CC BY
100
© Ф. ЛИКИБИ и др., 2004
ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ И ГИСТОМОРФОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОСТНОЙ ИНТЕГРАЦИИ ПОРИСТОГО NiTi, ИСПОЛЬЗУЕМОГО В КАЧЕСТВЕ ИМПЛАНТАТА ДЛЯ МЕЖТЕЛОВОГО СПОНДИЛОДЕЗА
Ф. Ликиби1,2, С. Шарретт1, М. Ассад3, Ч. Коиллард1, Г. Шабо1, Ч.-Х. Ривард1-23 ‘Hopital Sainte-Justine, Centre de Recherche, Montreal (QC), Canada 2Institut de Genie Biomedical, Ecole Polytechnique/Universite de Montreal, Montreal (QC), Canada
3Biorthex Inc., Montreal (QC), Canada
Имплантат для межтелового спондилодеза из пористого никелида титана (ПНТ) исследовался в эксперименте на овцах. Шестнадцати овцам было установлено по два имплантата: один ПНТ и один системы Bagby and Kuslich (BAK). Цель исследования состояла в оценке костной интеграции, костной проводимости и роста кости в присутствии этих двух имплантатов, подвергаемых одинаковым механическим нагрузкам. После имплантации овцы выводились из эксперимента тремя группами: через три, шесть и двенадцать месяцев. Для исследования брались срезы кейджей и прилегающих тканей позвоночника, которые подвергались качественному (микроскопическое и визуальное исследование) и количественному (гистоморфоме-трия) анализу. Результаты показали, что ПНТ выполнил свою задачу лучше, чем BAK. Строгий статистический анализ этих результатов подтвердил наблюдение. Эффективность имплантатов зависела от биофункциональности, связанной со структурой и формой имплантата. Однако биологическая совместимость обоих имплантатов была сопоставима.
Ключевые слова: пористый никелид титана, ВАК-кейдж, межтеловой спондилодез.
An implant for intervertebral fusion made of porous nickel-titanium (PNT) was evaluated in the ewe. Sixteen ewes received each one two implants: the system «Bagby and Kuslich» (BAK) being used as control and the PNT. The objective was to evaluate the osteointegration, osteoconduc-tion and bone growth in the presence of these two cages subjected to the same mechanical loads. After implantation, the sheeps were sacrificed by group to three different periods: three, six and twelve months, and the spines carrying the implant were taken. The qualitative (microscopic and visual observation) and quantitative (histomorphometry) histological analyses were carried out on histological slices of cages and adjacent tissues. The results indicated that the PNT, had performed better than the BAK. A rigorous statistical analysis of these results made it possible to confirm this observation. The performance of two implants seemed to be influenced by the biofonctionnality which is related to the structure and the shape of the implant. The biocompatibility of two implants seemed however comparable.
Key words: porous nickel-titanium, Bagby and Kuslich implant, interbody fusion.
Введение
В последнее десятилетие не снижается биомедицинский интерес, вызванный внедрением пористого никелида титана (ПНТ) в медицину российскими и китайскими специалистами [2, 4, 5, 11]. Ключевые факторы, определяющие этот интерес, связаны с его механическими свойствами (модуль эластичности близок к кости и ее абсорбционной способности), капил-
лярностью, биологической совместимостью и сообщающейся пористостью, которая обеспечивает проникновение ткани [1, 3, 6]. В данном исследовании ПНТ использовался в качестве имплантата для межтелового спон-дилодеза при лечении приобретенной нестабильности позвоночника. Капиллярность ПНТ обеспечивает его увлажнение при диффузии физиологических жидкостей, переносящих питательные вещества и метаболиты,
121
необходимые для питания костных клеток, мигрирующих из прилегающих позвонков в межпозвонковое пространство и в имплантат (костная интеграция). Эти костные клетки, мигрируя, могут быстро колонизировать (костная проводимость) доступное увлажненное пространство с питательными веществами, принесенными физиологическими жидкостями. Таким образом, результатом будет эффективное формирование кости вну-
три имплантата и на его поверхности и, как следствие, эффективный арт-родез (костный блок), который стабилизирует прилегающие позвонки. Увлажнение имплантата также обеспечивает его фиксацию вновь сформированной костной тканью [6]. Цель работы состояла в том, чтобы проверить эти свойства ПНТ в физиологической среде гистологическими и ги-стоморфометрическими методами.
Материал и методы
В качестве модели использовалась овца. Отсутствие искривлений позвоночника (лордоза и кифоза), характерное для этого четвероногого животного, обеспечивает ему большую механическую вертикальную и горизонтальную устойчивость. Это позволяет удерживать позвоночник в горизонтальном положении без сгибания [8]. Четвероногое животное, таким образом, является превосходной моделью для исследования позвоночного столба.
Перед операцией 16 самок выдерживались без пищи в течение 48 часов. Вводная анестезия выполнялась кета-мином (50 мг/мл; 0,12 мл/кг, 6 мг/кг, Ayest Laboratories; Guelph, ONE, Canada) и эквивалентным введением валиума (диазепам; 5 мг/мл, 0,6 мг/кг, Sabex Inc, Boucherville, QC, Канада) внутривенно, с использованием катетера диаметром 20G. Анестезия поддерживалась эндо-трахеальной интубацией с галотаном (1,0—1,5 % в O2; MTC Pharmaceuticals, Cambridge, ONE, Canada).
Доступ к поясничному отделу осуществлялся из левосторонней забрю-шинной области в положении животного на правом боку. Продольный разрез длиной 10-15 см выполнялся на уровне поперечных отростков. Кровопотеря контролировалась электрокоагуляцией. Внешние брюшные мышцы отделялись от поперечных отростков, что позволяло обнажить поясничную мышцу. Имплантат из ПНТ (рис. 1) устанавливался через доступ для переднего поясничного меж-телового спондилодеза с использованием модифицированного инструментария для заднего поясничного межтелового спондилодеза [9, 10].
В межпозвонковое пространство вводились направители (примерно в середину диска), и выполнялось первоначальное просверливание. Фреза и винторезная головка доводились до замыкательной пластины, после чего с усилием внедрялся имплантат из ПНТ. Система ВАК (рис. 2), изготовленная из чистого титана, использовалась в качестве контрольного имплантата. Чистый титан (Ті) и сплав ТІ-6А1-4У считаются биосовместимы-ми металлами с хорошим сопротивлением коррозии [13-15, 20, 21]. Поскольку ВАК - непористый имплантат, то он требует использования костного аутотрансплантата из гребня подвздошной кости. ВАК устанавливался по тому же протоколу, что и ПНТ, - путем ввинчивания в нужном положении. Каждой овце имплантировались оба вида имплантатов с чередованием уровней Ь2—Ьз и 14-15,
чтобы каждый имплантат подвергался одинаковой механической нагрузке. Контрольная группа состояла из неоперированных овец. Рана ушивалась послойно рассасывающимся материалом. Послеоперационный контроль расположения имплантатов в поясничном отделе позвоночника осуществлялся рентгенографически.
Овцы выводились из эксперимента группами: две группы по семь овец (шесть с имплантатами и одна контрольная) через три и шесть месяцев и третья из пяти овец (четыре с имплантатами и одна контрольная) через двенадцать месяцев. Для этих целей использовался Euthanil (0,1мг/кг, MTC Pharmaceuticals, Cambridge, ONE, Canada) и игла 20G.
Поясничный отдел (L1—L6) удалялся и немедленно фиксировался в нейтральном формалине (10 %). Препараты промывались и хранились в 70 % этаноле. Затем они обезвоживались последовательно в 80, 95 и 100 % эта-ноловых ваннах и очищались ксилолом. С помощью пилы Exakt (Exakt Technologies, Oklahoma City, OK, USA) делались срезы толщиной 70цм, содержащие металлический имплантат, костную и волокнистую ткани. Затем каждый срез окрашивался синим по Стевенелу (мягкие ткани) и по Ван-Гизону с пикрофуксином (кальцинированная костная ткань) [17, 18].
Макроскопический анализ. Полный макроскопический анализ гистологических срезов выполнялся с использованием цифровой камеры (Nikon Model E950). Непосредственный контакт костного матрикса с имплантатом являлся критерием полного костного сращения. Наличие твердой и мягкой ткани на периферии имплантата рассматривалось как неполное сращение, а присутствие в этой области только мягкой ткани -как отсутствие сращения.
Статистический анализ. Для выявления статистически значимых различий между сращениями этих имплантатов были выполнены одномерные анализы с использованием точных критериев хи-квадрат и Фишера.
Рис. 1
Имплантат из ПНТ
Рис. 2
Кейдж BAK
122
экспериментальные исследования
Микроскопный анализ. Структурное изменение и клеточная активность в имплантате и на его периферии оценивались с использованием трансмиссионной световой микроскопии (Шса DMLP).
Гистоморфометрическая оценка. Для гистоморфометрической оценки
использовался метод, описанный Assad и др. [19]. Срезы изучались с использованием трансмиссионного светового микроскопа (Nikon Model Eclipse ME-600D) с цветной аналоговой камерой (Sony DXC-950P; Clemex Analysis Image) и программным обеспечением анализа изображения (Clemex VisionTM 3.0;
Clemex Image Analysis). Обработка состояла в предварительном выборе определенного цвета для каждой зоны (структуры): кальцинированной костной ткани, мягкой ткани, металла -кости, металла - мягкой ткани. Компьютер давал процентное содержание каждого цвета, представляющего ту или иную структуру. Для определения различий между двумя имплантатами был выполнен статистический анализ с использованием критерия Стьюдента.
Результаты
Макроскопический анализ (рис. 3) показал, что большинство имплантатов из ПНТ (15/16, 93,7 %, табл. 1) демонстрируют костную интеграцию и прямой контакт с костным матриксом, тогда как только 3 из 16 титановых имплантатов (18,75 %, табл.1) имели полное костное сращение. Продолжительность имплантации также, видимо, оказывала воздействие на интеграцию. Соединение ПНТ с костью к 3 и 6 мес. было лучшим, чем соединение BAK (р < 0,05, p < 0,01, табл. 1); к 12 мес. это различие не было статистически значимым. Гистоморфомет-рический анализ (табл. 2) подтвердил результаты макроскопических наблюдений. Различие в количестве прилежащей костной ткани у двух имплантатов статистически значимо во времени (р < 0,01, табл. 2). Различие в интеграции кости у двух имплантатов статистически значимо в 6 и 12 мес., тогда как для срока в 3 мес. разницы не наблюдалось.
По периферии имплантата из ПНТ микроскопический анализ выявил присутствие либо остеобластов, либо волокон мягких тканей (рис. 4). Последние были ориентированы перпендикулярно к поверхности независимо от срока имплантации (рис. 4M). Остеобласты активно синтезировали костный матрикс. Имплантаты BAK были окружены мягкой тканью, хонд-роцитами и остеокластами. В 3 мес. волокна ткани располагались параллельно поверхности имплантата BAK (рис. 4N). Начиная с 6 мес. (рис. 4O), их ориентация медленно менялась на перпендикулярную. Эта переориента-
Рис. 3
Макроскопический анализ гистологического среза с использованием цифровой камеры (Nikon Model E950):
A — ПНТ в фиброзной капсуле, отделяющей его от костной ткани;
B — срастание ПНТ с фиброзной и костной тканями;
C — 100 % срастание ПНТ с костной тканью;
D — BAK в фиброзной капсуле, отделяющей его от костной ткани;
E — срастание BAK с фиброзной и костной тканями;
F — 100 % срастание BAK с костной тканью
123
ция заканчивалась через 12 мес. после наложения инструментария (рис. 4Р), что приводило к эффективной остеоинтеграции.
Обсуждение
Гистологический анализ дал возможность проверить вышеуказанные предположения на тканевом и клеточном уровнях. В присутствии ПНТ формирование кости было весьма
эффективно уже к 3 мес. (рис. 40, Н), и вокруг ПНТ не обнаруживалось активной зоны резорбции, когда мягкая ткань была все еще объемной (рис. ЗА и 40). Это свидетельствует о том, что в условиях устойчивости и биосовместимости остеокластическая резорб-
Рис. 4
Микроскопический анализ структурного изменения и клеточной активности в имплантате и по его периферии:
G — рост мягкой и костной тканей по периферии ПНТ;
H — рост и прилежание костной ткани при ПНТ;
I, J — незрелая костная ткань вокруг BAK;
K, L — абсорбция кости вокруг BAK;
M — перпендикулярная ориентация волокон мягкой ткани по периферии ПНТ;
N, O, P — ориентация волокон мягкой ткани по периферии BAK через З, б и 12 мес. соответственно;
Q, R — костная фиксация BAK и рост костной ткани через 12 мес. при BAK;
S — эндохондральная оссификация при ВАК;
1 — остеобласты (синие зерна) в активном состоянии, расположенные по периферии кости;
2 — мягкая ткань;
3 - ПНТ;
4 — незрелая костная ткань;
5 — зона остеокластической резорбции;
6 — BAK;
7 — остеокласты, абсорбирующие кость, контактирующую с BAK;
8 — эндохондральная оссификация, контактирующая с BAK
______________124_______________
экспериментальные исследования
Таблица 1
Статистические различия между ВАК и ПНТ
Тип сращения Всего 3 мес. 6 мес. 12 мес.
I ПНТ I ВАК ПНТ I ВАК I I ПНТ I ВАК ПНТ ВАК
Кость — 15 3 5 0 6 0 4 3
имплантат (93,7%) (18,75%) (83,3%) (0 %) (100%) (0 %) (100 %) (75 %)
Волокнистая
ткань — 13 1 6 0 6 0 1
имплантат (6,3 %) (81,25%) (16,6%) (100 %) (0 %) (100 %) (0 %) (25 %)
Статистика о ©~ £ PJ0,05** ,01 ©~ £
*критерий Стьюдента; **точные критерии Фишера.
Таблица 2
Статистический анализ контакта с костным матриксом и остеоинтеграции имплантатов ВАК и ПНТ
Контакт с костным матриксом Остеоинтеграция, %
Срок | ПНТ 1(Б5) | ВАК 1(05) | Р ПНТ 1(Б5) | ВАК 11(05) | Р
3 мес. 10,24 (9,1) 3,49 (2,24) О 0, VI 21,18 (15,67) 22,1 (11,67) -
6 мес. 25,69 (11,47) 1 (1,26) <0,01* 33,14 (15) 22,8 (13,17) <0,05*
ес м 2 26,9 (9,6) 5,21 (5,5) О 0, < 38,8 (10,11) 25 (6,6) Р<0,01*
*критерий Стьюдента.
ция прекратилась.
Вокруг ВАК резорбция кости происходила очень активно (рис. 4К и Ь). На рис. 41 и J видна беспорядочная пролиферация костного матрикса, формирующего вокруг ВАК плохо организованную кость в тех зонах, где резорбция отсутствовала. Также наблюдалась очень высокая концентрация клеток, которые, судя по их большим размерам, видимо, являются хондроцитами, возможно смешанными с очень незначительным количеством остеоцитов. Наличие плохо организованной и незрелой кости, возможно, связано с окостенением мягкой ткани путем эндохондральной оссификации (рис. 48).
В случае с ПНТ ситуация хорошо развивалась во времени, и к 6 мес. сращение кости и имплантата было почти полным. Уже к 3 мес. кость, контактирующая с имплантатом, была хорошо организована и имела пластинчатый характер (рис. 4Н). В слу-
чае с ВАК формирование той кости, которая наблюдается в 12 мес., видимо, начинается через 6 мес. после имплантации. При контакте с ВАК кость приобретает пластинчатую структуру к 12 мес. (рис. 4Q и R).
Несколько факторов, большинство из которых связано с особенностями поверхности, повлияло на эффективность функционирования этих двух моделей имплантатов. Жесткость ПНТ (модуль эластичности = 1,13 ОРа) близка к жесткости кости (приблизительно 15 ОРа), что обеспечивало хорошее распределение нагрузки [24, 25]. Значительно более высокая, чем у кости, жесткость титана (модуль эластичности = 110 ОРа), видимо, вызвала неустойчивость и, таким образом, отсутствие окрашенности участков активного остеолиза вокруг имплантата и аккумуляцию мягкой ткани. Пористость, видимо, явилась решающим фактором эффективности функционирования ПНТ, обеспечивая его
интеграцию и быстрое врастание костной ткани. Другое свойство ПНТ, которое в большой степени способствовало его эффективности, - капиллярность. Физические характеристики поверхностей имплантата, видимо, влияли также и на волокна мягких тканей. Вокруг ПНТ эти волокна были направлены перпендикулярно имплантату (рис. 4М) во все периоды оценки, тогда как волокна вокруг ВАК имели разную ориентацию в зависимости от срока. В 3 мес. они располагались параллельно имплантату, в 6 мес. начали менять ориентацию, которая к 12 мес. стала полностью перпендикулярной имплантату (рис. 4^ О и Р), что совпадало с эффективным началом остеоинтеграции ВАК.
Объем кости в ПНТ составлял 21,4 % объема его пор. Поскольку ПНТ использовался без костного трансплантата, то очевидно, что эта масса кости была вновь сформирована из прилегающих позвонков. Этот объем по-
125
стоянно возрастал до 32,9 % к 6 мес. и до 37,61 % к 12 мес. (табл. 2). Объем кости в ВАК эволюционировал по-другому: с 22,7 % в 3 мес. он снизился до 21,7 % к 6 мес. и, наконец, достиг 25,4 % к 12 мес. (табл. 2).
Напомним, что ВАК использовался с костным трансплантатом, который на первом этапе обеспечивал преимущество в объеме костного материала. Уменьшение этого объема в период от 3 до 6 мес. можно объяснить некрозом трансплантата и отсутствием остеоинтеграции. Увеличение объема к 12 мес. можно отнести за счет формирования кости. Сращение кости и ВАК, отмеченное через 12 мес. в 75 % случаев, позволяет предположить, что формирование кости произошло за счет прилегающих позвонков.
Исключительная эффективность ПНТ выражалась в количестве прилежащей костной ткани (табл. 2): 11 % к 3 мес., 25,09 % к 6 мес. и 24, 87 %
Литература
1. Shabalovskaya SA. On the nature of the biocompatibility and on medical applications of NiTi shape memory and superelastic alloys. Biomed Mater Eng 6: 267-289; 1996.
2. Gunter VE. Superelastic shape memory implants in maxillofacial surgery. Traumatology, Orthopaedics and Neurosurgery. Tomsk, Russia; 1995.
3. Perrkins J, Hodgson D. The two-way shape memory alloys, dans Shape memory in engineering aspects of shape memory alloys. Melton KN, Stockel D, Wayman CM, Duenrig TW, Butterworth-heinemann, London, UK: 195-206; 1990.
4. Brailovski V, Trochu F. Review of shape memory alloys medical applications in Russia. Biomed Mater Eng 6: 291-298; 1996.
5. Kuo PPF, Yang PJ, Zhang YF, Yang HB, Yu YF, Dai KR, Hong WQ, Ke MZ, Cai TD, Tao JC. The use of nickel-titanium alloy in orthopaedic surgery in China. Orthopaedics 12: 111-116; 1989.
6. Hernandez R, Polizu S, Turenne S, Yahia l’H.
Characteristics of porous nickel-titanium alloys for medical applications. Biomed Mater Eng 12: 37-45; 2002.
к 12 мес. Эту нисходящую тенденцию, отмеченную в 12 месяцев, можно объяснить, помимо прочих причин, перепланированием кости при некрозе остеоцитов, вызванном хирургической травматической ишемией.
Количество костной ткани, прилежащей к ВАК, составило 3,31 % в 3 мес., 1,07 % в 6 мес. и 5,08 % в 12 мес. (табл. 2). Контакт между костным трансплантатом и ВАК, созданный хирургическим путем, видимо, был потерян, а контакт с новой костью формировался не так быстро, как у пористого N111.
Заключение
Это исследование показало биофунк-циональные особенности ВАК, связанные с его нестабильностью в месте имплантации. Нестабильный имплантат может мигрировать во всех направлениях и вызывать такие ос-
7. Gotthardt R, Lehnert T. Alliages a memoire de forme, dans Materiaux emergents. Vol. 19. Janot C, Iischner B. Presses poly techniques universitaires romandes, Suisse; 2001.
8. Smit TH. The use of quadruped as an in vivo model for the study of the spine - biomechanical considerations. Eur Spine J 11: 137-144; 2002.
9. Karpinski MR, Szymanska M. Posterior lumbar interbody fusion and cages. Chir Narzadow Ruchu Ortop Pol 64: 463-470; 1999.
10. Sandhu HS, Turner S, Kabo MJ, Kanim LEA, Liu D, Nourparvar A, Delamarter RB, Dawson EG. Distractive properties of a threaded interbody fusion device. Spine 21: 1201-1210; 1996.
11. Lu S. Medical applications of NiTi alloys in China, dans Shape Memory in Engineering Aspects of Shape Memory Alloys. Melton KN, Stockel D, Wayman CM, Duenrig TW, Butterworth-Heinemann, London, UK: 445-446; 1990.
12. Steffen T, Tsantrizos A, Fruth I, Aebi M. Cages: designs and concepts. Eur Spine J 9: S89-S94; 2000.
ложнения, как сосудистые нарушения, компрессию нервной ткани, остеолиз и воспаление. Зона некроза и не снабжаемая кровью волокнистая ткань образуют область, в которой организм не оказывает эффективного сопротивления развитию инфекции. Сосудистые повреждения, вызванные миграцией имплантата, также становятся источниками инфекций, разносимых кровью. Стабильность ПНТ в месте имплантации и его быстрое сращение с костью оставляют меньше места для аккумуляции волокнистой ткани. На эффективность каждого имплантата повлияли также его структура и форма.
13. Kim TI, Han JH, Lee IS, Lee KH, Shin MC, Choi
BB. New titanium alloys for biomaterials: a study of mechanical and corrosion properties and cytotoxicity. Biomed Mater Eng 7: 253-263; 1997.
14. Khan MA, Williams RL, Williams DF. Conjoint corrosion and wear in titanium alloys. Biomaterials 20: 765-772; 1999.
15. Yoda S, Sakurai Y, Endo A, Miyata T, Otake K, Yanagishita H, Tuchiya T. TiO2 montmorillonite composites via supercritical intercalation. Chem Commun 14: 1526-1527; 2002.
16. Hodges CD, Humphreys SC, Eck JC, Murphy RB. Intraoperative loosening of Bagby and Kuslich Cages during anterior lumbar interbody fusion. J Spinal Disorders 13: 535-537; 2000.
17. Meraw SJ, Reeve CM, Wollan PC. Use of alendronate in peri-implant defect regeneration. J Periodontol 70: 151-158; 1999.
18. Froum S, Cho SC, Rosenberg E, Rohrer M, Tarnow D. Histological comparison of healing extraction sockets implanted with bioactive glass or demineralized freeze-dried bone allograft: a pilot study. J Periodontol 73: 94-102; 2002.
19. Assad M, Jarzem P, Leroux MA, Coillard C,
Charette S, Rivard CH. Porous nitinol for lumbar intervertebral fusion in a sheep model: part 1. Histomorphometric and radiological analysis. J Biomed Mater Res 64B: 107-120; 2003.
20. Carvalho LC, Konig JB. Histological findings of bone remodelling around smooth dental titanium implants inserted in rabbit's tibias. Ann Anat 184: 359-362; 2002.
21. Schroeder A, van der Zypen E, Stich H, Sutter F. The reactions of bone, connective tissue, and epithelium to endosteal implants with titanium-sprayed surfaces. J Maxillofac Surg 9: 15-25; 1981.
22. Kuslich SD, Ulstrom CL, Griffith SL, Ahern JW, Dowdle JD. The Bagby and Kuslich method of lumbar interbody fusion. History, techniques, and 2-years follow-up results of a United States prospective, multicenter trial. Spine 23: 1267-79; 1998.
23. Bagby G. The Bagby and Kuslich (BAK) method of lumbar interbody fusion. Spine 24: 1857; 1999.
24. Gautier E, Perren SM, Cordey J. Strain distribution in the plated and unplated sheep tibia: an in vivo experiment. Injury 31: C37-44; 2000.
25. Glassman AH, Crowninshield RD,
Schenck R, Herberts P. A low stiffness composite biologically fixed prosthesis. Clin Orthop 393: 128-36; 2001.
Адрес для переписки:
Prof. Charles H. Rivard M.D. Hopital Sainte-Justine 3175 Chemin Cote Ste-Catherine Montreal, Canada
