови крыс при тепловом стрессе, экспериментальном гипотиреозе и при тепловом стрессе на фоне
гипотиреоза
Аминокис- лота Группа животных
Контроль Тепловой стресс Гипотиреоз Гипотиреоз + Тепловой стресс
Аспараги- новая кислота 17.5 (11.2-18.9) 24.4 (21.9-27.8)1)2) 82.0 (76.8-91.1)1)2) 49.8 (45.7-57.1)1)
Глутами- новая кислота 52.1 (40.6-58.7) 64.9 (62.6-67.4)1)2) 130.8 (127.2-134.4)1)2) 50.3 (46.9-61.6)
Аминокис- лота Группа животных
Контроль Тепловой стресс Гипотиреоз Гипотиреоз + Тепловой стресс
Серин 221.5 (213.5-227.2) 244.2 (237.1-269.8)1)2) 208.8 (195.9-218.1)2) 156.5 (140.1-161.5)1)
Гистидин 430.0 (424.1-453.5) 477.2 (460.7-510.6)1) 448.5 (420.3-474.9)2) 523.3 (501.5-577.9)1)
Аргинин 178.9 (173.9-186.8) 141.1 (133.6-154.6)1)2) 179.8 (173.4-192.2) 194.4 (181.7-235.1)
Таурин 111.5 (99.6-122.1) 97.5 (84.6-101.7)2) 157.8 (151.0-184.5)1)2) 219.9 (189.9-240.0)1)
Метионин 89.2 (85.3-92.4) 121.0 (112.2-128.5)1)2) 252.6 (247.8-280.2)1)2) 154.5 (146.2-183.3)1)
Фенилала- нин 57.9 (57.3-59.2) 99.2 (94.7-104.7)1)2) 152.5 (141.4-167.9)1) 140.8 (128.1-155.4)1)
Глицин 196.8 (189.2-202.9) 199.1 (194.4-215.9)2) 241.9 (226.9-257.2)1) 297.5 (248.5-306.9)1)
Треонин 101.2 (87.0-103.6) 124.6 (113.0-130.5)1) 186.6 (151.5-194.6)1)2) 116.1 (92.8-143.3)
Триптофан 14.9 (12.2-17.0) 28.4 (24.2-32.8)1)2) 76.5 (71.8-83.9)1) 64.9 (62.9-75.5)1)
1) - различия достоверны по сравнению с группой контроля (р < 0.05)
2) - различия достоверны по сравнению с группой «гипотиреоз + стресс» (р < 0.05)
Экспериментальный гипотиреоз у животных сопровождался увеличением содержания в плазме исследуемых аминокислот. Так. концентрации аспарагиновой и глутаминовой кислот. относящихся к возбуждающим. возрастали в 4.7 и 2.5 раз; серосодержащих аминокислот - таурина и метионина - на 41 % и в 2.8 раз соответственно; глицина. треонина и фенилаланина - на 23 %. 84 % и 160 %. Особенно значительным было увеличение содержания в плазме крови крыс триптофана - в 5.1 раза по сравнению с группой контроля. По данным литературы при дисбалансе тиреоидных гормонов происходят изменения процессов синтеза и распада серотонина - нейромедиатора. предшественником которого является триптофан [12. 13].
Тепловой стресс на фоне гипотиреоза вызывал разнонаправленные изменения содержания исследуемых аминокислот в плазме крови экспериментальных животных. однако концентрации большинства из них снижались по сравнению с аналогичными показателями в группе «гипотиреоз». Содержание аспарагиновой и глутаминовой кислот уменьшалось на 39.2 % и 61.5 %; метионина - на 38.8 %. Концентрации гидроксилсодержащих аминокислот - се-рина и треонина - снижались на 25 % и 37.8 % соответственно. В то же время было обнаружено достоверное увеличение содержания в плазме крови крыс гистидина на 16.8 %. таурина - на 39.3 %. Достоверных изменений концентра-
ций аргинина. триптофана. глицина и фенилаланина в плазме крови гипотирео-идных животных. подвергнутых тепловому стрессу. не было выявлено.
Обсуждая полученные результаты. следует отметить. что состояние аминокислотного фонда зависит от большого количества различных факторов. к числу важнейших из них относятся: экзогенное поступление аминокислот в организм с пищей. активность процессов синтеза и распада белков. реакции метаболизма аминокислот (декарбоксилирование. трансаминирование. окислительного дезаминирование) и др. [14. 15]. Учитывая условия содержания животных. следует считать. что питание крыс различных экспериментальных групп было равноценным по аминокислотному составу. и на изменения концентраций в сыворотке крови различных аминокислот в нашем эксперименте данный фактор не оказывал влияния.
Согласно Селье Г.. одним из механизмов стрессорного повреждения органов и тканей является преобладание процессов гидролиза белков над скоростью их ресинтеза. обусловленное гормональным дисбалансом с преобладанием «катаболических» гормонов [16]. Тепловой стресс. который создавался в нашем эксперименте (1 40 - 42 ° С. 2 часа). отличался достаточной выраженностью и сопровождался выбросом кортизола и снижением уровня инсулина в сыворотке крови экспериментальных животных. Полученные результаты указывают на изменение соотношения «катаболических» и «анаболических» гормонов. что может являться причиной увеличения содержания в плазме крови крыс большинства исследуемых аминокислот в ответ на тепловое воздействие.
При тепловом стрессе на фоне экспериментального гипотиреоза у животных не были обнаружены закономерные для стресса изменения гормонального статуса: уровень кортизола достоверно не отличался от аналогичного показателя у гипотиреоидных крыс. не подвергавшихся стрессу. а содержание инсулина в сыворотке крови увеличилось на 81.4 %. Представляется важным отметить обнаруженное нами возрастание уровня трийодтиронина в сыворотке крови ги-потиреоидных крыс. подвергшихся тепловому воздействию - гормона. имеющего непосредственное отношение к термогенезу. Увеличение его концентрации при тепловом воздействии. возможно. свидетельствует о нарушении компенсаторных возможностей регуляторных систем организма экспериментальных животных. А уменьшение содержания в плазме крови большинства исследованных аминокислот при тепловом воздействии на фоне гипотиреоза. вероятно. является следствием отсутствия сбалансированного ответа со стороны эндокринной системы.
Заключение
1. Тепловое воздействие (на протяжении 2 - х часов при 1 40 - 42 ° С) вызывало выраженную стрессовую реакцию организма экспериментальных животных. о чем свидетельствовали полученные данные исследования поведенческих реакций в тесте «открытое поле». а также увеличение уровня кортизола в сыворотке крови. Тепловой стресс у эутиреоидных животных сопровождался возрастанием концентраций большинства исследуемых аминокислот.
2. Экспериментальный гипотиреоз (употребление животными в качестве питья 0.02 % раствора ПТУ в течение 14 суток) сопровождался выраженным
увеличением содержания в плазме крови крыс исследуемых аминокислот (особенно. триптофана. фенилаланина. аспарагиновой и глутаминовой кислот).
3. При тепловом стрессе на фоне гипотиреоза наблюдалось снижение адаптационных возможностей организма экспериментальных животных. что проявлялось в повышении уровня трийодтиронина. инсулина. отсутствии адекватного изменения уровня кортизола в сыворотке крови экспериментальных животных. а также изменении аминокислотного состава плазмы крови (уменьшении содержания глутаминовой. аспарагиновой кислот. метионина. серина. треонина).
Литература
1. Горизонтов. П. Д. Роль АКТГ и кортикостероидов в патологии / П. Д. Горизонтов. Т. Н. Протасова. - М: Медицина. 1968. - 335 с.
2. Меерсон. Ф. З. Генерализованное накопление стресс - белков при адаптации организма к стрессорным воздействиям / Ф. З. Меерсон. И. Ю. Малышев. А. .В. Замотринский // Бюл. эксперим. биолог. и медицины. -1993. - Т.116. № 9. - С. 231 - 233.
3. Лаврова. О. В. Зависимость протекторных эффектов адаптации к гипоксии от тиреоидного статуса организма / О. В. Лаврова. О. Г. Величинская.. И. В. Городецкая // Теоретические и практические вопросы медицины и фармации: материалы конф. студентов и молодых ученых. - Витебск: ВГМУ. 2000. -С. 49 - 51.
4. Городецкая. И. В. Зависимость эффективности адаптации к теплу от тиреоидного статуса организма / И. В. Городецкая // Весщ НАН Беларусь Сер. б1ял. навук. - 2000. - № 3. - С. 109 - 113.
5. Султанов. Ф. Ф. Гормональные механизмы температурной адаптации / Ф Ф. Султанов. В. И. Соболев. - Ашхабад: Ылым. 1991. - 216 с.
6. Edelman. M. D. Thyroid thermogenesis and active sodium transport / M. D. Edelman.. F. Ismail - Beigi // Recent Progress in Hormone Res. - 1974. - Vol. 30. - P. 235 - 257.
7. Бородин. П. М. Проблемы генетики стресса. Генетический анализ поведения мышей в стрессирующей ситуации / П. М. Бородин. Л. Н. Шюлер. Д. К. Беляев // Генетика. - 1976. - T. 12. № 12. - С. 62 - 70.
8. Красненкова. Т. П. Использование ВЭЖХ с диодно-матричным детектированием для определения концентрации аминокислот в плазме крови крыс / Т. .П. Красненкова. О. Н. Ринейская // Труды молодых ученых БГМУ: сб. работ. - Минск: БГМУ. 2005. - С. 73 - 77.
9. Archer. J. Test for emotionality in rats and mice. a review / J. Archer // Animal Behaviour. - 1973. - Vol. 205. - P. 113 - 121.
10. Щитовидная железа / под ред. А. И. Кубарко. - Минск - Нагасаки. 1998. - 368 с.
11. Сооper, D. S. Antityroid drugs / D. S. Сооper // N. Engl. Med. - 1984. -Vol. 311. - P. 1353 - 1362.
12. Сапронов. Н. С. Гормоны гипоталамо - гипофизарно - тиреоидной системы и мозг / Н. С. Сапронов. Ю. О. Федотова. - Санкт - Петербург: Лань. 2002.- 156 с.
13. Effects of triiodothyronine and imipramine on basal 5 -HT levels and 5 -HT1 autoreceptor activity in rat cortex / E. Gur [at al.] // European Journal of Pharmacology. - 2002. - P. 37 - 43.
14. Holden. J. T. Amino Acid Pools / J. T. Holden. - Amsterdam: Elsevier. 1962. - 815 p.
15. Amino Acid (Chemistry. Biology. Medicine) / eds. C. Lubec.
J. A. Rosental. - N.Y.: Escom. 1990. - 1196 p.
16. Селье. Г. Стресс без дистресса / Г. Селье. - М.: Прогресс. 1982. -
122 с.
