CC BY
78
ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ НАСЕКОМЫХ
I Н.М. Кутузова, Д.Д. Девятников, Е.А. Яныкина
Аннотация. Согласно современным представлениям,, регуляторное действие почти всех гормонов в организме животных осуществляется за счет управления активностью определенных ферментных систем, реализующих в клетках-мишенях специфические физиологические и биохимические эффекты этих сигнальных веществ. Возрастание ферментативной активности может быть следствием как активации уже существующих энзимов, так и синтеза ферментативных белков de novo. В настоящем сообщении подведены итоги многолетних исследований воздействия различных гормонов на активность основных ферментных систем насекомых.
Ключевые слова: насекомые, гормоны, ферменты, регуляция иммунитет.
Summary. According to modern concerns regulative action of almost all hormones manages of activity of definite enzyme systems which activate specifically physiological and biochemical effects of these substances in target-cell in insects organism. Increase of enzymatic activity may be as a result of both activation of current existing enzymes and a synthesis of enzymatic proteins de novo. This article is a result ofseveral years researches about different hormones on basic enzyme systems of insects.
Keywords: insects, hormones, enzymes, regulation, immunity.
Современная эндокринология насекомых стала источником оригинальных подходов к пониманию молекулярных механизмов роста, развития, дифференцировки и морфогенеза представителей этого самого многочисленного и своеобразного класса животных.
Независимо от структурных особенностей и молекулярных механизмов действия, гормоны прямо или косвенно могут затрагивать генетическое звено регуляции — влияние на процессы транскрипции, а затем трансляции в гормон — компетентных тканях. Предполагается, что влияние гормонов — индукторов на экспрессию генов осуществляется на разных стадиях биосинтеза РНК и белка. Так,
наряду со стимуляцией транскрипции гормоны могут влиять на интенсивность полиаденилирования мРНК, 207 скорость транспорта мРНК из ядер в цитоплазму, на прохождение трансляции, а также посттрансляционные процессы в клетках. На транскрипци-онно-трансляционном уровне, а также в процессе посттрансляционной модификации может осуществляться и репрессия синтеза белков [1, 7].
Исследования, проводимые в последнее время молекулярными биологами, физиологами, биохимиками и генетиками, позволили расшифровать структуру многих гормонов насекомых, разработать методы их количественного анализа, выяснить пути метаболизма, установить связь гормонов с
208
экспрессией генов. Так, большой интерес представляют сведения о наличии у насекомых антибактериальных оли-гопептидов, нетоксичных для млекопитающих, в том числе и человека, и проявляющих активность против некоторых вирусов, микробов и бактерий. Установлено взаимодействие антибактериальных пептидов с белками теплового шока, а также их влияние на АТФазную, галактозидазную и фосфа-тазную активность [2, 1332; 3, 178]. Новые антибактериальные пептиды насекомых могут стать альтернативой современным антибиотикам, против большинства которых бактерии уже приобрели устойчивость.
В настоящем сообщении подведены итоги многолетних исследований воздействия пептидных, стероидных и ювенильных гормонов на активность дегидрогеназного, эстеразного, фосфатазного комплексов ферментов и других энзиматических систем как хозяйственно-ценных видов, так и насекомых-вредителей в видовом, тканевом и онтогенетическом аспектах; а также расшифровка механизмов гормональной регуляции отдельных множественных форм ферментов на уровне транскрипции, трансляции и рецепции.
Координация постэмбрионального развития насекомых, а также наступление метаморфоза контролируется взаимодействием нескольких гормональных систем. Согласно концепции гормонального кода, непосредственным сигналом, запускающим постэмбриональное развитие насекомых, служит выделение активацион-ного проторакотропного гормона (ПТТГ), деятельность которого, в свою очередь, контролируется нейро-пептидами мозга [4, 155]. Далее в гор-
мональном контроле прохождения линек участвуют экдистероны, вызывающие наступление метаморфоза, ювенильные гормоны, определяющие ее характер, а также ряд полифункциональных пептидных гормонов и биогенных аминов, выполняющих го-меостатические и адаптационные функции.
Наиболее многочисленную и вариабельную группу гормонов насекомых представляют пептиды, участвующие в контроле постэмбрионального развития, гомеостаза, поведенческих реакций, иммунитета и репродукции [5].
Известно, что у позвоночных животных нейропептиды вместе с другими регуляторными соединениями образуют функционально непрерывную систему, полифункциональный континуум, каждый гормон в которой обладает своеобразным комплексом биохимических активностей [6, 296]. У насекомых также существует сложная иерархическая система, в которой одни нейропептиды индуцируют или подавляют секрецию других олигопептидов. Особенно отчетливо это прослеживается на семействе гормонов, контролирующих стероидогенез.
Один из биохимических аспектов эндокринного контроля линьки и метаморфоза связан у насекомых с гормональной регуляцией метаболизма тирозина, поскольку как в образовании новой кутикулы, так и в ее склеротиза-ции, пигментации и меланизации принимают участие производные этой аминокислоты. Несомненно, что активность монофенол-монооксигеназы (МФМО) насекомых находится под контролем пептидных, стероидных и ювенильных гормонов, однако в связи с неясной и сложной картиной ее про-
теолитической активации исследование механизма гормональной регуляции активности ферментов обмена тирозина у насекомых в течение длительного времени было затруднено.
Для изучения гормональной регуляции активности МФМО, тирозина-минотрансферазы (ТАТ) и тирозинде-карбоксилазы (ТДК) необходимо зна-
фазы развития
а49о. комнатная муха
0 ь
1
ф
а ф
А
'490 5.0 ■
2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
тутовый шелкопряд
ние динамики активности перечисленных ферментов в процессе развития насекомых. Поэтому первоочередной задачей настоящего исследования явилось изучение активности названных ферментов в онтогенезе двух видов насекомых, принадлежащих к различным отрядам — Díptera и Lepidoptera — комнатных мух и тутового шелкопряда соответственно.
В результате проведенной работы удалось показать, что изменение активности МФМО, ТАТ и ТДК в онтогенезе исследованных тест-объектов видо-, фазо- и тканеспецифично.
Проведенный субстратный и ин-гибиторный анализ, а также данные изоэлектрофокусирования, определения молекулярных масс и ^ частично очищенной МФМО чувствительной и резистентной к фталофосу расы комнатных мух позволили сделать вывод о количественном преобладании у устойчивой расы активированного трипсином фермента с молекулярной
ТДК (в нг тирамина в мин на мг белка), 2Д0
- ТАТ (в нмолях n-гидроксибензальдегида в мин на мг белка),
МФМО (в ед. aA490 в мин на мг белка х102).
г± .......^
t I I_I_l_J_I_|_|_I_I_|__|_I_I_I_1.1 I_I_I_I , "Г I_I_I_I_£_I_I_I_11,1
2 4 12 1 — I —L п _1_
2 4 2 4 III _1_ IV
2 4 12 —I V-
6 8 10
куколка
Рисунок 1
Динамика активности монофенол-монооксигеназы, тирозинаминотрансферазы и тирозиндекарбоксилазы в онтогенезе комнатных мух и тутового шелкопряда
массой 360 кДа, в результате чего увеличивается скорость окисления п-ди-фенолов и, следовательно, возрастает степень склеротизации кутикулы (табл. 1).
Субстратная специфичность и константы Михаэлиса МФМО чувствительной и резистентной к фталофосу расы комнатных мух
Активность МФМО выражена в ед. дА4д0/мин/мг белка х 102.
Один из биохимических аспектов эндокринного контроля у насекомых связан с гормональной регуляцией энергетического обмена. Установлено, что поступление различных энергетических веществ из депонирующих органов и тканей на разных этапах жизни насекомых реализуется при участии пептидных гормонов, посредством контроля активности ключевых ферментов углеводного и ли-пидного обменов [7, 93].
При изучении функций пептидных гормонов удалось показать, что адипо-кинетический гормон (АКГ) и пента-
пептид проктолин принимают активное участие в энергетическом обмене насекомых посредством регуляции соответствующих ферментов как в жировом теле, так и, в большей мере, в грудных мышцах [8]. Причем, деятельность адипокинетических гормонов затрагивает как анаэробный, так и аэробный обмен углеводов исследованных насекомых. Полученные данные сравнительного биохимического исследования эффекта структурно сходных Ьош-АКГ II и Scg-АКГ II (табл. 2) показали, что второй из гормонов является наиболее активным по отношению к тестируемым ферментам имаго американского таракана.
Учитывая тот факт, что биогенные амины влияют на секрецию АКГ и мобилизуют внутренние резервы организма для поддержания энергетического баланса в состоянии стресса и при двигательной активности насекомых в первые минуты полета [9, 567; 10, 1110], было исследовано воздействие Scg-АКГ II и октопамина
Таблица 1
210 Субстратная специфичность и константы Михаэлиса МФМО чувствительной и резистентной к фталофосу расы комнатных мух
Субстраты Раса,чувствительная к фталофосу Раса, резистентная к фталофосу
Активность МФМО Активность МФМО
Кт (мМ) Кт (мМ)
Монофенолы
Тирозин 11,53±0,36 1,33±0,32
Тирамин 12,82±0,38 12,00±0,39
о-Дифенолы
ДОФА 0,47 523±10,98 0,38 750±18,75
Дофамин 0,40 2073±58,04 0,34 2676±53,52
Пирокатехин 42,36±1,22 49,57±1,28
п-Дифенолы
Гидрохинон 0,91 36,75±1,17 0,33 90,00±3,06
Активность МФМО выражена в ед.дА490/мин/мг белка х 10
2
на активность дегидрогеназного комплекса ферментов жирового тела и грудных мышц американского таракана и установлено, что совместная инъекция АКГ и биогенного амина превышала стимулирующий эффект отдельно взятых для опыта препаратов. Не исключено, что при совместном введении гормонов происходит усиление их биохимического эффекта и октопамин в этих опытах может выступать в роли синергиста АКГ (рис. 2).
Для подтверждения гипотезы об участии энкефалинов в энергетическом обмене, было исследовано влияние опиоидных пептидов на активность ферментов углеводного и липид-ного обменов у имаго мучного хрущака и американского таракана (табл. 3). Установлено, что биохимический эффект испытанных опиоидных гормонов характеризуется видовой и тканевой специфичностью и сопровождается гормональной индукцией активности дегидрогеназ и кислой фосфатазы,
Таблица 2
Влияние Lom-АКГ II и Scg-АКГ II на активность -ГФДГ и ЛДГ жирового тела и грудных мышц имаго Periplaneta americana
ОЭП форм ферментов Активность фермента в условных единицах Эффект, %
Контроль L S L S
а-глицерофосфатдегидрогеназа
Жировое тело
0,33 24,06 ±0,44 39,01 ±0,65 46,88 ±0,53 +62,1 +94,8
0,46 15,51 ±0,68 27,87 ±0,13 20,24 ±0,42 +79,7 +30,5
Суммарная активность 39,57 66,88 67,12 +69,0 +69,6
Грудные мышцы
0,35 10,70 ±0,24 27,01 ±1,79 35,89 ±0,31 + 152,4 +225,4
0,41 2,96 ±0,05 7,87 ±0,12 13,65 ±0,55 + 165,9 +361,1
Суммарная активность 13,66 34,88 49,54 + 155,3 +262.7
Лактатдегидрогеназа
Жировое тело
0,20 2,60 ±0,07 6,49 ±0,31 7,23 ±0,11 + 149,6 + 178,1
0,30 6,03 ±0,14 11,68 ±0,20 14,20 ±0,36 +93,7 + 135,5
0,45 20,88 ±0,36 31,58 ±0,81 39,06 ±0,48 +51,2 +87,1
Суммарная активность 29,51 49,75 60,49 +68,6 + 105,0
Грудные мышцы
0,12 3,02 ±0,27 11,17 ±0,53 35,91 ±0,29 +269,9 +426,8
0,20 15,74 ±0,50 17,48 ±0,67 28,49 ±0,97 + 11,1 +81,0
0,37 8,08 ±0,51 21,17 ±0,85 39,61 ±1,53 + 162,0 +390,2
Суммарная активность 26,84 49,82 84,01 +85,6 +213.0
211
Примечание: L - Lom-АКГ II; S - Scg-АКГ II. 3/ 2009
Преподаватель ^
Рисунок 2
Сравнительное исследование влияния Scg-АКГ II и октопамина на активность ферментов дегидрогеназного комплекса жирового тела и грудных мышц имаго Periplaneta americana
212
отдельные молекулярные формы которых синтезируются de novo.
Эстеразы насекомых представляют большую группу ферментов, вовлеченных в широкий круг метаболических процессов [11]. В последнее десятилетие, характеризующееся быстрым прогрессом в изучении биохимии гормонов насекомых, их метаболизма и механизма действия, возник значительный интерес к исследованию эс-
тераз, вовлеченных в регуляцию титра эндогенных ювенильных гормонов и дезактивацию экзогенных ювенои-дов, получающих все большее распространение в качестве инсектицидов.
Учитывая, что наиболее ярко выраженной отзывчивостью к действию АЮГ обладала высокоподвижная при электрофорезе в полиакриламидном геле карбоксилэстераза куколок большого мучного хрущака, была разрабо-
Таблица 3
Влияние мет-, ала-, и лей-энкефалинов на активность дегидрогеназного комплекса ферментов в жировом теле и грудных мышцах имаго американского таракана и мучного хрущака (в % от контроля)
Ферменты Жировое тело Грудные мышцы
мет- энкефалин энкефалин лей- энкефалин мет- энкефалин D^)2-энкефалин лей- энкефалин
Американский таракан
а-ГФДГ +44,2 +22,0 -14,3 + 177,0 + 127,0 +94,5
МДГ +82,6 +43,5 +56,3 + 109,9 + 112,0 +71,0
ЛДГ +48,0 +9,5 + 158,1 +28,1 +20,3 -38,4
Мучной хрущак
а-ГФДГ + 180,1 +71,7 -34,2 + 158,2 +51,2 + 14,6
МДГ +27,1 +59,4 + 17,8 +75,5 +65,9 +71,4
ЛДГ + 136,3 + 107,9 + 128,6 +28,6 +93,6 + 1,0
Таблица 4
Аминокислотный состав двух форм АЮГ-зависимой карбоксилэстеразы куколок большого мучного хрущака
Аминокислоты Содержание АК, в мол.% Аминокислоты Содержание АК, в мол.%
Эстераза I Эстераза II Эстераза I Эстераза II
Аспарагиновая 11,33 10,83 Метионин 0,26 0,28
Треонин 5,48 5,83 Изолейцин 4,83 4,93
Серин 5,92 5,11 Лейцин 7,89 8,79
Глутаминовая 11,33 11,61 Тирозин 2,84 2,73
Пролин 4,84 4,61 Фенилаланин 3,95 3,88
Глицин 11,04 10,45 Гистидин 2,62 2,28
Аланин 10,43 11,05 Лизин 5,73 6,18
Валин 6,88 6,94 Аргинин 4,63 4,51
тана методика ее выделения и очистки. В результате проделанной работы были получены две электрофорети-чески гомогенные формы этой эсте-разы, характеризующиеся различной молекулярной массой и сходным аминокислотным составом (табл. 4).
Охарактеризованная АЮГ-зависи-мая карбоксилэстераза цитозоля куколок большого мучного хрущака является неспецифической эстеразой, способной ускорять гидролиз экзогенных аналогов ювенильного гормона, а также эндогенных гормонов. Возможно, что функции мономерной формы фермента этим не ограничиваются, и она имеет более широкое биохимическое значение в метаболизме ксенобиотиков.
Известно, что биосинтез белка у всех организмов, включая насекомых, включает несколько этапов (транскрипция, посттранскрипционный процессинг пре-мРНК, трансляция и посттрансляционная модификация полипептидов), которые приводят к образованию функциональ-
ных белков. Решающая роль в регуляции этих процессов принадлежит гормонам. Посттрансляционная модификация белков путем фосфори-лирования и дефосфорилирования играет ведущую роль в управлении и функционировании регуляторных процессов, протекающих в живой клетке, и является важнейшим механизмом регуляции активности ферментов. Детальное исследование влияния мет-энкефалина на активность фосфатазного комплекса ферментов тканей имаго американского таракана продемонстрировало появление новой высокоподвижной формы кислой фосфатазы, а нагрузка ингибиторами транскрипции и трансляции приводила к полному ее исчезновению. На основании этих результатов можно сделать вывод, что именно эта форма тестируемого фермента синтезируется de novo.
Сравнительные исследования по включению меченного 3Н-лейци-на в состав молекулярных форм кислой фосфатазы в норме и под воз-
213
действием экдистерона показали, что степень индукционного эффекта стероидного гормона коррелирует с увеличением количества меченой аминокислоты в формах с повышенной активностью фермента (рис. 3).
Эти исследования доказывают, что гормональная генетическая индукция у насекомых, так же как и у позвоночных животных, осуществляется на уровне определенных множественных форм ферментов. И этот универсальный принцип гормональной индукции достаточно широко распространен и охватывает обширную группу индуцибельных ферментов как у позвоночных, так и у беспозвоночных животных.
Наряду с вкладом в современную биохимию, особенно сравнительную, данные о механизме действия гормонов насекомых имеют ярко выраженную практическую направленность.
Исследование гормональной регуляции активности множественных форм ферментов у насекомых-вредителей на различных фазах их развития позволило установить ряд общих закономерностей в регуляции обмена веществ, что необходимо учитывать при разработке новых методов борьбы в практике защиты растений для снижения численности вредителей сельского хозяйства (создание инсектицидов III и IV поколений и для оценки состояния резистентности к различным ксенобиотикам, в том числе и к ювеноидам).
Таким образом, насекомые представляют собой очень яркий пример того, как при высоком консерватизме химической природы гормонов достигается необычайно большое разнообразие контролируемых ими процессов, расшифровка которых внесет свой вклад в общую биохимию и эн-
Рисунок 3
Уровень радиоактивности в DPM1 форм кислой фосфатазы жирового тела куколок тутового шелкопряда после введения 3Н-лейцина в норме и под воздействием 214 экдистерона
LL.
300
200
150-
| 100
01 а
L о >
250
111111
□ Контроль ■ Экдистерон
0,10 0,25 0,40 0,48
0,60 0,70
ОЭП <РО|>1,1 КФ
докринологию, став источником новых идей и концепций в области гормональной регуляции обмена веществ и современных подходов к пониманию биологии развития. Вместе с тем, она может стать теоретической базой для сельскохозяйственной энтомологии, в которой возможно возникновение принципиально новых направлений, таких как регуляция численности насекомых-вредителей и повышение продуктивности хозяйственно-ценных видов при посредстве регуляторов роста и развития гормональной и антигормональной природы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Грицай О.Б., ДубининВ.А, ПилипенкоВ.Э. и др. Воздействие налоксона и бета-казоморфина на опиоидную систему таракана Periplaneta americana при электрошоке // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. Биология. - 2001. - № 2.
2. Маркосян К.А., Замятнин А.А., Курганов Б.И. Антибактериальные богатые проли-ном природные олигопептиды и их белки-мишени / / Биохимия. — 2004. - Т. 69, вып. 10.
3. Lee I.H., Chang K.Y., Chung S.C. et al. Ce-cpropin D-like antibacterial peptides from the sphingid moth, Agrius convol-vuli. // Archives of Insect Biochemistry and Physiology. — 1999. — 41.
4. LiuX, Tanaka Y, SongQ, etal. Bombix mori prothoracicostatic peptide inhibits ecdys-teroidogenesis in vivo. // Arch. Insect Bio-chem. and Physiol. — 2004. — 56, № 4.
5. Кутузова Н.М. Гормоны насекомых: структура, функции, механизм действия. — М.: Прометей, 2008.
6. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П. Нейро-химия / Под ред. И.П. Ашмарина, П.В. Стукалова. — М., 1996.
7. Gade G. Regulation of intermediary metabolism and water balance of insect by neuropeptides // Annual Review of Entomology. — 2004. — V. 49.
8. Сёмина Н.В. Исследование влияния пептидных гормонов и биогенных аминов на активность ферментов углеводного и липидного обмена Perplaneta аmericana и Tenebrio molitor // Дис. ... к. биол. н. — М., 2000.
9. Грунтенко Н.Е., Андренкова Е.В., Монас-тириоти М. и др. Биогенные амины негативно регулируют активность синтезирующих их ферментов у имаго Drosophila // Докл. РАН. — 2001. — Т. 379, № 4.
10. Раушенбах И.Ю. Стресс-реакция насекомых: механизм, генетический контроль, роль в адаптации // Генетика.
— 1997. — Т. 33.
11. Балакина О.В. Изучение воздействия мет-энкефалина и дофамина на эсте- п<г разы тканей имаго американского таракана // Автореф. дис. ... к. биол. н.
— М., 2002. ■
Настоящая работа является итогом многолетних исследований в области биохимической эндокринологии и выполнена в рамках одного из приоритетных направлений развития науки — «Живые системы». Полученные экспериментальные результаты формируют у студентов и аспирантов современные фундаментальные представления о механизмах гормонального контроля роста, развития репродукции и процессов адаптации живых организмов к окружающей среде.
Анализ проведенных исследований служит теоретической, а также методической основой для выполнения курсовых, дипломных и выпускных квалификационных работ студентов и магистров. Кроме того, у будущих преподавателей естественного цикла дисциплин формируются профессиональные компетенции при углубленном изучении биохимии, молекулярной биологии, нанобиотехнологии и экологического мониторинга.
