CC BY
73
УДК: 543.55 + 543.554
ГЛЮКОЗООКСИДАЗНЫЙ БИОСЕНСОР НА ОСНОВЕ ПЕЧАТНОГО ЭЛЕКТРОДА, МОДИФИЦИРОВАННОГО ТЕРМОРАСШИРЕННЫМ ГРАФИТОМ
А.Е. Китова, Ю.В. Плеханова, В.В. Колесов, А.Н. Решетилов
Модифицированные терморасширенным графитом (ТРГ) и берлинской лазурью печатные электроды были использованы в качестве основы глюкозооксидазных (ГОД) биосенсоров. Исследование хроноамперометрических и циклических вольт -амперных характеристик показало, что модификация печатных электродов ТРГ приводит к генерации более высоких значений регистрируемых токов в сравнении немо-дифицированным ТРГ электродом. Так, чувствительность в области линейного диапазона ГОД-ТРГ-электродов в 7 раз превосходила чувствительность ГОД-электродов без нанесения ТРГ и составляла 3,89 мкА/мМ и 0,56 мкА/мМ, соответственно. Операционную стабильность биосенсоров измеряли в течение 1 мес, активность электродов снижалась при этом в 1,7 раза по сравнению с исходной.
Ключевые слова: глюкозооксидаза, терморасширенный графит, печатные электроды, берлинская лазурь, хитозан.
Введение
Электроды, полученные методом матричной печати (печатные электроды) используются для проведения биосенсорного анализа, например, в медицине [1, 2] Как правило, при формировании биосенсоров на основе печатных электродов применяются различные наноматериалы [3-6]. Модификация наноматериалами позволяет улучшить характеристики сенсоров: увеличить эффективную площадь поверхности, повысить чувствительность электродов, а также кинетику электронного транспорта. Графеноподобный материал - терморасширенный графит (ТРГ) обладает высокой электропроводностью, большой удельной поверхностью, химической стойкостью и биосовместимостью [7]. Ранее нами было показано, что увеличение амплитуды сигнала для модифицированных ТРГ электродов связано с уменьшением их внутреннего сопротивления [8]. Модифицированный ТРГ биодатчик обладал в 3 раза более высокой чувствительностью к этиловому спирту по сравнению с немодифицированным.
Для обеспечения стабильной работы модифицированных электродов используют различные полимеры, например, хитозан [5, 9]. Хитозан является природным полисахаридом, который благодаря таким свойствам как хорошая адгезия и высокая гидрофильность, механическая прочность и невысокая стоимость часто применяется для иммобилизации биоматериала в биосенсорах. В работе [5] показано, что комбинация
хитозана и многостенных углеродных нанотрубок образует стабильный комплекс.
Таким образом, актуальной задачей является исследование свойств модифицированных наноматериалами печатных электродов в комбинации с хитозаном. Целью данной работы являлось исследование параметров печатных электродов, модифицированных терморасширенным графитом и берлинской лазурью. В качестве биологически чувствительного элемента использовали глюкозооксидазу (ГОД).
Материалы и методы
В работе использовали глюкозооксидазу (Sigma, США). Эксперименты выполняли на печатных электродах ООО «КолорЭлектроникс» (Россия). Печатный электрод представлял собой композицию вспомогательного и рабочего/измерительного электродов, выполненных из графитовой пасты Electrodag 6017SS (Henkel, Германия), и электрода сравнения (Ag/AgCl). Диаметр рабочего электрода составлял 3 мм. Нанесение берлинской лазури на электроды выполняли в соответствии с методикой [10].
На рабочем электроде печатного электрода прессованием закрепляли пластинку из ТРГ диаметром 3 мм и толщиной 0,05 мм. ГОД иммобилизовали на поверхности электрода в геле низкомолекулярного хитозана (Sigma-Aldrich, США). Смешивали в соотношении 1:1 раствор фермента и 2 %-й раствор хитозана в 1 %-й уксусной кислоте [11]. 5 мкл смеси наносили на рабочий электрод. Содержание фермента на электроде составляло 0,018 мг/мм .
Измерения проводили в кювете объемом 2 мл. В качестве базового раствора использовали 25 мМ калий-фосфатный буфер, рН 6, содержащий 10 мМ хлорида натрия. Объем вносимой пробы (глюкоза) составлял 20 мкл. Для регистрации сигналов электрода использовали гальванопотенциостат IPCmicro (OOO "Кронас", Россия). Измерения проводили по трехэлектродной схеме. Хроноамперометрические зависимости регистрировали при потенциале 0 мВ. Циклические вольт-амперные характеристики (ЦВА) регистрировали при скорости сканирования потенциала 3 мВ/с в диапазоне от 500 до - 500 мВ.
Результаты и обсуждение
На рис. 1 приведены калибровочные зависимости ГОД-электродов, модифицированных берлинской лазурью для детекции глюкозы. Для ГОД -электрода, модифицированного ТРГ (кривая 1) линейный диапазон детекции составлял 0,05 - 1.00 мМ. Чувствительность в области линейного диапазона составляла 3,89 мкА/мМ. Нижний предел детекции составлял
0,05 мМ. Для ГОД-электрода без нанесения ТРГ (кривая 2) линейный диапазон детекции составлял 0,05 - 1,00 мМ. Чувствительность в области линейного диапазона составляла 0,56 мкА/мМ. Нижний предел детекции составлял 0,05 мМ. Чувствительность в области линейного диапазона модифицированного ТРГ и берлинской лазурью ГОД-электрода в 7 раз превышала чувствительность аналогичного немодифицированного ТРГ ГОД-электрода. Как было показано ранее [8], увеличение амплитуды сигнала для модифицированных электродов связано с уменьшением их внутреннего сопротивления.
6
5 -
0 -
0 2 4 6
Глюкоза, мМ
Рис. 1. Калибровочные зависимости ГОД-электрода, модифицированного берлинской лазурью для детекции глюкозы при нанесении ТРГ (кривая 1) и без нанесения ТРГ (кривая 2)
Циклические вольт-амперные характеристики для ГОД-биосенсоров, модифицированных берлинской лазурью при нанесении ТРГ и без ТРГ, при использовании в качестве субстрата глюкозы приведены на рис. 2. ЦВА характеристики для электродов, модифицированных ТРГ (кривая 1), имели выраженные области окисления и восстановления медиатора при внесении глюкозы в отличие от немодифицированного ТРГ (контрольного) электрода (кривая 2).
60
40 -
20 -
I 0
-20 -
-40 -
-60
-600
1/ \
2
- — ---
-400
-200
200
400
600
и, мВ
Рис. 2. ЦВА при добавлении глюкозы для ГОД-электрода, модифицированного берлинской лазурью и ТРГ (кривая 1) и без нанесения ТРГ (кривая 2)
0
На рис. 3 приведена операционная стабильность ГОД-электрода, модифицированного берлинской лазурью и ТРГ в течение 30 дней работы сенсора. Регистрировали калибровочные зависимости сенсора в начале каждой недели работы сенсора. Чувствительность в области линейного диапазона сохранялась постоянной в течение 16 суток. На 30-й день работы сенсора чувствительность снизилась в 1,7 раза по сравнению с исходной.
Выводы
В заключение следует отметить, что биосенсоры, модифицированные ТРГ, имеют в 7 раз более высокую чувствительность в области линейного диапазона по сравнению с биосенсорами без нанесения ТРГ. Вольт-амперные характеристики ТРГ-электродов имеют выраженные области окисления и восстановления (медиатора и субстрата). Иммобилизация глюкозооксидазы в хитозановый гель на подложке из ТРГ позволяет сохранять операционную стабильность электродов в течение 1 мес. Таким образом, графеноподобный материал терморасширенный графит позволяет оптимизировать характеристики печатных электродов.
5 -
4 -
ев
ir
с
2 -
0 -
Глюкоза, мМ
Рис. 3. Операционная стабильность ГОД-электрода, модифицированного берлинской лазурью и ТРГ (кривая 1 - 1-й день, кривая 2 - 16-й день, кривая 3 - 30-й день)
6
3
i
0
2
4
6
Работа выполнена при поддержке проекта РНФ «Разработка, создание и исследование новых гибридных сенсоров, основанных на наноэлектронных, акустоэлектронных и электрохимических технологиях для биологических применений», № 18-49-08005.
Список литературы
1. Claver J.B., Miron M.C.V., Capitan-Vallvey L.F. Disposable electrochemiluminescent biosensor for lactate determination in saliva. // Analyst. 2009. V. 134. No 7. P. 1423-1432.
2. Graphene-PEDOT:PSS on screen printed carbon electrode for enzymatic biosensing / A. Wisitsoraat, S. Pakapongpan, C. Sriprachuabwong [et al] // Journal of Electroanalytical Chemistry. 2013. V. 704. P. 208-213.
3. Novel thin layer flow-cell screen-printed graphene electrode for enzymatic sensors/ H. Kanso, M.B. González García, L. Fernández Llano [et al] // Biosensors and Bioelectronics. 2017. V. 93. P. 298-304.
4. A paper-based nanomodified electrochemical biosensor for ethanol detection in beers/ S. Cinti, M. Basso, D. Moscone [et al] // Analytica Chimica Acta. 2017. V. 960. P. 123-130.
5. An electrochemical sensor for indole in plasma based on MWCNTs-chitosan modified screen-printed carbon electrode / M. Jin, X. Zhang, Q. Zhen [et al] // Biosensors and Bioelectronics. 2017. V. 98. P. 392-397.
6. Nicholas P., Pittson R., Hart J.P. Development of a simple, low cost chronoamperometric assay for fructose based on a commercial graphite-nanoparticle modified screen-printed carbon electrode // Food Chemistry. 2018. V. 241. P. 122-126.
7. Композиционные материалы на основе терморасширенного графита / В.Н. Горшенев, А.С. Илюшин, В.В. Колесов [и др.] // Перспективные материалы. 2008. Вып. 6. Ч. 1. С. 351-355.
8. Биосенсор на основе клеток Gluconobacter и терморасширенного графита / А.Н. Решетилов, А.Е. Китова, А.В. Мачулин [и др.] // Сенсорные системы. 2016. Т. 30. № 4. С. 351-354.
9. Optimal direct electron transfer between MWCNTsCOOH/BOD/chitosan layer and porous carbon felt for dioxygen reduction/ T.X.H. Le, V. Flaud, M. Bechelany [et al] // Electrochimica Acta. 2017. V. 230. P. 373-381.
10. Karyakin A. A., Gitelmacher O. V., Karyakina E. E. A high-sensitive glucose amperometric biosensor based on Prussian Blue modified electrodes // Anal. Lett. 1994. V. 27. № 15. P. 2861-2869.
11. Wang X., Gu H., Yin F., Tu Y. A glucose biosensor based on Prussian blue/chitosan hybrid film // Biosensors and Bioelectronics. 2009. V. 24. № 5. P. 1527-1530.
Китова Анна Евгеньевна, канд. биол. наук, научный сотрудник, kitova@,ibpm.pushchino. ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,
Плеханова Юлия Викторовна, канд. биол. наук, научный сотрудник, [email protected], Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН,
Колесов Владимир Владимирович канд. физ. -мат. наук, зав. лабораторией, [email protected], Россия, Москва, Институт радиотехники и электроники им. В.А. Котельникова РАН
Решетилов Анатолий Николаевич, д-р хим. наук, проф., зав. лабораторией, [email protected]. ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН
SCREEN-PRINTED GLUCOSE OXIDASE ELECTRODE MODIFIED BY THERMALLY EXPANDED GRAPHITE
A.E. Kitova, Y. V. Plekhanova, V. V. Kolesov, A.N. Reshetilov
Screen-printed electrodes modified by thermally expanded graphite (TRG) and Prussian Blue were used as the basis of glucose oxidase (GO) biosensors. The study of chronoamperometric and cyclic voltammetric characteristics showed that the modification of screen-
printed electrodes by TRG leads to the generation of higher values of the detected currents. Thus, the sensitivity in the region of the linear range of the GO-TGG-electrodes was 7 times greater than the sensitivity of the GO-electrodes without application of the TRG and was 3.89 jA/mM and 0.56 jjA/mM, respectively. The operational stability of the biosensors was measured for 1 month, the activity of the electrodes decreased by 1.7 times compared with the initial one.
Key words: glucose oxidase, thermally expanded graphite, screen-printed electrodes, Prussian Blue, chitosan.
Kitova Anna Evgen'evna, candidate of biological sciences, researcher, kitova@,ibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,
Plekhanova Yulia Viktorovna, candidate of biological sciences, researcher, plekhanova@,ibpm.pushchino.ru, Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,
Kolesov Vladimir Vladimirovich, candidate of of physical and mathematical sciences, manager of laboratory, [email protected], Russia, Moscow, V.A. Kotelnikov Institute of Radio Engineering and Electronics, Russian Academy of Sciences,
Reshetilov Anatoly Nikolaevich, doctor of chemical sciences, professor, manager of laboratory, anatol@,ibpm.pushchino.ru, Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences
