CC BY
276
9
С 11 6 X И в химии и химической технологии. Том XXIV. 2010. № 11 (116)
УДК 579.64
В.Ю. Секова, Н.А. Корнилова, А.В. Васильева.
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия.
ГЛУБИННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ЭНТОМОПАТОГЕННОГО ГРИБА BEAUVERIA BASIANNA*
A suspension cultivation of enthomopathogenic fungus Beauveria bassiana was carried out with nutrient mediums included starch and glucose as a substratum. Growth curve had the standard form. The maximum concentration of blastospores is reached in stationary phase. This culture fluids has been used for leaves treatment of roses and gerberas infected with the larvae of whitefly. Mortality of larvae reached 30-40% of initial quantity. The analysis of causes of death has shown that larvae were lost as a result of defeat of fungus Beauveria bassiana.
В питательной среде с крахмалом и глюкозой произведено глубинное суспензионное культивироавние энтомопатогенного гриба Bassiana Beauveria. Рост кривой имел стандартную форму. Установлено, что максимальная концентрация достигается в стационарной фазе. Полученная культура была использована для лечения листьев розы и герберы, инфицированных личинками белокрылки. Смертность личинок достигла уровня 30-40% от первоначального количества. Анализ причин смертности личинок выявил их поражение грибом Beauveria Bassiana.
Одной из серьёзных проблем тепличных хозяйств является поражение растений белокрылкой тепличной. Личинки и взрослые особи белокрылки высасывают сок из листьев, черенков, реже из стеблей растений, в результате листья обесцвечиваются, желтеют, а иногда засыхают и опадают. В борьбе с этим вредителем приоритетными являются биологические методы регулирования численности, так как эти методы не представляют экологической опасности и не уступают в эффективности распространённым химическим инсектицидам. Гриб Beauveria bassiana является естественным врагом белокрылок. Он безопасен для человека и теплокровных, не вызывает ожогов у растений.
Эффективность данного гриба обеспечивается разнообразием факторов вирулентности патогенна. С одной стороны, при заражении насекомого спорами гриба развивается микоз. Адгезия конидий грибов происходит за счёт гидрофобных взаимодействий между липидными компонентами эпику-тикулы и клеточной оболочки, а также за счёт неровностей на поверхности кутикулы. Развитие гриба на поверхности эпикутикулы сопровождается выделением гидролитических экзоферментов, действие которых ведёт к исчезновению воскового слоя эпикутикулы и появлению в ней полостей. На следующей стадии развития микоза в эти полости проникают гифы гриба; достигнув прокутикулы, гриб образует дисковидные структуры, расположенные параллельно её ламелам, при этом значительного разрушения кутикулы не происходит. После проростания гриба через кутикулу начинается колонизация внутренних органов, вызывающая, в конечном счёте, гибель насекомого. В первую очередь гриб атакует жировое тело, затем - кишечный тракт, мальпигиевы сосуды, гиподерму, нервную систему и мышечную ткань.
9
С 11 6 X U/ в химии и химической технологии. Том XXIV. 2010. No 11 (116)
С другой стороны развитие гриба сопровождается выделением бове-рицина - циклодепсипептид-токсина, что является дополнительным фактором вирулентности и в значительной степени способствует ослаблению пораженных насекомых.
Исходя из изложенного выше, можно выделить основные требования к препарату и методам обработки растений.
Во-первых, препарат должен обладать хорошими адгезивными свойствами. Поэтому наиболее эффективным является препарат в виде суспензии спорово-мицелиальной массы в культуральной жидкости. Адгезия капель суспензии на поврехности тела насекомого происходит более эффективно, чем адгезия сухих спор, кроме того, вместе с жидкостью на тело насекомого попадают компоненты питательной среды, что ускоряет прорастание спор и развитие патологического процесса.
Во-вторых, воздействие препарата должно происходить достаточно быстро, поэтому, в спорово-мицелиальной массе должны преобладать споры, так как прорастание спор обеспечивает большую скорость патологического процесса, чем разрастание мицелия.
Объектом исследования был выбран штамм гриба Веаиуепа Ьа8з1апа обладающий наибольшей инсектицидной активностью в отношении бело-крылки.
Для изучение морфо-физиологических характеристик гриба Веаиуепа Ьа8з1апа было проведено глубинное суспензионное культивирование.
Кинетика роста гриба Веаиуепа Ьаввшпа на среде с глюкозой
НБластоспоры!^
72
Время, часы
Рис. 1. Кривая роста гриба Веаигепа Ъаяягапа и кинетика образования бластоспор на среде с глюкозой.
Культивирование микроорганизма Beauveria bassiana проводили в колбах Эрлейнмейера объемом 250 мл, содержащей 100 мл жидкой пита-
9
С 11 6 X И в химии и химической технологии. Том XXIV. 2010. № 11 (116)
тельной среды следующего состава (в %): пептон - 2, NaCI - 1, КН2Р04 -0,1, MgS04-5H20 - 0,05. С добавлением глюкозы - 1%- 1я среда, или 1% крахмала 2я среда. Инокулят Beauveria bassiana выращивали на среде аналогичного состава до концентрации бластоспор гриба 107 на мл культуральной жидкости. Засев культуры проводили путем переноса инокулята микроорганизма в обьеме 1% объёма питательной среды в колбу со стерильной питательной средой. Колбу помещали на ротационную качалку при скорости перемешивания 180 об/мин и температуре 23-25°С в течение 10 суток. В ходе эксперимента ежедневно стерильно отбирались пробы. В них определялась биомасса по концентрации абсолютно сухого веса культуры гриба Beauveria bassiana САСВ, концентрация бластоспор гриба в 1мл культуральной жидкости. Микроскопировали при увеличение 10x40 для анализа морфо-физиологических характеристик.
По полученным данным были построена кривые роста гриба Beauveria bassiana и кинетики образования бластоспор (рис. 1 и 2). Кривые роста биомасса от времени на глюкозе и крахмале представляет собой стандартные S - образные кривые. В обоих случаях на кривых роста отчётливо просматривались лагфаза, фаза ускоренного роста, фаза торможения, стационарная фаза и фаза отмирания. Время лаг фазы определялось по графику кривой роста. Расчет удельной скорости роста проводили как тангенс угла наклона прямой, за время что соответствует экспоненциальной фазе роста, полученной путем построения графика зависимости логарифма концентрации биомассы гриба от времени. Данные полученные по графикам сведены в таблице.
Кинетика роста гриба Beauveria bassiana а среде с крахмалом
Время, часы
Рис. 2. Кривая роста гриба Веаигепа Ъаяягапа и кинетика образования бластоспор на среде с крахмалом.
При изучении морфо-физиологических характеристик было выявлено что гриб развивается стандартно в период лаг фаз наблюдается пророста-
С 1Ь 6 X № в химии и химической технологии. Том XXIV. 2010. N011 (116)
ние бластоспор в экспоненциальную фазу увеличение мицелия и увеличева-ется количество бластоспор, максимальное количество бластоспор достигается к 100-120 часам в стационарной фазе развития гриба. И к 120-130 часам начинается лизис мицелия. Так же можно отметить что на глюкозе скорость роста больше чем на крахмале, при этом выход биомассы практически не отличается. На среде, содержащей глюкозу, максимальная концентрация бластоспор была достигнута на сутки раньше.
Табл. Сравнение параметров кривых роста Веаигепа Ъаяягапа по биомассе для субстратов глюкоза и крахмал.
Среда Время лагфазы, ч Удельная скорость роста, ч"1 Коцентрация биомассы максимальное, г/л Время выхода на стационар, ч Коцентра-ция спор максимальное, спор/мл Время достижения максимального количества спор, ч
С глюкозой 5 0,019 13,47 72 6,25-10' 89
С крахмалом 5 0,015 15,29 96 5,60-10' 110
Следующим этапом стало практические испытания влияние культу-ральных жидкостей Веаиуепа Ьаннкта на белокрылку в тепличном комбинате. Для эксперимента были наработаны спорово-мицелиальные массы гриба Веаиуела Ьа.\.\1аиа на глюкозе и и на крахмале в объеме 1л с титром спор 5-107. Полученными культуральными жидкостями были обработаны посадки роз и гербер, поражённые личинкой белокрылки. Через 7 суток отобрали пробу листьев на которых находились умершие личинки белокрылки. Смертность личинок составили 30 - 40 %. Во всех присланных на анализ листьях роз и одном образце листьев гербер были обнаружены погибшие особи белокрылки. Эти мертвые личинки поместили во влажную камеру при температуре 25-27 °С. Через 7 дней при анализе причин смерти личинок, из них был выделен гриб Веаигела Ьа**1апа. Выводы:
1. Гриб Веаигела Ьа.\.\1аиа на среде с крахмалом развивается хуже чем на среде с глюкозой. Беаигепа Ьа.\.\1аиа образует споры на обеих средах. Куль-туральная жидкость со спорами может быть применена для контроля численности белокрылки в тепличном хозяйстве.
2. При обработке личинкок белокрылки энтомопатогенным грибом Веагп'е-па Ьа.\.\1аиа погибло от 30 до40 % особей, при анализе причин гибели личинок былоустановленно что личинки погибли от гриба Веаю'епа Ьаннкта.
*Авторы выражают глубокую благодарность научному руководителю Н.С. Марквнчеву
