CC BY
42
УДК 616.153.455.04:616.831
Вестник СПбГУ. Сер. 3,2004, вып. 3
П К. Телушкин, А. Д. Ноздрацев, П. П. Потапов, А. А. Лучкин
ГЛИКОЛИЗ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ КРЫС, ПОДВЕРГНУТЫХ ОДНО- И МНОГОКРАТНОЙ ГИПЕРИНСУЛИНИЗАЦИИ
/
Глюкоза является основным пластическим и энергетическим субстратом в нервной ткани, и гликолитическая энергопродукция имеет существенное значение в обеспечении функций нервных клеток [8, 11, 14, 20, 21, 24, 26]. Гипогликемия приводит к нарушению функции мозга, гибели нейронов и развитию постгипогликемической энцефалопатии [5, 10, 29], патохимия которой требует изучения.
Практически важно, что гипогликемия в процессе лечения сахарного диабета и в клинике инсуломы поджелудочной железы наблюдается неоднократно [2, 9, 12, 25]. Возможные нарушения обмена в мозге и в организме в целом при неоднократной гипогликемии не исследованы. Изменения биохимических показателей при введении высоких доз инсулина являются результатом гиперинсулинемии, гипогликемии и активации контринсу-лярного аппарата [2, 12]. Разнонаправленные регуляторные воздействия могут приводить к серьезным нарушениям мобилизации и утилизации энергетически важных субстратов. Вероятность развития таких нарушений увеличивается при неоднократном воздействии гипогликемии.
Цель настоящей работы - изучение интенсивности гликолиза и гликогенолиза в нервной ткани и концентрации некоторых субстратов энергообмена в крови и печени крыс при возобновляющейся инсулиновой гипогликемии.
Материал и методика исследования. Опыты выполнены на белых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г. Все животные содержались на стандартном пищевом рационе и перед каждым опытом были лишены пиши в течение 18-24 ч. Животные были разделены на 5 групп: 1-я - интактные животные (контроль); 2-я - крысы* находящиеся в состоянии гипогликемической комы (ГГК); 3-я - животные, обследованные через 48 ч после купирования гипогликемической комы; 4-я - крысы, перенесшие 7 ГГК с интервалом в 2 дня и забитые во время последней из серии ком; 5-я - крысы, перенесшие 7 ГГК и забитые через 48 ч после купирования последней гипогликемической комы. Гипогликемическую кому (утрата постуральных рефлексов, содержание глюкозы в крови около 1,0 ммоль/л) вызывали внутримышечной инъекцией инсулина в дозе 40 ед. на кг массы, купирование проводили введением коматозным животным 3 мл 40%-ного раствора глюкозы в желудок. После купирования комы крысы находились в условиях свободного доступа к пище в течение суток; воду получали без ограничения во всех условиях эксперимента.
Содержание глюкозы в крови и гликогена (ГГ) в головном мозге (по уровню глюкозы после гидролиза гликогена) исследовали энзиматически [3], количество гликогена в печени и в скелетных мышцах (задняя группа мышц бедра) - колориметрическим методом [19]. В сыворотке крови определяли количество свободных жирных кислот (СЖК) [15] и кетоновых тел [6]. Интенсивность гликолиза и гликогенолиза определяли в больших полушариях и в стволе мозга экспериментальных животных по скорости накопления лактата в инкубационной среде, используя в качестве субстратов глюкозу, глюкозолб-фосфат (Г-6-Ф) и гликоген [4]. Количество белка определяли по Лоури. Статистическую обработку проводили с применением критерия Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение. Время впадения в кому, как в первую, так и во все последующие, было практически одинаковым, менялось случайным образом для каждого экспериментального животного, не зависело от количества ранее перенесенных ком и составляло 2-2,5 ч. . .
Количество глюкозы в крови крыс в состоянии первой гипогликемической комы и у животных, перенесших 7 ком, в состоянии последней ГГК было практически одинаковым (табл. 1). У крыс 3-й и 5-й групп уровень глюкозы в плазме крови не отличался от величины этого показателя у контрольных животных. Содержание СЖК и кетоновых тел в сыворотке
• © П. К. Телушкин, А. Д. Ноздрачев, П. П. Потапов, А. А. Лучкин, 2004
крови у крыс 2-й группы снижено соответственно на 41 и 45% (в обоих случаях р<0,01). Через 48 ч после купирования однократной ГГК эти показатели были в 3 раза ниже уровня контроля (в обоих случаях /?<0,001). Концентрация СЖК в сыворотке крови у крыс 4-й группы увеличивалась (+11%, р<0,05), а уровень кетоновых тел не отличался от величины этого показателя у здоровых животных. Через 48 ч после купирования последней из серии ком количество СЖК и кетоновых тел в сыворотке крови уменьшалось соответственно на 46 и 33% по сравнению с нормой (в обоих случаях/?<0,001).
Изменения обмена при введении высоких доз инсулина являются результатом действия многих факторов [2, 12]. Инсулин угнетает липолиз в жировой ткани и, кроме того, уменьшает продукцию кетоновых тел как за счет снижения поступления СЖК в печень, так и за счет торможения собственно синтеза ацетоацетата [31]. Вместе с тем гипогликемия приводит к активации контринсулярного аппарата, в крови увеличивается концентрация глюкагона, катехоламинов, глюкокортикоидов, соматотропного и адренокортикотропного гормонов, которые стимулируют липолиз в жировой ткани и кетогенез в печени [2, 9, 12]. Полученные данные свидетельствуют о том, что при первой ГГК в период реституции и после нее преобладают инсулиновые эффекты, а ^о время последней (7-й) из серии ком в отношении липидного обмена преобладают эффекты контринсулярных гормонов. Возможно, что такая перестройка реактивности имеет существенное значение для адаптации организма, поскольку позволяет поддерживать энергообеспечение при гипогликемии за. счет: неуглеводных субстратов.
Количество гликогена в печени и скелетной мышце крыс в состоянии первой ГГК снижено соответственно на 25% (р<0,05) и 41% (/?<0,001). Стимулирующее влияние инсулина на ферменты синтеза гликогена [1] у голодавших животных из-за дефицита исходного субстрата не сопровождалось накоплением "Полисахарида в тканях. Уменьшение содержания гликогена в скелетных мышцах может быть связано также с развитием судорожного синдрома и с использованием гликогена для мышечного сокращения. Результаты вполне согласуются с литературными данными о том, что в условиях гипогликемии стимулирующее влияние инсулина на синтез гликогена не проявляется, а гликогенолиз в мышцах, напротив, повышается [13], что позволяет сдерживать развитие гипогликемии за счет активации глюкозо-лактатного цикла [33].
Через 48 ч после купирования комы концентрация гликогена в печени была увеличена в 2 раза (р<0,001), а в скелетных мышцах более чем в 1,5 раза (р<0,001) по сравнению с контролем. Быстрое, особенно в печени, накопление гликогена в период последействия, по-видимому, обусловлено эффектами инсулина и высоким потреблением пищи в течение первых суток после купирования комы, когда животные имели свободный доступ к ней. Инсулин стимулирует экспрессию гена глюкокиназы в печени, что способствует достаточно продолжительному по времени увеличению включения глюкозы во внутриклеточный обмен и повышению синтеза гликогена [17].
Обращает на себя внимание, что в 4-й и 5-й группах колебаний уровня гликогена не наблюдалось. По-видимому, у животных, неоднократно перенесших введение высоких доз инсулина, система синтеза и распада гликогена, подвергающаяся разнонаправленным регулирующим воздействиям (гиперинсулинемия, гипогликемия, высокие концентрации контринсулярных гормонов), в конечном итоге приобретает относительную независимость от перечисленных факторов.
Оценивая полученные данные в целом, следует отметить, что при многократном воздействии высоких доз инсулина метаболическая реакция на введение гормона значительно изменяется. Эти изменения направлены на увеличение возможностей энергообеспечения за счет СЖК и кетоновых тел.
Количество гликогена в больших полушариях и стволе мозга крыс (табл. 1) в состоя-
нии однократной ГГК уменьшается соответственно на 55 и 45% (в обоих случаяхр<0,01). У экспериментальных животных 3, 4 и 5-й групп величина этого показателя не отличается от уровня контроля (см. табл. 1). Уменьшение количества гликогена в мозге экспериментальных животных в состоянии ГГК найдено многими исследователями, оно обусловлено увеличением использования гликогена как источника энергии в мозге при нейрогликопении [5, 10, 29]. Отсутствие изменений уровня полисахарида в мозге крыс, перенесших серию ком, свидетельствует о нарушении утилизации гликогена при многократной гипогликемии.
Таблица 1. Показатели углеводного и липидного обмена у крыс при гипогликемической коме и после ее купирования (М+т)
Характеристика 1 -я группа (контроль) 2-я группа 3-я группа 4-я группа 5-я группа
Глюкоза, ммоль/л 5,22+0,1 1,23±0,15*** 5,51+0,27 1,91±0,20*** 5,39+0,14
СЖК, мкмоль/л 445+13 263+52** 146+9*** 493+11* 239+13***
Кетоновые тела, мг/л 36,2+1,8 19,4+2,2** 12,2+1,9*** 38,5+2,8 24,4+0,6***
ГГ в печени, мг/г 20,6+1,4 15,4+1,5* .41,5+2,8*** 21,2+1,0 19,9+1,4
ГГ в скелетных мышцах, мг/г 9,5+0,6 5.6+0,4*** 14,7+0,5*** 11,2+0,9 13,0+1,9
ГГ в больших полушариях 1,32+0,08 0,59+0,10** 1,39+0,10 1,10+0,09 1,28+0,04
мозга, мг/г
ГГ в стволе мозга, мг/г 1,47+0,06 0,80+0,12** 1,45+0,07 1,23+0,11 1,56±0,05
Примечания. В каждой группе по 6-8 животных; здесь и в табл. 2 звездочками обозначены статистически достоверные по сравнению с контролем изменения: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - /?<0,001. (То же для табл. 2). ч
В больших полушариях и стволе мозга скорость накопления лактат при использовании глюкозы и Г-6-Ф не изменялась по сравнению с контролем у животных 2; 3 и 5-й экспериментальных групп (табл. 2). У животных, забитых в состоянии последней из серии ги-погликемических ком, обнаружено уменьшение скорости накопления лактата в больших полушариях и стволе мозга при использовании всех трех субстратов. Снижение было наиболее выражено при использовании Г-6-Ф в качестве исходного субстрата.
Таблица 2. Скорость накопления лактата (нмоль • мин-1 мг белка ') в больших полушариях и стволе мозга крыс при гипогликемической коме и после ее купирования (М+т)
Субстрат Отдел мозга 1-я группа (контроль) 2-я группа 3-я группа 4-я группа 5-я фуппа
Глюкоза Г-6-Ф Гликоген Большие полушария Ствол Большие полушария Ствол Большие полушария Ствол 53,6+1,12 57,6+0,96 66,1+3,97 73,7+5,48 19,8+2,14 18,7+1,46 55,1+0,98 55,7+1,11 63,6+2,05 67,4+3,96 20,1+1,62 21,3+1,15 55,4+1,16 55,1 ±1,43 64,9+2,83 69,7+3,42 21,1+1,73 19,5+0,92 40,0+2,05*** 37,4±1,62*** 25,8+0,63*** 28,3+2,61*** 10,3+2,04* 11,4+0,81*** 56,1+1,14 57,4+1,31 65,8+2,47 68,3+3,06 18,7+2,11 . 14,4+0,90*
Обнаруженные нами изменения, по-видимому, обусловлены уменьшением скорости фосфофруктокиназной реакции. Фосфофруктокиназа мозга весьма чувствительна к алло-стерической регуляции [7, 23]. Ингибиторами фосфофруктокиназы, гексокиназы и фосфо-рилазы являются ацил-КоА-производные и кетоновые тела [1]. Данные, полученные при обследовании пациентов, подвергнутых инсулинокоматозной терапии, и экспериментальных животных свидетельствуют о том, что в состоянии комы потребление глюкозы мозгом снижается на 1/3 или наполовину от нормы при неизмененном (или лишь умеренно сниженном) потреблении кислорода. Эти результаты указывает на окисление в нервной ткани при гипогликемии заметных количеств неглюкозных субстратов, в качестве которых могут
выступать высшие жирные кислоты, кетоновые тела и лактат [10,29]. Источником высших жирных кислот, окисляющихся в мозге, могут быть как СЖК плазмы крови, так и высшие жирные кислоты, образующиеся при распаде липидов мембранных структур нервной ткани. Выявленное в настоящем исследовании увеличение уровня СЖК в сыворотке крови у крыс 4-й группы и литературные данные об увеличении уровня высших жирных кислот в мозге крыс в состоянии ГТК [18, 30] позволяют высказать предположение о том, что уменьшение интенсивности гликолиза и гликогенолиза в мозге крыс, перенесших серию гипогликемических ком, в состоянии последней комы связано с ингибированием ферментов ацил-КоА-производными и кетоновыми телами. Полученные нами данные также свидетельствуют о возможности повышенного окисления высших жирных кислот и кетоновых тел при многократном воздействии гипогликемии. Такие изменения могут расцениваться как адаптационные. Однако повышенное включение жирных кислот и кетоновых тел в энергообмен мозга способно угнетать гликолитическую энергопродукцию, что в конечном итоге приводит к неблагоприятным последствиям. ■.
Угнетение гликолитической энергопродукции имеет более существенное значение в нарушении функций мозга, чем изменение общего энергетического статуса нервной ткани [14,20, 21, 26]. Процессы гликолиза и гликогенолиза эффективно осуществляются в астроцитах, и гликоген мозга сосредоточен преимущественно в этих клетках [11,22,24]. Астроциты осуществляют метаболическую поддержку нейронов, в частности, гликолитическая энергопродукция имеет существенное значение в зависимом от работы Na+, К+-АТФазы, удалении К+ из внеклеточной жидкости и поддержании тем самым'мембраннош потенциала покоя нейронов, а также в обеспечении Na+-зависимого захвата глутамата астроцитами и уменьшении его концентрации в межклеточном пространстве [27]. Гликолитическая .энергопродукция играет особую роль в транспорте Са2+ в клетках мозга [16]. Образующийся в ходе гликолиза и гликогенолиза лактат выделяется в межклеточное пространство, захватывается нейронами и используется ими в качестве энергетического субстрата [8, 11]. Продукция молочной кислоты астроцитами имеет значение в регуляции концентрации Н+ во внеклеточной жидкости; Н+ уменьшает сродство NMDA-рецепторов к аспартату и глутамату [32]j лактат препятствует развитию эксайтотоксических эффектов глутамата [28]. Концентрация глутамата и особенно аспартата в межклеточной жидкости в мозге при тяжелой гипогликемии значительно увеличивается, что связано с нарушениями энергетического обмена, сопровождается изменениями ионного гомеостаза и приводит к эксайтотоксической гибели нейронов [5,10].
Нарушение использования гликогена в мозге рассматривают как один из существенных па-тохимических маркеров в развитии энцефалопатий различного генеза [24]. Снижение скорости образования лактата при использовании гликогена в качестве исходного субстрата (на 23% по сравнению с контролем, р<0,05) обнаружено в стволе мозга через 48 ч после купирования последней ГТК. Таким образом, нарушения распада гликогена в стволовых структурах мозга у животных, многократно подвергнутых воздействию гипогликемических доз инсулина, сохраняется длительное время после купирования ГГК.
Таким образом, анализ имеющихся данных показывает, что снижение скорости гликолиза и гликогенолиза в мозге при многократном воздействии высоких доз инсулина в Определенной степени является результатом изменения общей метаболической реакции на введение гормона. Изменения скорости утилизации углеводов в мозге могут способствовать развитию эксайтотоксических эффектов и играть большую роль в возникновении и развитии постгипогликемической энцефалопатии.
Summary
Telushkin Р. К., Nozdratchev A. D., Potapov P. P., Lutchkin A. A. Glycolysis in the rat brain after single and repeated hyperinsulinization.
The concentration of free fat acids and ketone bodies in blood serum as well as content of giycogene in hepar, skeletal muscle, hemispheria and brainstem was decreased in animals under hypoglycemic coma. The content of giycogene became normal in 48 hours following the coma treatment. In this case the quantity of tree fat acids and - ketone bodies was
reduced. In animals that had undergone 7 hypoglycemic comas with 2 day period after the last coma, the content of glyco-gene was not changed in tissues. The quantity of free fat acids and ketone bodies was reduced in 48 hours after the coma treatment. In animals sacrificed after the last coma in their series, the rate of lactate accumulation in the large hemispheria and brainstem was decreased when such substrates as glucose, glucose-6-phosphate and glycogene were used. The rate of glycogenolysis in the brainstem was still decreased in 48 hours following the coma treatment. We suggest that the decreasing of glycolysis and glycogenolysis rate in the brain after repeated using of high doses of insulin resulted from higher inclusion of non-carbohydrates in the energy metabolism of the brain.
Литература
1. Кендыш И. H. Регуляция углеводного обмена. М., 1985. 2. Лукьянчиков В. С., Балаболкин М. И. Гипог-ликемический синдром: Этиология, патогенез, диагностика, лечение. М., 1987. 3. Методы биохимических исследований: Липидный и энергетический обмен / Под ред. М. И. Прохоровой. Л., 1982. 4. Панин Л. Е., Третьякова Т. А., Русских Г. С., ВощеховскаяЕ. Э. Особенности регуляции ключевых ферментов гликолиза и пентозофосфатного пути в тканях с различной функциональной специализацией // Вопросы мед. химии. 1982. Т. 28, №2. С. 26-30. 5. Телушкин П. К., Ноздрачев А. Д. Гипогликемия и мозг: метаболизм и механизмы повреждения нейронов // Успехи физиол. наук. 1999. Т. 30, №4. С. 14-27. 6. ТодоровЙ. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. София, 1961. 7. Ambrosio S., Ventura F, Rosa J. L., Bartons R. Fructose 2,6-bisphosphate in hypoglycemic rat brain // J. Neurochem. 1991. Vol. 57, N 1. P. 200-203. 8. Ames A, 111. CNS energy metabolism as related to function // Brain Res. Reviews. 2000. Vol. 34, N 1-2. P. 42-68. 9. Amiel S. A. Studies in hypoglycaemia in children with insulin-dependent diabetes mellitus // Horm. Res. 1996. Vol. 45, N 6. P. 285-290. 10. AuerR. N. Hypoglycemic brain damage // Stroke. 1986. Vol. 17, N4. P. 699-708. 11. BittarP. G., CharnayY., Pellerin L., BourasC., Magistretti P. J. Selective distribution of lactate dehydrogenase isoenzymes in neurons and astrocytes of human brain // J. Cereb. Blood Flow Metab. 1996. Vol. 16. P. 1079-1089. 12. Bolli G .В., Fanelli C. G. Physiology of glucose counterregulation to hypoglycemia // Endocrinol. Metab. Clin. 1999. Vol.28, N3. P. 467-493. 13. Cohen N., Rossetti L., Shlimovich P., Halberstam M., Ни M., Shamoon H. Counterregulation of hypoglycemia. Skeletal muscle glycogen metabolism during three hours of physiological hyperinsu-linemia in humans // Diabetes. 1995. Vol. 44, N 4. P. 423-430. 14. Dirks В., HankeЛ Krieglstein J., Stock R., WickopG. Studies on the linkage of energy metabolism and neuronal activity in the isolated perfused rat brain // J. Neurochem. 1980. Vol. 35, N 2. P. 311-317.15. Duncombe W. The colorimetric microdetermination of non-esterified fatty acids in plasma// Clin. Chim. Acta. 1964. Vol. 9, N 2. P. 122-125. 16. Erecinska M., Nelson D., Silver I. A. Metabolic and energetic properties of isolated nerve ending particles (synaptosomes) // Biochim. Biophys. Acta. 1996. Vol. 1277. P. 13-34. 17. Ferre P., ForetzM., Azzout-Marniche D„ BecardD., Foufelle F. Sterol-regulatory-element-binding protein lc mediates insulin action on hepatic gene expression // Biochem. Soc. Trans. 2001. Vol. 29. P. 547-552. 18. IkedaM., YoshidaS., Busto R., Santiso M., Martinez E., Ginsberg M.D. Cerebral phosphoinositide and energy metabolism during and after insulin-indnced hypoglycemia // J. Neurochem. 1987. Vol. 49, N 1. P. 100-106. 19. Kemp A., Kits A. A colorimetric micromethod for the determination of glycogen in tissues // Biochem. J. 1954. Vol. 56, N 4. P. 646-648. 20. LiptonP., RobackerK. Glycolysis and brain function: [K+] stimulation of protein synthesis and K+ uptake require glycolysis // Fed. Proc. 1983. Vol. 42, N 12. P. 2875-2880. 21. Upton P. Glycolysis is necessary for normal synaptic transmission in guinea-pig hippo-campal slices // Soc. Neurosci. Abstr. 1991.Vol. 17. P. 1155. 22. Lopes-Cardozo M., LarssonO. M., Schousboe A. Aceto-acetate and glucose as lipid precursors and energy substrates in primary cultures of astrocytes and neurons from mouse cerebral cortex // J. Neurochem. 1986. Vol. 46, N 3. P. 773-778. 23. MagenA., Koren-Schwartzer N., Chen-Zion M„ Beit-ner R. Effect of insulin-induced hypoglycemia on cytoskeleton-bound and cytosolic phosphofructokinase and the levels of glucose 1,6-bisphosphate in rat brain // Biochem. Mol. Med. 1995. Vol. 56, N 2. P. 94-98. 24. Magistretti P: J, Pellerin L. Cellular mechanisms of brain energy metabolism: Relevance to functional brain imaging and to neurodegenerative disorders //Annu. NY Acad. Sci. 1996. Vol. 777. P. 380-387. 25. Marks V.. Teale J. D. Hypoglycemia: factitious and felonious // Endocrinol. Metab. Clin. 1999. Vol. 28, N 3. P. 579-601. 26. Nabetani M., Okada Y„ KawaiS., Nakamura H. Neural activity and the levels of high energy phosphates during deprivation of oxygen and/or glucose in hippocampal slices of immature and adult rats // Int. J. Dev. Neurosci. 1995. Vol. 13. P. 3-12. 27. Pellerin L.. Magistretti P. J. Glutamate uptake into astrocytes stimulates aerobic glycolysis: a mechanism coupling neuronal activity to glucose utilization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 91. P. 10625-10629. 28. RosJ., Pecinska N., Alessandri В., Landolt#., FillenzM. Lactate reduces glutamate-induced neurotoxicity in rat cortex // J. Neurosci. Res. 2001. Vol. 66, *N 5. P. 790-794. 29. SiesjoB.K., Agardh C. D. Hypoglycemia // Handb. Neurochem. 1983. Vol. 3. P. 353-379. 30. Strosznajder J. Effect of hypoglycemia on the brain free fatty acid level and the uptake of fatty acids by phospholipids 11 Neurochem. Res. 1984. Vol. 9, N 4. P. 465-476. 31. Timothy G. R. Obesity, Fat cells //Endocrinol. Metab. Clin. 1996. Vol.25, N4. P. 847-867. 32. Tom-baugh G. C„ SapolskyR. M. Evolving concepts about role of acidosis in ischemic neuropathology // J. Neurochem. 1993. Vol. 61, N 3. P. 793-803. 33. Winder W. W„ CarlingJ. M., Duan C„ Jones J. P., Palmer S. L.. Walker M. C. Muscle fruc-tose-2,6-bisphosphate and glucose-1,6-bisphosphate during insulin-induced hypoglycemia // J. Appl. Physiol. 1994. Vol.76, N 2. P. 853-858. ■
Статья поступила в редакцию 18 марта 2004 г.
