CC BY
32
Г истоморфометрическое исследование суставного хряща при удлинении голени в сочетании с интрамедуллярным армированием противоизогнутыми спицами
Т.А. Ступина, к.б.н., Российский НЦ «Восстановительная травматология и ортопедия», г. Курган
Длительное ограничение движения, возникающее при дистракционном остеосинтезе, создаёт проблему сохранения суставного хряща и функции суставов [1, 2, 8—10]. В последние годы становится актуальной потребность в дополнительных воздействиях на процесс дистрак-ционного костеобразования с целью сокращения сроков лечения. В связи с этим разрабатываются различные способы стимуляции остеогенеза. Экспериментально-морфологическими исследованиями доказано, что удлинение в сочетании с интрамедуллярным напряжённым армированием спицами сопровождается усилением эндосталь-ного и периостального остеогенеза, что позволяет реально увеличить темп дистракции и сократить сроки остеосинтеза [3]. При этом помимо сокращения сроков лечения одним из важных аспектов является функциональное состояние удлиняемой конечности [1]. В связи с этим для выяснения морфофункционального состояния суставного хряща на этапах удлинения голени в сочетании с интрамедуллярным напряжённым армированием спицами предпринято настоящее исследование.
Материал и методы. Суставной хрящ мыщелков бедренной кости исследован на девяти опытных собаках, которым после закрытой флексионной остеоклазии берцовых костей в течение 28 дней осуществляли дистракцию правой голени аппаратом Илизарова с суточным темпом 1 мм за четыре приёма в сочетании с интрамедуллярным армированием противоизо-гнутыми спицами (экспериментатор — д.м.н. С.А. Ерофеев). Этапы исследования: 15, 30 суток фиксации, 30 суток после снятия аппарата. Содержание животных, оперативные вмешательства и эвтаназию осуществляли согласно приказу МЗ СССР № 755, 1977 г.
Для гистоморфометрического анализа применяли серийные перпендикулярные суставной поверхности эпоксидные полутонкие срезы большой площади (4—8 мм2), окрашенные метиленовым синим и/или метиленовым синим-основным фуксином. На фотомикроскопе Ор1;оп (Германия) с АПК DiaMorph (Москва) изображения препаратов оцифровывали и анализировали в программе «ВидеоТест-Мастер-Морфология».
Измерения проводили в микрометрах после предварительной геометрической калибровки
по оцифрованной с тем же увеличением шкале объект-микрометра. Определяли толщину суставного хряща (h, мкм), объёмную плотность хондроцитов (VVX4,%) в ткани, численную плотность хондроцитов (NÂX4) и долю (%) изоген-ных групп (NAœ. jp) в общем объёме выборки. Рассчитывали средний объём межклеточного вещества (VV^, мкм3/мкм3) на одну клетку. В качестве контроля морфометрировали суставной хрящ пяти интактных животных. Для анализа цифрового материала использовали описательную статистику. В зависимости от характера распределения, достоверность различий оценивали с помощью критериев Стьюдента или Вилкоксона в программе AtteStat, версия 1.0 [4] в электронных таблицах Microsoft Excel 97.
Рельеф суставной поверхности изучали в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) JSM-840 (Jeol, Япония): материал дегидратировали в спиртах, пропитывали в камфене (3,3-диметил-2-метиленбициклогептан — ГОСТ 15039-76), высушивали на воздухе, напыляли серебром [4, 5].
Результаты и их обсуждение. Через две недели фиксации при изучении в СЭМ выявлены неровности суставной поверхности, на отдельных участках отсутствовала бесклеточная пластинка, обнаружены вскрытые клеточные лакуны (рис. 1А). При светооптическом исследовании полутонких срезов в поверхностной зоне нарушена гомогенность межклеточного вещества, в очагах разволокнения хондроциты в состоянии деструкции, отмечены пустые клеточные лакуны (рис. 1Б).
Часть хондроцитов поверхностной зоны отличалась большими размерами, интенсивно базофильной цитоплазмой с секреторными гранулами. Отмечено увеличение количества двухчленных изогенных групп. В промежуточной зоне также наблюдалось большое количество изогенных групп клеток. Хондроциты характеризовались высокой метаболической активностью, содержали секреторные гранулы. Межклеточное вещество имело гомогенный вид. В глубокой зоне наблюдалось уменьшение числа клеток в колонках, отмечена интенсивная метахромазия территориального матрикса. Целостность ба-зофильной линии не нарушена. При количественном исследовании выявлено уменьшение толщины хряща на 7% по сравнению с контролем. В поверхностной и промежуточной зонах
Рис. 1 - Суставной хрящ (15 суток фиксации):
А - суставная поверхность. СЭМ. Увеличение 1000;
Б - поверхностная зона хряща, полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином, об. - 40; ок. - 12,5х
Количественные характеристики хрящевой ткани наружного мыщелка бедра при удлинении голени с использованием интрамедуллярного напряжённого армирования (Х+$х)
Параметры Зона УУхц, % ЫЛхд, мкм-2 И хряща, мкм % ^УмКв на 1 клетку
1 6,1±0,64 8,2±0,99
Контроль 2 3 8,7±1,9 12,2±2,2 4,4±0,64 5,7±0,75 475,5±1,3 14,5 1175,12±63,86
15 суток фиксации 1 11,8±0,64 10,6±0,7
2 3 10,46±0,91 6,9±0,93 5,7±0,3 5,4±0,5 446,3±2,5 26,9 1178,03±96,92
30 суток фиксации 1 5,5±0,49 11,7±1,1
2 3 7,21±0,72 7,6±0,89 6,3±0,5 5,5±0,65 343,7±3,8 25,5 942,71±86,47
30 суток без аппарата 1 2 3 6,1±0,62 6,6±0,59 7,04±0,56 15,8±1,3 7,5±1,14 6,4±0,8 342,4±2,8 18,9 898,29±93,13
Примечание: жирным шрифтом выделены достоверные различия с контролем.
Для параметров 'У^мкв, МАхц использовали критерий Вилкоксона (при р<0,05), для h хряща — критерий Стьюдента (при р<0,001). 1 — поверхностная; 2 — промежуточная; 3 — глубокая зоны
обнаружено достоверное (р<0,05) увеличение объёмной и численной плотности хондроцитов. В глубокой зоне достоверно установлено снижение объёмной плотности хондроцитов (табл.). Численная плотность изогенных групп была на 12,4% выше контрольных значений, средний объём межклеточного вещества на одну клетку сопоставим с нормой.
Через 30 суток фиксации деструктивные изменения суставного хряща были более выражены. Межклеточное вещество поверхностной зоны разволокнено, снижена интенсивность его окраски. Обнаружены изменения цитоархитектоники промежуточной зоны: преобладали трёх-, четырёх-, пятичленные изогенные группы клеток. Значительно уменьшилась толщина хряща (табл.). Численная плотность изогенных групп была на 11% выше контрольных значений. В поверхностной и промежуточной зонах продолжалось увеличение (р<0,05) МАхц. Однако вновь образованные клетки, входящие в состав изогенных групп, а также большая часть одиночно расположенных хондроцитов находились
в состоянии деструкции. Выявлено снижение (р<0,05) ’УУщ во всех зонах хряща. Средний объём межклеточного вещества в расчёте на одну клетку достоверно (р<0,05) снижался (табл.), что свидетельствовало об уменьшении биосинтетической активности хондроцитов. Известно, что пролиферативные и биосинтетические процессы являются конкурентными на уровне отдельной клетки [5].
Через месяц после снятия аппарата при исследовании в СЭМ на суставной поверхности выявлены вскрытые лакуны хондроцитов, часть из них без клеток, наблюдалось формирование узур (рис. 2А). Прогрессировало падение синтетической активности хондроцитов. Резко снизилась интенсивность окраски межклеточного вещества поверхностной и промежуточной зон, что косвенно указывало на минимальное содержание гли-козаминогликанов, обеспечивающих плотность упаковки межклеточного вещества [6]. Отмечены обширные участки разволокнения, выявлялся коллагеновый каркас, большая часть хондроци-тов находилась в состоянии деструкции (рис. 2Б).
Рис. 2 - Суставной хрящ (без аппарата 30 суток):
А - суставная поверхность. СЭМ. Увеличение 850;
Б - поверхностная зона, полутонкий срез, окраска метиленовым синим-основным фуксином, об. - 40; ок. - 12,5х
Уменьшилось количество многоклеточных лакун. Целостность базофильной линии в части наблюдений нарушена, наблюдалось проникновение сосудов в хрящ. Морфометрически выявлено снижение NAraj.jp относительно предыдущих этапов эксперимента, по сравнению с контролем сохранялись повышенные значения. Толщина хряща была достоверно (р<0,001) ниже контроля. Объёмная плотность клеток в поверхностной зоне сопоставима с контролем, в промежуточной и глубокой зонах достоверно (р<0,05) снижена. Сохранялись повышенные значения численной плотности клеток (табл.). Средний объём межклеточного вещества в расчёте на одну клетку достоверно (р<0,05) снижен относительно контроля и предыдущих сроков эксперимента.
Выводы. Таким образом, при удлинении голени аппаратом Илизарова в сочетании с интрамедуллярным напряжённым армированием спицами через 15 суток фиксации в смежных с удлиняемым сегментом суставах выявлены деструктивные изменения хрящевой ткани, одновременно обнаружено усиление пролиферативной и биосинтетической активности части хондроцитов. Наибольшая частота встречаемости изогенных групп клеток наблюдалась в промежуточной зоне и в неповреждённых участках более глубоких слоёв поверхностной зоны.
Полученные нами результаты (о функциональной значимости хондроцитов поверхностной зоны как резерва клеточной пролиферации) согласуются с литературными данными [6, 7]. Наблюдаемые изменения свидетельствовали о достаточно высокой степени выраженности компенсаторных реакций хрящевой ткани и могут быть расценены как реактивные изменения адаптационного генеза. Через месяц фиксации интенсивная пролиферация сочеталась с уменьшением числа секреторно-активных клеток,
наблюдалось угнетение синтеза компонентов матрикса хряща. Закономерным выглядело снижение толщины хряща.
Отмеченные изменения, по нашему мнению, свидетельствуют о срыве компенсаторных возможностей хряща. В результате к концу эксперимента деструктивные изменения хрящевой ткани прогрессировали. Полученные сведения о динамике деструктивно-репаративных изменений суставного хряща необходимо учитывать при проведении дистракционного остеосинтеза в сочетании с дополнительными способами стимуляции остеогенеза.
Литература
1. Шевцов В.И., Попков А.В. Оперативное удлинение нижних конечностей. М.: Медицина, 1998. 192 с.
2. Щудло М.М., Ступина Т.А., Ерофеев С.А. Экспериментальногистологическое исследование суставного хряща наружного мыщелка бедра при удлинении голени собак // Морфология. 2005. № 5. С. 67-71.
3. Попков ДА., Ерофеев С.А., Чиркова А.М. Костеобразование при удлинении голени с использованием интрамедуллярного напряжённого армирования (экспериментальное исследование) // Морфофункциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий: матер. междунар. науч.-практич. конф. Курган, 2004. С. 226-227.
4. Гайдышев И.П. Анализ и обработка данных: специальный справочник. СПб.: Питер, 2001. 752 с.
5. Данилов Р.К., Гололобов В.Г., Одинцова И.А. и др. Гистологические основы регенерации тканей опорно-двигательного аппарата // Ортопедия, травматология и протезирование. 2000. № 2. С. 102.
6. Павлова В.Н., Копьева Т.Н., Слуцкий Л.И. и др. Хрящ. М.: Медицина, 1988. 320 с.
7. Модяев В.П. Некоторые особенности репродукции хондроцитов в суставном хряще // Физиология и патология соединительной ткани. Новосибирск, 1980. Т. 1. С. 149-150.
8. Nakamura E., Mizuta H., Takagi K. Knee cartilage injury after tibial lengthening. Radiographic and histological studies in rabbits after 3-6 months // Acta Orthop Scand. 1995. Aug;66(4). Р. 313-316.
9. Stanitski D.F. The effect of limb lengthening on articular cartilage. An experimental study // Clin Orthop Relat Res. 1994. Apr; (301). Р. 68-72.
10. The effect of tibial lengthening using the Ilizarov method on the cartilage and the menisci of the knee joint / Fink B., Schwinger G., Singer J., Sager M., Wilke C., Braunstein S. // J Orthop Res. 2001 Jul; 19(4). Р. 665-670.
