CC BY
44
УДК 616.2:618.2/.3-06:576.31:611-013.8
Н.Н. Рубцова
ГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПУПОВИНЫ У БЕРЕМЕННЫХ С ОСТРЫМИ РЕСПИРАТОРНЫМИ ВИРУСНЫМИ ИНФЕКЦИЯМИ
РЕЗЮМЕ
С помощью гистохимических методов были изучены 28 пуповин, взятых от женщин, перенесших ОРВИ и практически здоровых беременных. Выявлялась активность следующих ферментов: сукцинат-дегидрогеназы, гистамина, НАДФН-диафоразы, ар-гининдегидрогеназы, кислой и щелочной фосфатазы. Получено, что при ОРВИ наблюдалось увеличение активности гистамина, НАДФН-диафоразы, арги-ниндегидрогеназы, кислой и щелочной фосфатаз и снижение активности сукцинатдегидрогеназы.
SUMMARY
N.N.Rubtsova
HISTOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF UMBICAL CORDS IN PREGNANT WOMEN WITH ACUTE RESPIRATORY DISCASES
28 umbical cords obtained from pregnant patients with ARD were studied with histochemical methods. The activity of the following enzymes was determined: succinatedehydrogenase, histamine, NADPH-diaphorase, argininedehydro-genase, acid and alkaline phosphatase. There was histamine, NADPH-diaphorase, arginine dehydrogenase, acid and alkaline activity increase and succinatedehydrogenase activity decrease.
Одной из наиболее важных проблем современной перинатологии является прогрессирующий рост инфекционной патологии плода и новорожденного [10]. Инфекционные заболевания выявляются у 50 - 60% госпитализированных доношенных новорожденных и у 70% недоношенных детей. В структуре смертности новорожденных инфекционная патология занимает одно из первых мест, обусловливая от 11 до 45% потерь [3,5,8]. Мертворождаемость при этой патологии достигает 14,9 - 16,8% [4]. Основными патогенетическими механизмами нарушения состояния плода кроме инфекционного фактора являются метаболические изменения, расстройства иммунной системы, дисфункция фетоплацентарного комплекса. Инфекционно - воспалительные заболевания беременных неблагоприятно воздействуют на все звенья фетоплацентарного комплекса [1]. Несмотря на то, что имеются работы, посвященные изучению пуповины, этот вопрос остается мало изученным.
Основной целью работы явилось изучение строе-
ния пуповины на гистохимическом уровне при беременности, осложненной ОРВИ.
Материалы и методы
Объектом для исследования явились 28 пупочных канатиков, взятых на разных сроках беременности от женщин, перенесших ОРВИ и практически здоровых беременных (6 случаев).
Для морфо-гистохимического анализа были применены следующие методы.
1. Выявление накопления гистамина по СИашру и СощаМ (1969) с помощью солей осмия и ртути.
2. Выявление активности НАДФН-диафоразы (дает информацию о состоянии внутриклеточного окисления и активности М0-синтазы) по З.МакоБ -Я.воББгаи [13].
3. Выявление активности аргининдегидрогеназы (донор N0 - групп).
4. Идентификация активности сукцинатдегидроге-назы (фермент дает ценную информацию об активности цикла Кребса) по A.M.Seligшan и А.М.ЯиепЬищ (1951) в модификации Е^ИеИоп и W.C.Schneider (1952).
В качестве акцептора использовали нитросиний тетразолий. В ходе реакции фермент отщеплял от субстрата протоны и электроны, которые акцептировались нитросиним тетразолием, при этом молекула последнего восстанавливалась до моно- и диформа-занов. Осадки диформазанов и свидетельствовали о локализации фермента. Реакции проводились на нефиксированных криостатных срезах.
5. Выявление активности щелочной фосфатазы методом азосочетания по О.вошоп в модификации Вег-Б1оп (1965). Метод выполнялся на криостатных срезах с постфиксацией в холодном кальций - формоле ( жидкости Бекера) с применением в качестве субстрата фосфатов нафтола А8 и А8-Е и солей диазония - прочных синих ВВ и КЯ. Для всех ферментативных реакций проводили соответствующие контроли.
6. Выявление активности кислой фосфатазы по
О.вошоп на криостатных срезах с постфиксацией в холодном кальций-формоле . Для этого применялся дифференцированный анализ данного фермента в зависимости от концентрации водородных ионов. При этом использовались инкубационные среды с различными значениями рН: 5,2; 5,7; 6,2 и 6,7.
Результаты исследования и их обсуждение
С помощью солей ртути и осмия выявлялось накопление в пуповине биогенноактивных веществ гистамина. В контрольной группе большое количест-
во гистамина в виде гранул чёрного цвета обнаруживалось в эндотелии сосудов, меньше - в мышечной оболочке сосудов, веретеновидных клетках вартоно-ва студня и эпителии амниона.
В пупочных канатиках, взятых от женщин, перенесших ОРВИ, наблюдалось увеличение накопления гистамина.
Было проведено изучение активности фермента НАДФН-диафоразы. НАДФН-диафораза является маркером N0 - синтазы и гистохимическое определение этого фермента широко используется для локализации мест синтеза «новой» сигнальной молекулы N0. Было показано, что в большинстве случаев N0 - синтаза локализуется с НАДФН-диафоразой, а несовпадение локализации связано с изменением условий реакции [9] .Поэтому реакция на НАДФН-диафоразу дает возможность судить об активности N0 - синтазы в организме [11].
Исследователями показано, что эндотелиальные клетки сосудов пуповины продуцируют факторы, существенно меняющие сократимость и реактивность миоцитов этих сосудов. Так, в 97% клеток эндотелия вены пуповины выявлен фермент, участвующий в синтезе оксида азота. При этом активность N0 - синтазы в пупочной вене значительно выше, чем в пупочных артериях [12].
В данном исследовании активность НАДФН-диафоразы выявлялась в виде гранул синего цвета в эндотелии сосудов, меньше - в прилегающих участках гладких мышц (рис. 1). В срезах обнаруживалась митохондриальная локализация НАДФН-диафоразы на ранних сроках и смешанная (митохондриальная и диффузная цитоплазматическая) на поздних сроках беременности. Полагают, что это объясняется тем, что в более поздние сроки эмбриогенеза увеличивается синтез внемитохондриального фермента, являющегося маркером N0 - синтазы.
При ОРВИ отмечалось увеличение активности НАДФН-диафоразы в эндотелии сосудов, появление смешанной реакции в мышечной оболочке сосудов (рис. 2).
Большинство исследователей относит N0 ко вторичным мессенджерам. N0 выполняет одну из ключевых функций, связанных с регуляцией Са - мобилизующей системы. Единственным субстратом N0 -синтаз служит Ь - аргинин [2].
При изучении пуповин, взятых от практически здоровых беременных, распределение аргининдегид-рогеназы было идентично локализации НАДФН-диафоразы. Гранулы диформазана выявлялись в эндотелии сосудов, в меньшем количестве - в прилегающих гладкомышечных клетках (рис. 3).
В пупочных канатиках, взятых от беременных с ОРВИ, отмечалось повышение активности аргинин-дегидрогеназы в эндотелии и внутреннем слое мышечной оболочки сосудов (рис. 4).
Синтез N0 из Ь - аргинина осуществляется тремя основными изоформами фермента N0 - синтазы (N08) - двумя конститутивными ( нейрональной и эндотелиальной) и одной индуцибельной. В норме основная роль в регуляции сердечно - сосудистой системы принадлежит эндотелиальной N08 (€N08).
Эндотелиальный N0 синтезируется из Ь-аргинина в присутствии ряда кофакторов (НАДФН, тетрагид-
робиоптерина, флавинадениндинуклеотида, флави-наденинмононуклеотида и кальмодулина), а также кислорода. еМ08 активируется при повышении внутриклеточной концентрации Са2+. Конечными продуктами этой реакции являются 1 молекула Ь-цитруллина и 1 радикал N0. N0 диффундирует в соседние гладкомышечные клетки и стимулирует там растворимую гуанилатциклазу, что приводит к повышению в клетке уровня цГМФ. цГМФ снижает концентрацию Са2+ в гладкомышечных клетках, в результате чего происходят расслабление гладкой мышцы и вазодилатация.
Вторая изоформа N08 ^N08), в отличие от конститутивных изоформ, не зависит от Са и кальмоду-лина. Считается, что она экспрессируется при патологических состояниях под действием эндо- и экзотоксинов, медиаторов воспаления и других факторов, особенно активаторов свободнорадикального окисления. Свободные радикалы активизируют ядерный фактор транскрипции №кВ, который в свою очередь индуцирует синтез iN0S. Последний продуцирует N0 в огромных количествах в течение достаточно длительного времени [7].
Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) принадлежит к сукцинатоксидазной системе ферментов, объединенных в митохондриях в цепь. Это флавопротеидный фермент, ее флавиновая группа связана с белком ковалентно. Каждая флавиновая группа содержит 4 атома железа. Фермент имеет 8Н - группы, от которых зависит его ферментативная активность.
Активность СДГ выявлена преимущественно в эндотелии и мышечной оболочке сосудов пуповины, в меньшей степени - в ячеях вартонова студня и эпителии амниона. Низкая активность фермента определялась в аморфном веществе, заполняющем ячеи. С увеличением срока беременности отмечалось увеличение интенсивности окраски, особенно сосудов пуповины, что свидетельствует о нарастании активности СДГ (рис. 5).
При микроскопическом исследовании пуповин от женщин, перенесших ОРВИ, наблюдалось снижение активности СДГ, что косвенно указывает на снижение активности цикла Кребса (рис. 6).
На данном материале было проведено изучение гидролитических ферментов - кислой и щелочной фосфатаз, принимающих активное участие в самых разнообразных процессах внутриклеточного обмена.
Щелочная фосфатаза - фермент, катализирующий в щелочной среде расщепление эфиров ортофосфор-ной кислоты на различные спирты и фенолы. Он также способен катализировать некоторые реакции трансфосфорилирования (перенос фосфата с одних соединений на другие).
Фермент обнаруживал активность в виде синих или фиолетовых гранул в эндотелии сосудов (в зависимости от вида соли диазония). При этом интенсивность реакции на ранних сроках беременности была очень низкой, увеличиваясь к концу беременности.
В пупочных канатиках от беременных, перенесших ОРВИ, наблюдалось увеличение активности щелочной фосфатазы.
Функциями кислой фосфатазы исследователями считается участие как в гидролизе белковых веществ, так и в их продукции, а основным местом локализации признаются лизосомы [6].
Рис. 1. Пуповина плаценты беременной, не имевшей осложнений на протяжении гестации. Интенсивная реакция на N0-синтазу в стенке сосудов - низкая. Увеличение. 10 х 40.
Рис. 3. Пуповина плаценты беременной, прошедшей гестацию без осложнений. Интенсивность реакции на аргининдегидрогеназу в стенке сосудов - умеренная. Увеличение. 10 х 40.
Рис. 2. Пуповина плаценты беременной, перенесшей ОРВИ. В стенке сосуда высокая интенсивность реакции на N0-синтазу. Увеличение. 10 х 40.
Рис. 4. Пуповина плаценты беременной, перенесшей во II триместре ОРВИ. В стенке сосудов наблюдается интенсивная реакции на аргинин-дегидрогеназу. Увеличение. 10 х 40.
Рис. 5. Пуповина плаценты беременной, не имевшей осложнений. Интенсивность реакции на сукци-натдегидрогеназу в сосудах пуповины - высокая. Реакция по Шелтон-Шнейдеру. Увеличение. 10 х 40.
Кислая фосфатаза выявлялась диффузно: больше
- в эндотелии, мышечной оболочке сосудов и эпителии амниона, меньше - в вартоновом студне. При использовании инкубационного раствора с рН 5,2 отмечалась слабая реакция в сосудах и эпителии амниона; в вартоновом студне реакции практически не было. С увеличением рН реакция усиливалась, достигая максимума при рН 6,7. При этом заметно увеличивалась окраска сосудов и появлялось окрашивание аморфного вещества вартонова студня.
При изучении пуповин, взятых от женщин с ОРВИ, в большинстве случаев обнаруживалось увеличение интенсивности реакции на кислую фосфатазу.
Таким образом, полученные результаты при вирусных инфекциях свидетельствуют об увеличении накопления гистамина в пуповине. Повышение активности НАДФН-диафоразы и аргининдегидрогеназы говорит об увеличении синтеза оксида азота - мощного регулятора обменных процессов. Повышение активности кислой и щелочной фосфатазы говорит об усилении гидролитических процессов в пупочном канатике. На этом фоне отмечено снижение активности окислительно - восстановительных процессов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Анастасьева В.Г. Морфофункциональные изменения фетоплацентарного комплекса при плацентарной недостаточности.-Новосибирск, 1997. - 506 с.
2. Ванин А.Ф. Оксид азота в биомедицинских исследованиях // Вестник РАМН. - 2000.- №4. - С. 3 - 5.
3. Внутриутробные бактериальные и вирусные инфекции плода и новорожденного / Б.Л.Гуртовой, А.С.Анкирская, Л.В.Ванько, Н.И.Бубнова // Акуш. и гинекол. - 1995. - №6. - С.20 -26.
4. Дурова А.А., Симакова М.Г., Смирнова В.С. Этиология и патогенез внутриутробной инфекции // Акуш. и гинекол.- 1995.-№6.-С.9-12.
5. Лаврова Д.Б., Самсыгина Г.А., Михайлов А.В.
Рис. 6. Пуповина плаценты беременной, перенесшей в III триместре ОРВИ. Интенсивность реакции на сукци-натдегидрогеназу в сосудах пуповины - низкая. Реакция по Шелтон-Шнейдеру. Увеличение. 10 х 40.
Этиология и показатели высокого риска внутриутробного инфицирования плода // Педиатрия.-1997. -№ 3. - С. 94-99.
6. Левченко Н.Р. Кислая фосфатаза и обменные процессы в легких кролика в норме и при экспериментальной гиперхолестеринемии // Гистохимия фосфомоноэстераз в норме и патологии. - Благовещенск, 1973. - С. 4 -10.
7. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю., Архипенко Ю. В. Оксид азота в сердечно - сосудистой системе: роль в адаптационной защите // Вестник РАМН. -2000. - №4. - С. 16 - 21.
8. Пустотина О.А., Бубнова Н.И. Диагностика внутриутробной инфекции ( компоненты последа и амниотической жидкости) // Акуш. и гинекол. - 1999.
- №4. - С. 3 - 5.
9. Сахарова А.В., Ложникова С.М. Ультраструктурная локализация NO - синтазной НАДФН-диафоразы в периферическом нерве и ее изменение при дифтерийной полинейропатии // Вестник РАМН.
- 2000. - №4. - С. 44 - 48.
10. Сидорова И. С., Макаров О.И., Матвиенко П. А. и др. Состояние фетоплацентарной системы при высоком риске внутриутробного инфицирования плода // Российский вестник перинатологии и педиатрии. -2000. - №2. - С. 5 - 8.
11. Фетоплацентарная система при ОРВИ / Луценко М.Т., Пирогов А.Б., Гориков И.Н. и др.-Благовещенск, 2000.-168 с.
12. Dikranian K., Trosheva M., Nicolov S. Nitrit oxide synthase (NOS) in the human umbilical vessels. An immunohistochemicae Study // Acta Histohem. - 1994. -Vol. 96, N 2. - P. 145-153.
13. Nakos.G., Gossrau. When NADPH diaphorase /
NADPHd / works in the presence of formaldehyde, the enzyme appears to visualize selectively cells with constitutive nitric oxide synthase / NOS / // Acta Histo-
chem. - 1994. - Vol.96, №3. - P.335 - 343.
