CC BY
42
УДК 616.141-018:616-092.9-001.18/. 19:615.322
ГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВЕНОЗНОГО РУСЛА РЕСПИРАТОРНОГО ОТДЕЛА ЛЕГКИХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ, ПОДВЕРГНУТЫХ ХРОНИЧЕСКОМУ ПЕРЕОХЛАЖДЕНИЮ, ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ В ОРГАНИЗМ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА
С.В.Зиновьев
Амурская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ,
675000, г. Благовещенск, ул. Горького, 95
РЕЗЮМЕ
Механизм прямого воздействия биофлавонои-дов на тканевой гомеостаз органов дыхания при переохлаждении организма остается недостаточно изученным. Выполнена комплексная гистохимическая характеристика венозного русла респираторного отдела легких экспериментальных крыс, которых на протяжении 3 месяцев подвергали охлаждению в климатокамере при -15°С в течение
1 часа в день. При этом часть животных получала биофлавоноид дигидрокверцетин в дозе 50 мг на кг массы тела в качестве пищевой добавки. Установлено, что длительное воздействие низких температур на организм экспериментальных животных приводит к местному гемосидерозу ткани легких, что свидетельствует о развитии дистрофии тканей органов дыхания. Отмечается отложение аргенто-фильного материала, характерного для аскорбиновой кислоты, в цитоплазме клеток, находящихся рядом с наружной оболочкой вен респираторного отдела легких экспериментальных животных. Определяется гранулярное окрашивание ализарином красным-С эритроцитов, содержащихся в венах респираторного отдела легких экспериментальных крыс, которые получали в составе питания дигидрокверцетин.
Ключевые слова: венозное русло, респираторный отдел легких, хроническое переохлаждение, дигидрокверцетин.
SUMMARY
HISTOCHEMICAL CHARACTERISTIC OF THE
VEIN CHANNEL OF LUNGS RESPIRATORY PART OF EXPERIMENTAL ANIMALS
SUBJECTED TO CHRONIC HYPOTHERMIA AFTER DIHYDROQUERCETIN INTAKE
S.V.Zinov'ev
Amur State Medical Academy, 95 Gor'kogo Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation
The mechanism of direct influence of bioflavonoids on the tissue homeostasis of respiratory apparatus at organism hypothermia has not been studied enough. Complex histochemical characteristic of the vein channel of lungs respiratory part of experimental rats which during three months were subjected to hypothermia in climate camera at 15°C one hour a day was done. At the same time bioflavonoid dihydroquercetin in a dose of 50 mg/kg of the body mass was given to the part of animals as a food additive. It was found out that constant influence of cold temperatures on the body of ex-
perimental animals leads to local pulmonary hemosiderosis, which proves the development of respiratory apparatus tissue dystrophy. There is also the deposition of argyrophilic substance typical for ascorbic acid in the cytoplasm of cells that are near the outer membrane of veins of the respiratory part of experimental animals’ lungs. The granular coloring of erythrocytes by Alizarin red S is identified in the veins of lungs respiratory part of experimental rats which had dihydroquercetin in their meals.
Key words: vein channel, respiratory part of lungs, chronic hypothermia, dihydroquercetin.
Биофлавоноиды относятся к фармакологическим средствам, обладающим широким спектром действия, способным стабилизировать процессы микроциркуляции, а так же исполнять функцию антиагрегантов, адаптогенов, антимутагенов и др. [1,6]. Имеются сведения относительно способности биофлавоноидов выступать в качестве регуляторов структурного обеспечения адаптационных и компенсаторно-приспособительных процессов в случае переохлаждения организма человека и экспериментальных животных [4, 8]. По данным ряда авторов, при цитологическом исследовании трахеобронхиального секрета у жителей Амурской области обнаруживается повышенное присутствие цилиндрического эпителия, что отражает механизм неблагоприятного воздействия на организм человека холодного климата Дальнего Востока [5]. При этом нами было обнаружено, что дигидрокверцетин препятствует повреждению клеток цилиндрического эпителия в носовых ходах здоровых лиц, подвергнутых общему переохлаждению [8]. При цитологическом исследовании назального секрета у здоровых добровольцев на фоне холодового воздействия мы не смогли обнаружить цитологических признаков репарации, а именно выраженной митотической активности клеток [8]. Данный факт ставит под сомнение то, что десквамация цилиндрического эпителия отражает острое повреждение эпителиальной ткани воздухоносных путей в случае воздействия низкой температуры окружающей среды на организм. В силу этого, неизвестными остаются надежные цитологические маркеры воздействия биофлавоноидов и дигид-рокверцетина на организм, а так же холодового повреждения органов дыхания. Поэтому мы считаем, что механизм прямого воздействия дигидрокверцетина на тканевой гомеостаз органов дыхания в случае переохлаждения организма остается недостаточно изученным.
Из данных литературы известно, что биофлавоноиды способны препятствовать окислению аскорби-
новой кислоты в организме, а также нормализовать обмен железа [1]. Поэтому мы предположили, что гистохимические реакции, выявляющие аскорбиновую кислоту, двухвалентное железо и кальций в тканях респираторного отдела легких, могут стать тестами оценки адаптивной роли дигидрокверцетина в случае переохлаждения организма.
Целью исследования явилась комплексная гистохимическая характеристика венозного русла респираторного отдела легких экспериментальных животных, которые получали в качестве пищевой добавки дигид-рокверцетин.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования явились 40 белых беспородных крыс массой 180-240 г. Экспериментальные животные содержались в стандартных условиях вивария Амурской государственной медицинской академии. Протокол экспериментальной части исследования на этапах содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта соответствовал принципам биологической этики, изложенным в Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985), Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986), Приказе М3 СССР №755 от 12.08.1977 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных», Приказе М3 РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики». Исследование одобрено этическим комитетом Амурской государственной медицинской академии.
Животные были разделены на четыре группы, в каждой по 10 крыс. В 1 группе находились интактные животные, которых содержали в стандартных условиях вивария при комнатной температуре, состояние их здоровья исследовали с помощью визуальной оценки двигательной активности и аппетита в зимнее время года. Во 2 группе (контрольной) животных в экспериментальных условиях подвергали воздействию низкой температуры в климатокамере «Fentron» (Германия) при -15°С в течение одного часа на протяжении трех месяцев. В 3 группе животным, которых содержали в стандартных условиях вивария при комнатной температуре, в течение трех месяцев per OS с помощью зонда вводили в составе питания дигидрокверцетин (ЗАО Аметис, Россия) в дозе 50 мг/кг массы тела, препарат предварительно растворяли в теплой воде. В 4 группе крысы так же получали дигидрокверцетин по указанной выше методике, при этом их подвергали воздействию низкой температуры при -15°С в течение одного часа на протяжении трех месяцев.
При завершении научных исследований выведение животных из опыта проводили путем декапитации с соблюдением требований гуманности согласно приложению № 4 к Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к приказу М3 СССР № 755 от 12.08.1977 «О порядке
проведения эвтаназии (умерщвления животного)». С целью гистохимического выявления аскорбиновой кислоты тонкие кусочки (толщиной 0,5 см) легких су-правитально окрашивали 2% раствором азотнокислого серебра в уксуснокислом 70% этаноле. Дополнительно легкие суправитально окрашивали спиртовым раствором ализаринового красного-С, Dahl’s методом в модификации McGee-Russel. В целях обнаружения неорганического двухвалентного железа в тканях в соединении с турнбулевой синью, мы суправитально окрашивали тонкие кусочки (толщиной 0,5 см) легких красной кровяной солью по стандартному методу [10]. После суправитального окрашивания нефиксированных легких Dahl’s методом или окрашивания с целью выявления аскорбиновой кислоты, двухвалентного железа, мы изготавливали срезы тканей легких на микро-томе-криостате «МК25М» (Россия). Срезы легких прикрепляли к предметным стеклам, покрытым желатином.
Результаты исследования и их обсуждение
В проведенных нами ранее цитологических исследованиях респираторной системы в условиях длительного общего охлаждения организма мы не обнаружили выраженной митотической активности клеток, содержание сегментоядерных лейкоцитов в назальном секрете человека и бронхоальвеолярном лаваже экспериментальных животных изменялось недостоверно, микроорганизмы отсутствовали [8]. При помощи растровой микроскопии в мазках костного мозга и периферической крови кроликов, подвергавшихся воздействию низких температур, нами были обнаружены ультраструктурные проявления повреждения мембран эритроцитов, которые характерны для нарушения обмена железа [2]. В такой ситуации в крови присутствуют микроциты и мишеневидные эритроциты. В настоящем исследовании в 1 группе (интактные животные) в ткани легких крыс обнаружены только мелкие гранулы (0,2 мкм) турнбулевой сини. При гистохимическом выявлении неорганического двухвалентного железа отмечается интенсивное отложение гранул (более 0,5 мкм) турнбулевой сини в криостатных срезах тканей периферических отделов легких крыс из 2 (контрольной) группы, подвергнутых воздействию низкой температуры (рис. 1).
По-видимому, отложение турнбулевой сини является проявлением местного гемосидероза легких крыс. С нашей точки зрения, источником неорганического железа в ткани легкого служит активный внут-рисосудистый гемолиз и диапедез эритроцитов в капиллярах (рис. 2). При этом отмечаются явления гипертрофии эндотелиальных клеток, которые представлены округлыми комплексами мономорфных клеточных элементов, расположенных рядом с капиллярами и стенкой альвеол (рис. 1). В венулах и арте-риолах легких происходит обильное кровенаполнение коллатералей, при этом нарушается форма сосудов (спирализация, вздутия, карманы), имеются признаки гипертрофии клеток средней оболочки. Рядом с сосудистой стенкой, или в просвете сосудов микроцирку-ляторного русла наблюдаются единичные митозы
клеток. В нижних дыхательных путях скапливается бронхиальный секрет, который содержит эритроциты и другие клетки, отмечается его кристаллизация. Результаты нашего гистохимического исследования локализации двухвалентного железа в периферических отделах легких подтверждают данные других авторов, которые обнаружили гиперемию легких, диапедез эритроцитов за пределы капилляров в соединительную ткань бронхиального дерева и склероз сосудов легких при адаптации человека к климату Крайнего Севера [5].
Рис. 1. Отложение неорганического железа в районе гипертрофии клеток ткани легкого белой крысы (2 группа). Криостатный срез легкого, суправитально окрашенный на выявление турнбулевой сини. Увеличение: 1250.
Рис. 2. Отложение неорганического железа в вену-лах легкого белой крысы (2 группа). Криостатный срез легкого белой крысы, суправитально окрашенный на выявление турнбулевой сини. Увеличение: 1250.
У экспериментальных животных 3 и 4 групп реакция турнбулевой сини в легких представлена мелкими гранулами (0,2 мкм), расположенными преимущественно в корне легких, а именно, в бронхиальном секрете, в стенке бронхов, вен и периферических ветвей легочной артерии. Это можно объяснить снижением гиперемии сосудов микроциркуляторного русла лег-
ких. Учитывая очень маленький размер обнаруженных гранул, мы провели дополнительное гистохимическое исследование легких крыс. При суправитальном выявлении аскорбиновой кислоты в криостатных срезах легких крыс, мы обнаружили несколько типов арген-тофинных гранул, которые характеризуют присутствие аскорбиновой кислоты в тканях и клетках. При исследовании органов дыхания крыс нами обнаружено сродство к азотнокислому серебру клеток стенки вен, клеточных элементов ацинусов легких. Мелкие гранулы размером около 0,2 мкм, обнаруживаются в толстых участках срезов в составе клеток альвеол, стенок сосудов и межклеточного вещества соединительной ткани легких межацинарного пространства. Крупные гранулы имеют размер более 0,5 мкм. У экспериментальных животных в 4 группе мы обнаружили отложение крупных гранул аргентофильного материала в составе стенки вен легких. Крупные гранулы аргентофильного материла характеризуют отложение аскорбиновой кислоты в клетках, локализованных в наружной оболочке вен органов дыхания, а так же в ткани ацинусов легких, расположенных рядом венами, на поверхности наружной оболочки вен (рис. 3).
Рис. 3. Отложение гранул азотнокислого серебра в клетках наружной оболочки легочной вены белой крысы (4 группа). Криостатный срез легкого. Окраска по N.J.Chinoy. Увеличение: 1250.
В обнаруженных нами аргентофильных клетках цитоплазма полностью заполнена крупными гранулами восстановленного серебра, которые приобретают черно-коричневую окраску. Раствор азотнокислого серебра способен к окрашиванию ионов кальция в тканях. Поэтому, с целью контроля специфичности реакции с аскорбиновой кислотой, мы провели гистохимическое исследование с помощью окрашивания криостатных срезов ализариновым красным-С. Раннее мы установили, что при окрашивании по методу Dahl’s в модификации McGee - Russel, ализарин демонстрирует мелкогранулярный осадок на поверхности эритроцитов периферической крови при экспериментальном охлаждении организма кроликов [2]. В настоящем исследовании нами обнаруживается мелкогранулярное окрашивание ализарином красным-С клеток крови, содержащихся в венах органов дыха-
ния у экспериментальных животных в 3 и 4 группах (рис. 4, 5).
Рис. 4. Легочная вена белой крысы (4 группа). В просвете вены находятся гранулярно окрашенные эритроциты. Криостатный срез легкого, суправитально окрашенный ализариновым красным-С (ГЗаЬГ8 метод). Увеличение: 1250.
Рис. 5. Наружная оболочка легочной вены белой крысы (4 группа) и прилегающие к ней ткани содержат гранулярно окрашенный материал. Криостатный срез легкого, суправитально окрашенный ализариновым красным-С (ГЗаЬГ8 метод). Увеличение: 1250.
При этом стенка мелких вен так же интенсивно окрашивается ализарином. Складывается впечатление, что катионы металлов проникают в большом количестве за пределы вен, в ткань органов дыхания, где отмечается выраженный мелко-гранулярный продукт окрашивания ализарином, который отлагается на поверхности волокон и клеток соединительной ткани, а так же на поверхности клеточных элементов альвеол, бронхиального секрета (рис. 5). При суправитальном окрашивании легких экспериментальных животных во
2 (контрольной) группе, цитоплазма и ядра клеток легких окрашиваются в лиловый или малиновый цвет. Стенка легочных вен так же демонстрирует высокое сродство к ализарину. Соединительная ткань легких слабо окрашена. Между волокнами соединительной
ткани обнаруживаются ярко окрашенные клетки. По данным А.И.Струкова [7] гистохимическая реакция Коса на кальций дает положительный результат в случае тромбоза сосудов человека. Обнаружено отложение ионов кальция в клетках органов дыхания и сосудах легких, периферической крови при бронхиальной астме [3]. По нашим данным, ализарин красный способен к селективному суправитальному окрашиванию тромбов и стенки сосудов. При воздействии холода на организм экспериментальных животных мы отмечаем тромбоз мелких вен и артериол. В просвете венозного русла определяются ярко окрашенные ализарином крупные агрегаты эритроцитов и тромбы (рис. 6).
Рис. 6. Вена легкого белой крысы (2 группа). К внутренней оболочке вены прилегает крупный агрегат эритроцитов. Криостатный срез легкого, суправитально окрашенный ализарином красным-С (ГЗаЬГ8 метод). Увеличение: 1250.
По мнению других исследователей ализарин, пурпурин и другие соединения антрахинонового ряда способны взаимодействовать с гемосодержащими белками, например, пероксидазой [9]. Следовательно, гранулярное окрашивание эритроцитов ализарином может быть объяснено взаимодействием красителя с гемоглобином. Дигидрокверцетин и биофлавоноиды способны хелатировать катионы металлов, выступая в роли антиоксидантов-комплексообразователей, которые обладают свойствами регулировать процессы гипертрофии и репарации клеток и ингибировать свободно радикальное окисление биологических структур [1], поэтому при гистохимическом исследовании подтверждается проникновение препаратов ди-гидрокверцетина в структуры органов дыхания экспериментальных животных. В результате выполненного исследования нами продемонстрировано, что гистохимические методы являются информативными для изучения хелатных соединений биофлавоноидов с катионами металлов в тканях и микроциркуляторном русле органов дыхания, а так же отражают участие аскорбиновой кислоты в метаболизме дигидрокверце-тина, которое локализовано в стенке вен органов дыхания, что может объяснить обнаруженную нами ранее адаптивную активность биофлавоноидов [8].
Таким образом, при гистохимическом исследовании локализации катионов неорганического железа в тканях периферических отделов легких установлено, что длительное воздействие низкой температуры на организм экспериментальных животных способствует развитию дистрофии тканей органов дыхания в результате нарушения микрогемоциркуляции. Отмечается отложение аргентофильного материала, характерного для аскорбиновой кислоты, в цитоплазме клеток, находящихся рядом с наружной оболочкой вен респираторного отдела легких экспериментальных животных. Определяется гранулярное окрашивание ализарином красным-С эритроцитов, содержащихся в венах респираторного отдела легких экспериментальных крыс, которые получали в составе питания дигидрокверцетин.
ЛИТЕРАТУРА
1. Зайцев В.Г., Островский О.В., Закревский В.И. Связь между химическим строением и мишенью действия как основа классификации антиоксидантов прямого действия // Эксперим. и клин, фармакол. 2003. Т.66, №4. С.66-70.
2. Зиновьев С.В. Локализация ионов кальция на мембране эритроцитов кролика при общем охлаждении организма // Диагностика состояния дыхательной системы: материалы XVII сессии СО АМН СССР. Благовещенск, 1988. С.5-8.
3. Кириченко В.И., Дорофиенко Н.Н. Гистохимическая локализация Са2+ в форменных элементах крови больных бронхиальной астмой // Бюл. физиол. и патол. дыхания. 2001. Вып.9. С.7-10.
4. Влияние дигидрокверцетина на продукты пере-кисного окисления липидов при холодовом воздействии / О.Г.Круглова [и др.] // Дальневост. мед. журн. 2011. №3. С.90-92.
5. Луценко М.Т. Состояние здоровья населения Дальневосточного региона и факторы, его определяющие // Бюл. физиол. и патол. дыхания. 1998. Вып.1. С.4-14.
6. Антипролиферативная и антиоксидантная активность новых производных дигидрокверцетина /
В.С.Роговский [и др.] // Эксперим. и клин, фармакол. 2010. Т.73, №9. С.39-12.
7. Струков А.И., Серов В.В., Саркисов Д.С. Общая патология человека. Руководство для врачей: в 2-х т. Т. 1-2. М.: Медицина, 1990. 864 с.
8. Цитоморфологическая характеристика секрета верхних дыхательных путей при воздействии низкой температуры окружающей среды на организм человека на фоне приема дигидрокверцетина / С.С.Целуйко [и др.] // Бюл. физиол. и патол. дыхания. 2011. Вып.42.
С.50-54.
9. Peroxidase-mediated transformation of hydroxy-9,10-anthraquinones / D.Arrieta-Baez [et al]. // Phytochemistry. 2002. Vol.60, №6. P.567-572.
10. Kieman John A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. 4-th edition. Oxford: Scion Publishing, 2008. 606 p.
REFERENCES
1. Zaytsev V.G., Ostrovskiy O.V., Zakrevskiy V.I. EksperimentaVnaya i klinicheskaya farmakologiya 2003: 66(4):66-70.
2. Zinov'ev S.V. Diagnostilm sostoyaniya dykhatel’noy sistemy: material)’ XVII sessii SO AMN SSSR (Diagnostics of the respiratory system state: the materials of XVII session of SB AMS USSR). Blagoveshchensk; 1988:pp.5-8.
3. Kirichenko V.I., DorofienkoN.N. BCdleten'fiziologii ipatologii dyhaniya 2001; 9:7-10.
4. Kruglova O.G., Dorovskikh V.A., Tikhanov V.I., Kruglova T.G., Bocharnikova l.A.Dal'nevostochnyy med-itsinskiy zhurnal 2011; 3:90-92.
5. Lutsenko M.T. Bulleten’ fiziologii i patologii dyhaniya 1998; 1:4-14.
6. Rogovskiy VS., Matyushin A.I., Shimanovskiy N.L., SemeykinA.V., KukharevaT.S., KoroteevA.M., Ko-roteev M.P, Nifant'ev E.E. EksperimentaVnaya i klinicheskaya farmakologiya 2010; 73(9):39-42.
7. StrakovA.I., Serov V.V., Sarkisov D.S., editors. Ob-shchaya patologiya cheloveka [The general pathology of a man]. Moscow: Meditsina; 1990.
8. Tseluyko S.S., Zinov'ev S.V., Kondrakhina A.P, Semenov D. A. Bulleten’fiziologii ipatologii dyhaniya 2011; 42:50-54.
9. Arrieta-Baez D., Roman R., Vazquez-Duhalt R., Jimenez-Estrada M. Peroxidase-mediated transformation of hydroxy-9,10-anthraquinones. Phytochemistry 2002; 60(6):567-572.
10. Kieman John A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. 4-th edition. Oxford: Scion Publishing; 2008.
Поступила 25.06.2012
Контактная информация
Сергей Викторович Зиновьев, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Центральной
научно-исследоватечьской лаборатории, Амурская государственная медицинская академия, 675000, г. Благовещенск, ул. Ленина, 124.
E-mail: [email protected] Correspondence should be addressed to Sergey S. Zinov'ev,
MD, PhD, Senior staff scientist of Central Research Laboratory,
Amur State Medical Academy, 124 Lenina Str., Blagoveshchensk, 675000, Russian Federation.
E-mail: [email protected]
