CC BY
50УДК 636.92; 636.934.571
DOI: 10.24411/0023-4885-2020-10603
ГОРМОНАЛЬНАЯ ИНДУКЦИЯ ФОЛЛИКУЛОГЕНЕЗА У КРОЛЬЧИХ И НОРОК
Индукция фолликулогенеза у крольчих и норок Д.В. Попов, Е.С. Колесник, Г.Ю. Косовский
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева» 140143, Московская область, Раменский район, пос. Родники, ул. Трудовая, 6
e-mail: niipzk@mail.ru
Методы гормональной регуляции эстральных циклов являются основным инструментом в современном сельскохозяйственном животноводстве применяемым с целью оптимизации процессов воспроизводства поголовья. Несмотря на большое количество накопленных данных по этой теме, проблема гормональной регуляции эстральных циклов в кролиководстве и звероводстве является мало изученной. На базе ФГБНУ НИИПЗК разработаны схемы применения гонадотропных гормонов самкам норок и крольчихам с целью стимуляции фолликулогенеза. Полученные данные по результатам проведенного исследования показали, что разработанные режимы введения гормональных препаратов позволяют индуцировать фол-ликулогенез у крольчих и норок. Так, у крольчих на 3 день после введения фолликулостимулирующего гормона получено в среднем на самку 38,2±3,83 созревших фолликула, а у норок на обработанную самку на 7 день исследования в среднем пришлось 18,2±1,92 созревших фолликулов. Таким образом, разработанная схема применения гонадотропинов может быть использована в технологии воспроизводства в кролиководстве и клеточном пушном звероводстве.
Ключевые слова: кролики, норка, гормоны, фолликулы, индукция, фолликулогенез
В физиологический процесс воспроизводства у млекопитающих вовлечены две регулятор-ные системы - эндокринная и нервная, для различных видов домашних животных принцип гормональной регуляции репродуктивного процесса одинаковый, однако присутствуют существенные различия. Практически для всех видов доместицированных животных эструс происходит несколько раз в году (крупный рогатый скот, свиньи), тогда как у других видов периоды половой активности носят сезонный характер (лошади, овцы, кошки). В тоже время имеются различия в механизме овуляции, так у большинства видов она происходит спонтанно, а у некоторых, таких как крольчихи, норки и кошки, овуляция индуцируется за счёт стимуляции рецепторов во влагалище и шейке матки во время коитуса[1].
При ведении хозяйственной деятельности, связанной с разведением сельскохозяйственных видов животных, одним из основных периодов, которому уделяет внимание человек, является период воспроизводства. В этот период человек чаще всего вмешивается в репродуктивный процесс: допускает или не допускает размножение,
определяет метод, как будет оплодотворена самка (естественной случкой с самцом или искусственным осеменением), проводит гормональные обработки с целью регуляции эструса, индукции овуляции и т. д. [1]. Исследования в области биологии воспроизводства млекопитающих ведутся уже больше ста лет, благодаря чему накоплен значительный опыт в этом направлении. В настоящее время разработано множество методов регуляции эстральных циклов у самок млекопитающих, искусственного осеменения, получения и криоконсервации гамет и эмбрионов, трансплантации эмбрионов [2]. В тоже время, применение методов репродуктивной биотехнологии в некоторых отраслях животноводства в индустриальном масштабе не всегда имеет ожидаемый результат. Так, по данным ученых НИИ пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева при применении технологии искусственного осеменения кроликов в производственных условиях оплодотворяемость самок в зимне-весенний период составляла 80-90%, в летне-осенний - 65-75% [3]. На кролиководческих фермах в настоящее время часто используют гонадотропин
сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК). Этот препарат содержит в себе комплекс половых гормонов, обладающих высокой специфической активностью и эффективен для стимуляции роста фолликулов, производства эстрогена и, таким образом, охоты у крольчих, повышая плодовитость. Однако применение ГСЖК довольно часто сопряжено с патологическими структурными и функциональными изменениями в яичниках, что связано с довольно долгим периодом высвобождения гонадотропина [4]. В то же время, международная группа по воспроизводству кроликов (IRRG - International Rabbit Reproduction Group) решила сократить использование ГСЖК в связи с его остатками в мясе, благополучием животных и желанием сохранить «естественный» образ мяса [5].
В пушном звероводстве при выявлении причин, ассоциированных с низкой репродуктивной способностью самок, установлено, что гипофункция яичников в большинстве случаев является причиной понижения репродуктивной способности самок песцов. Известно несколько опытов по стимуляции репродуктивной функции самок лисиц и песцов [6]. Так применяя гонадо-тропин (ГСЖК) и человеческий хорионический гормон (ЧХГ) с целью синхронизации созревания яйцеклеток у самок лисиц и песцов исследователям НИИ пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева (НИИПЗК) удалось решить проблему позднего гона и щенения, а также снизить процент прохолостовавших молодых самок [7]. Однако в более ранних исследованиях отмечается, что «...однократная и тем более двукратная инъекция препарата ГСЖК резко изменяют функциональную морфологию яичника препубертатных животных.», также отмечено, что с точки зрения индукции овуляции несостоятельность применения ГСЖК очевидна, равно как и невысокая эффективность стимуляции фолликулогенеза, что, вероятно, обусловлено различиями в темпах созревания самок [8]. Учёными НИИПЗК проводены исследования, направленные на индукцию дополнительного эструса у норок в осенний период года с применением мелатонина и изменением длины светового дня, и разработан способ получения второго приплода [9]. В клеточном пушном звероводстве также применяются методы синхронизации эст-ральных циклов с применением ЧХГ. Так, например, в промышленном норководстве в сезон вос-
производства норок за 7 дней до начала гона половозрелых самок обрабатывают хорионическим человеческим гонадотропином [10]. Это позволяет оптимизировать технологические процессы при проведении гона у норок, однако, отмечается, что в 10-30% случаев проводят повторное спаривание через 10-12 суток, что впоследствии сказывается на выживаемости эмбрионов, образовавшихся в результате первого спаривания.
Несмотря на довольно противоречивые результаты применения гормонов в воспроизводстве кроликов и пушных зверей, их использование с целью регуляции репродуктивной функции у млекопитающих остаётся до сих пор актуальным. В этой связи целью нашего исследования стала разработка режимов введения гормональных препаратов крольчихам и самкам норок для индукции фолликулогенеза.
Материалы и методы исследований
Для индукции фолликулогенеза у крольчих и норок использованы режимы введения гормональных препаратов, представленные в таблицах 1 и 2.
Представленным методом обработаны половозрелые крольчихи (п=12) и норки (п=5). Для определения эффективности разработанного режима введения гормональных препаратов с целью визуализации яичников обработанных крольчих (п=5) через 72 часа после введения на 10 день препарата «Сурфагон», а норок (п=5) -на 7 день исследования, их подвергали диагностической лапаротомии. Яичники замеряли по длине и ширине, а также определяли общее количество созревших фолликулов после гормональной обработки, для чего подсчитывали количество образовавшихся жёлтых тел и количество неовулировавших фолликулов у крольчих и количество созревших фолликулов у норок. Также проведено изучение интроовориальных процессов, для этого приготовлены и исследованы гистологические препараты яичников от 7 обработанных крольчих в разные дни индукции фолликулогенеза. В день введения фолликуло-стимулирующего гормона отбирались яичники, и на 2 и 3 день после введения ФСГ, а также через 72 часа после овуляции, фиксировались в 10% растворе формалина, после промывки в воде, их обезвоживали в спиртах с возрастающей крепостью, затем уплотняли в парафине и делали срезы на микротоме KEDEE KD-3. Для
Таблица 1. Режим введения гормональных препаратов крольчихам Table 1. The mode of administration of hormones to rabbits
День введения / (Introduction day) Биорегулятор / процедура / (hormone) Доза, способ введения (dose)
День 1 (не зависимо от количества дней от окрола) (Day 1) ГнРг (Сурфагон) 0,3 мл в/м
День 7 (Day 7) ФСГ + пролонгатор (полиэтиленгликоль) 25 И.Е. п/к
День 10 (Day 10) Сурфагон 0,3 мл в/м
Таблица 2 Режим применения гормональных препаратов норкам Table 2. The mode of administration of hormones to mink
День введения / (Introduction day) Биорегулятор / процедура / (hormone) Доза, способ введения (dose)
День 1 (Day 1) ГнРг (Сурфагон), 0.25 мл в/м
День 4 (Day 4) ФСГ + пролонгатор (полиэти-ленгликоль) 10 И.Е. п/к
День 7 (Day 7) Диагностическая лапарото-мия (diagnostic laparotomy)
окрашивания использовали цитоплазматический краситель - гематоксилин-эозин. Готовые препараты исследовали под микроскопом при 100 кратном увеличении.
При проведении исследований соблюдали правила биоэтики и гуманного обращения с экспериментальными животными[11].
Результаты исследований
Для определения количества созревших и овулировавших фолликулов у пяти самок проведён подсчет числа овуляций и проведены замеры яичников через 72 часа после овуляции (таблица 3). Из представленных данных видно, что общая реакция яичников на пять самок составила 191 созревший фолликул или 38,2±3,83 фолликулов на самку в среднем.
Также установлено, что общее количество жёлтых тел составило 187, или 97,9% от общего числа созревших фолликулов, при этом на самку в среднем пришлось 37,4 ± 3,0 овулировавших фолликулов. Размеры яичников в среднем у самок при этом составили левый и правый, длина/ширина 22±0,7/6,0±1,0 и
22,2±0,83/6,2±0,83 миллиметров соответственно.
При изучении интроовориальных процессов в различные дни индукции фолликулогенеза крольчихам проведена диагностическая лапаро-томия с целью определения размеров яичников и приготовления гистологических препаратов. На рисунке 1 представлен яичник крольчихи в первый день индукции фолликулогенеза. Видно, что размеры яичника составляют в длину менее 1 см и в ширину - 0,3 см. На гистологическом препарате яичника крольчихи на первый день введения ФСГ видно множество примордиаль-ных фолликулов, а также первичные фолликулы (рисунок 2). На второй день после введения го-надотропинов видно, что яичник увеличился в размерах, его длина составляет уже 1,2-1,3 см, а ширина 0,5 см (рисунок 3). На гистологическом препарате яичника во второй день индукции фолликулогенеза наблюдается гиперемия яичника, а также видны созревающие вторичные фолликулы (рисунок 4). На рисунке 5 представлен яичник крольчихи на 3 день процедуры, заметно увеличение яичника в размерах, длина достигает 1,5 см., ширина 0,7 см. Также чётко видны практически зрелые фолликулы. На гистологическом препарате этого дня видны зрелые
Таблица 3. Число овуляций и размеры яичников при введении гормональных препаратов
для индукции фолликулогенеза и овуляции Table 3. The number of ovulations and the size of the ovaries with the introduction of hormones
for the induction of folliculogenesis and ovulation
N п/п Общая реакция яичников (созревших фолликулов) / (number of mature follicles) Количество жёлтых тел, (%) / (number of corpus luteum) Количество не овулировавших фолликулов, (%) / (number of non-ovulating follicles) Размеры яичников, мм / (ovarian size)
левый яичник длина / ширина (left ovary. Length/Width) правый яичник длина / ширина (right ovary. Length/Width)
Донор № 1 34 34 (100) 0 (0,0) 22/5 21/5
Донор № 2 38 37 (97,3) 1 (2,7) 22/7 23/7
Донор № 3 43 41 (95,3) 2 (4,7) 23/3 23/6
Донор № 4 35 35 (100) 0 (0,0) 21/5 22/6
Донор № 5 41 40 (97,5) 1 (2,5) 22/6 22/7
Всего (Total) 191 187 (97,9) 4 (2,1) - -
В среднем на самку в группе (Average per female in a group) 38,2±3,83 37,4±3,0 0,8±0,83 22±0,7/ 6,0±1,0 22,2±0,83 / 6,2±0,83
фолликулы, а примордиальных и первичных фолликулов практически не наблюдается (рисунок 6). Яичник крольчихи через 72 часа после овуляции представлен на рисунке 7, видны образовавшиеся жёлтые тела, а также увеличившийся в своих размерах яичник. На гистологическом препарате видны образовавшиеся и образующиеся жёлтые тела и атретические полостные фолликулы (рисунок 8).
На основании полученных данных можно констатировать, что на 1-3 день после введения гонадотропина при индукции фолликулогенеза препаратом ФСГ с пролонгатором ПЭГ у крольчих наблюдается увеличение размеров яичников, а также уже на 3 день после введения препарата выявляется наибольшее количество зрелых пред-овуляторных фолликулов.
При проведении гормональных обработок норок получены следующие результаты (таблица 4). Так, показано, что после индукции фол-ликулогенеза гонадотропным препаратом ФСГ-супер на яичниках определялось от 15 до 20 созревших фолликулов, при этом общее в среднем
на самку составило 18,2±1,92 созревших фолликулов. Размеры яичников при этом в среднем были следующими: длина левого яичника -7,4±1,62 мм и ширина - 6,4±1,62 мм, длина правого яичника- 7,6±1,62 мм, а ширина - 6,8±2,49 миллиметров.
Также следует отметить, что гормональные обработки норок проводили в начале февраля, т.е. до наступления гона, и на 7 день после применения разработанного режима введения гормональных препаратов у них отмечены изменения в яичниках по сравнению с первым днём введения гонадотропинов. На рисунке 9 и 10 представлены органы репродуктивной системы норки в первый день введения препаратов, в этот период яичники не видны в тканевой сумке (бурсе) и их практически невозможно визуально дифференцировать от яйцеводов. Однако после проведённой гормональной обработки на седьмой день, они уже заметно увеличились в размерах и на яичниках в тканевой сумке отчётливо видны созревшие фолликулы (рисунок 11, 12).
Рисунок 1. Первый день индукции фолликулогенеза
Figure 1. First day of induction of folliculo-genesis
Рисунок 2. Гистологический препарат яичника крольчихи 1 день индукции фолликулогенеза. Окраска гематоксилин-эозин. Ув.х100
Figure 2. A histological specimen of the rabbit ovary on day 1 of folliculogenesis induction. Hema-toxylin-eosin staining
Рисунок 3. Второй день индукции фолли-кулогенеза
Figure 3. Second day of folliculogenesis induction
Рисунок 4. Гистологический препарат яичника крольчихи, 2 день индукции фолликулогенеза. Окраска гематоксилин-эозин. Ув.х100
Figure 4. A histological specimen of a rabbit ovary, day 2 of folliculogenesis induction. Hema-toxylin-eosin staining
Рисунок 5. Третий день индукции фоллику-логенеза
Figure 5. The third day of folliculogenesis induction
Рисунок 6. Гистологический препарат яичника крольчихи 3 день индукции фолликулогенеза. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение х 100
Figure 6. Histological preparation of the rabbit ovary. Day 3 of folliculogenesis induction. Hema-toxylin-eosin staining.
Рисунок. 7. Яичник крольчихи, после овуляции 72 часа
Figure 7. Rabbit ovary, after ovulation 72
hours
иЖ J ' ^ • * / щ
ННш
Рисунок 8. Гистологический препарат яичника крольчихи: атретический полостной фолликул (A) и жёлтое тело (B)
Figure 8. Rabbit ovary histological specimen: atretic cavitatem folliculus (A) and corpus luteum (B)
Рисунок. 9. Органы репродуктивной системы самки норки, день - 1 применения режима введения гормональных препаратов
Figure 9. Organs of the reproductive system of a female mink, day - 1 application of the hormone administration regimen
Рисунок 10. Яйцевод самки норки, день -1 применения режима введения гормональных препаратов
Figure 10. Oviduct of a female mink, day - 1 application of the hormone administration regimen
Рисунок 11. Яйцевод и яичник норки с созревшими фолликулами, день - 7 применения режима введения гормональных препаратов
Figure. 11. The mink oviduct and ovary with matured follicles, day - 7 application of the hormone administration regimen
Таблица 4. Число овуляций и размеры яичников при введении гормональных препаратов
для индукции фолликулогенеза и овуляции Table 4. The number of ovulations and the size of the ovaries with the introduction of hormones
for the induction of folliculogenesis and ovulation
N п/п Количество созревших фолликулов (The number of mature follicles) Размеры яичников, мм (Ovarian sizes, mm)
левый яичник длина / ширина (left ovary length / width) правый яичник длина / ширина (right ovary length / width)
Донор № 1 18 8/7 8/8
Донор № 2 16 7/6 7/6
Донор № 3 20 8/7 8/7
Донор № 4 15 7/6 7/7
Донор № 5 17 7/6 8/6
Всего (Total) 86 - -
В среднем на самку в группе (Average per female in a group) 18,2±1,92 7,4±1,62/6,4±1,62 7,6±1,62/6,8±2,49
Заключение
Таким образом, разработанные и апробированные режимы введения гормональных препаратов индуцируют фолликулогенез у крольчих и норок и позволяют на 3 день процедуры получить в среднем на самку 38,2±3,83 созревших фолликула у крольчих, а у самок норок на 7 день после введения фолликулостимулирующего гормона созревают 18,2±1,92 фолликулов в среднем на обработанную самку.
Такой результат достигается за счёт того, что в первый день начала обработок независимо от дня эстрального цикла самкам инъецируют гонадотропный рилизинг-гормон, который оказывает стимулирующее действие на переднюю долю гипофиза, что вызывает секрецию эндогенных фолликулостимулирующего и лютеини-зирующего гормонов, тем самым оказывая позитивное действие на интроовариальные процессы. Также в режим гормональных обработок интегрирована однократная инъекция пролонгированной формы фолликулостимулирующего гормона, что вызовет множественный рост фолликулов и исключит проявление патологических структурных и функциональных изменений в яичниках, какие бы непременно проявились в случае использования с этой целью препаратов ГСЖК. Учитывая, что овуляция у
Рисунок 12. Яичник норки с созревшими фолликулами, день - 7 применения режима введения гормональных препаратов
Figure 12. The mink ovary with matured follicles, day - 7 application of the hormone administration regimen
крольчих и норок провоцируется стимуляцией сенсорных рецепторов во влагалище и шейке матки при коитусе, а также, что овуляция большого числа индуцированных к росту фолликулов может растягиваться по времени до 24 и более часов, что приводит к увеличенному числу неоплодотворенных яйцеклеток, пред-
лагаемая нами интеграция в режим обработок инъекции сурфагона приводит к унификации времени овуляции фолликулов.
Таким образом, разработанные и апробированные режимы введения гормональных препаратов крольчихам и самкам норок могут применяться в кролиководческих и звероводческих хозяйствах с целью управления процессами воспроизводства, также данные режимы можно применять в исследовательских целях для получения эмбрионов от крольчих и норок методами in vivo и in vitro.
Список литературы / References
1. Пташинская М. Краткое руководство по репродукции животных MSD ANIMAL HEALTH 2009, С. - 176. Ptashinskaya M. A Brief Guide to Animal Reproduction mSd ANIMAL HEALTH 2009, P. - 176.
2. William W Thatcher A 100-Year Review: Historical development of female reproductive physiology in dairy cattle /J Dairy Sci. 2017 Dec; 100(12): 10272-10291. doi: 10.3168/jds.2017-13399
3. Андреева В.С., Апробация искусственного осеменения кроликов // Науч.тр. НИИПЗК, т.26.- 1981.- С. 122-128Andreeva V.S., Approbation of artificial insemination of rabbits // Scientific requirements. NIIPZK, т.26.- 1981.- P. 122-128
4. Косовский Г.Ю., Способ индукции суперовуляции у коров-доноров эмбрионов с пролонгированием действия гипофизарных гонадо-тропинов [Текст] :Пат.2617042 Рос. Федерация: МПК A61D7/00Kosovskiy G.Yu., Method of induction of superovulation in embryo donor cows with prolonged action of pituitary gonadotropins [Text]: Pat.2617042 Ros. Federation: МПК A61D7/00
5. BOITI C. 1998. International collaboration in rabbit reproduction research: presentation of the IRRG group. World Rabbit Sci., 6: P. -175-178.
6. Помытко В.Н., Владимиров А.В. Гипофункция яичников у самок песцов в период гона / Научные труды НИИПЗК Министерство сельского хозяйства РСФСР, Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства. Москва, 1973 С.- 170172. V. N. Pomytko, A. V. Vladimirov Hypo-function of the ovaries in female arctic foxes during the rutting period / Scientific works of
NIIPZK Ministry of Agriculture of the RSFSR, Research Institute of Fur Farming and Rabbit Breeding. Moscow, 1973 P.- 170-172.
7. Жвакина А.Р., Рекомендации по применению метода синхронизации созревания яйцеклеток самок лисиц и песцов, п. Родники 2017 г. C.-21.Zhvakina A.R., Recommendations for the application of the method of synchronization of egg maturation in female foxes and arctic foxes, Rodniki village 2017 г. P.-21.
8. Шульгина Н.К., Сезонно-возрастные особенности реакции яичников лисиц и песцов на гормональную стимуляцию / Проблемы биологии продуктивных животных, 2007, №1 C.-81-88.Shulgina N.K., Seasonal-age characteristics of the reaction of ovaries of foxes and polar foxes to hormonal stimulation / Problems of biology of productive animals, 2007, №1 P.-81-88.
9. Рапопорт О.Л., Вернадский В.Г., Чепрасов В.Д. Патент СССР Способ регуляции воспроизводительной функции у норок 1993 г. Rapoport O.L., Bernadsky V.G., Cheprasov V.D. USSR patent Method for regulating reproductive function in minks 1993.
10. Nagl A. Et. al. Noninvasive monitoring of female reproductive hormone metabolites in the endangered European mink, 2015.
11. Каркищенко Н.Н., Грачева С.В., Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях / под редакцией:. - Москва. - 2010. С.-344. Karkishchenko NN, Gracheva SV, Guide to laboratory animals and alternative models in biomedical technologies / edited by :. - Moscow. - 2010. P-344.
HORMONAL INDUCTION OF FOLLICULOGENESIS IN RABBITS AND
MINK
Folliculogenesis induction in rabbits and mink
D.V. Popov, E.S. Kolesnik, G.Yu. Kosovsky
Afanas'ev Research Institute of Fur-Bearing Animal Breeding and Rabbit Breeding.
Russia, 140143, Moscow province, Ramenskii region, pos. Rodniky, ul. Trudovaya, 6
e-mail:niipzk@mail.ru
Methods of hormonal regulation of estrous cycles are the main tool used in modern agricultural animal husbandry to optimize reproduction processes. Despite the large amount of accumulated data on this topic, the problem of hormonal regulation of estrous cycles in rabbit and fur farming is poorly understood. Schemes have been developed for the use of gonadotropic hormones in female minks and rabbits in order to stimulate folliculogenesis. The data obtained showed that the developed modes of hormone administration make it possible to induce folliculogenesis in rabbits and minks. In rabbits, on day 3 after administration of follicle-stimulating hormone, an average of 38.2 ± 3.83 mature follicles were obtained per female, and in minks, on the 7th day of the study, an average of 18.2 ± 1.92 mature follicles were obtained per treated female. Thus, the developed scheme for the use of gonadotropins can be used in reproduction technology in rabbit breeding and fur farming.
Key words: rabbits, mink, hormones,follicles,induction, folliculogenesis
Д.В. Попов: SPIN-код: 3657-4880; ORCID: 0000-0001-7422-5470; AuthorID: 811001
E.С. Колесник: SPIN-код: 3533-3806; AuthorID: 1050062; ORCID: 0000-0002-2465-7184; ScopusID:
57219537696
Г.Ю. Косовский: SPIN-код: 3736-3480; AuthorID: 353097; ORCID: 0000-0003-3808-3086; Research-
erID: ABG-7304-2020; ScopusID: 57196461206
