CC BY
40
УДК 577.125.085:547.913-314
гиполипидемическое действие сесквитерпенового y-лактона ахиллина на клеточной культуре крысиной гепатомы
Иванов В.В.1, Ратькин А.В.1, Пфаргер Ю.А.1, Кайдаш О.А.1, Рязанцева Н.В.1, Адекенов С.М.2, Чучалин В.С.1
1 Сибирский государственный медицинский университет, Томск
2 АО «Международный научно-производственный холдинг «Фитохимия», г. Караганда, Республика Казахстан
РЕЗЮМЕ
Цель исследования - оценить in vitro фармакологические эффекты сесквитерпенового у-лактона ахиллина в качестве потенциального гиполипидемического средства.
Материал и методы. Изучено влияние сесквитерпенового у-лактона ахиллина и гемфиброзила (препарат сравнения) на содержание липидов в клеточной культуре крысиной гепатомы (HTC) флуоресцентным методом с витальным красителем Nile Red и окрашиванием клеток красителем Oil Red O при их инкубации с жировой эмульсией - липофундином. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ-теста и окрашиванием с трипановым синим.
Результаты. Культивирование клеточной культуры HTC с ахиллином и гемфиброзилом в концентрациях от 0,5 до 1,5 и от 0,25 до 0,5 ммоль соответственно приводило к дозозависимому уменьшению интенсивности флуоресценции Nile Red, что связано со снижением содержания липидов в клетках. В этих концентрациях препараты не оказывали цитотоксического действия, и жизнеспособность клеток НТС не изменялась по сравнению с соответствующим показателем контрольной культуры.
Экспериментальную гиперлипидемию в культуре гепатомы индуцировали добавлением в инкубационную среду жировой эмульсии липофундина в конечной концентрации 0,05%. Интенсивность флуоресценции Nile Red в клетках возрастала в 4 раза (p < 0,05), что свидетельствует о существенном накоплении липидов в цитозоле клеток и подтверждается данными микроскопии после окрашивания нейтральных липидов в клетках красителем Oil Red О.В этих условиях ахиллин и гемфиброзил в концентрациях 0,5 и 0,25 ммоль соответственно снижали содержание липидов в клетках.
Заключение. На модели гиперлипидемии, индуцированной липофундином, добавление сесквитерпенового у-лактона ахиллина в инкубационную среду препятствует накоплению липидов в клетках НТС, о чем свидетельствует уменьшение флуоресценции Nile Red и снижение содержания окрашенных Oil Red О липидных капель в цитозоле. Для установления молекулярных мишеней действия ахиллина на метаболизм липидов в культуре НТС в дальнейшем необходимо исследование экспрессии генов ключевых ферментов липидного обмена.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: сесквитерпеновый у-лактон ахиллин, гемфиброзил, крысиная гепатома (HTC), гиполипидемическое действие.
Введение
Коронарные заболевания сердца, обусловленные атеросклеротическим поражением коронарных артерий, лидируют по смертности как в России, так и в большинстве стран мира [1, 2]. В основе их развития и
И Ратькин Александр Валентино&ич, тел.: 8-903-915-3991, 8 (3822) 42-09-50; e-mail: [email protected]
прогрессирования лежит не только локальное сужение просвета артерий атеросклеротическими бляшками, но и атерогенная дислипидемия [2-4]. Наиболее частым проявлением атерогенной дислипидемии является сочетание гипертриацилглицеридемии, низкого уровня холестерола в липопротеинах высокой плотности (ЛПВП) и повышенного содержания атерогенных ли-попротеинов низкой плотности (ЛПНП) [2].
Несмотря на большое разнообразие синтетических гиполипидемических препаратов на фармацевтическом рынке, проблема терапии атеросклероза и его проявлений еще полностью не решена [4]. Перспективным источником лекарственных средств этой группы являются вещества растительного происхождения, характеризующиеся достаточно высоким фармакотерапев-тическим потенциалом, низким уровнем побочных эффектов и хорошей переносимостью [5]. Среди веществ, продуцируемых растениями, активно изучаются сесквитерпеновые лактоны, для которых показаны противоопухолевая, антиинвазивная, противовоспалительная, антималярийная, противовирусная, противо-бактериальная, противогрибковая активности [6-8]. Сесквитерпеновые у-лактоны представляют собой класс химических соединений терпеноидной структуры [8, 9] и подобно гиполипидемическим препаратам группы статинов содержат лактонное кольцо в своей структуре [9]. В частности, гиполипидемическое действие показано для сесквитерпенового у-лактона гвай-анового ряда леукомизина, выделенного из тысячелистника мелкоцветкового Achillea micrantha Willd и полыни беловатой Artemisia leucodes Schrenk [1, 9, 10].
Цель исследования - оценка in vitro фармакологические эффекты сесквитерпенового у-лактона ахил-лина (1) в качестве потенциального гиполипидемиче-ского средства.
(1)
В настоящее время для скрининговых исследований широко используются культуры клеток, поскольку они самовоспроизводятся, требуют меньших материальных затрат и работа с ними не обременена этическими ограничениями [11]. В связи с этим в качестве биологической модели для изучения гиполипидемиче-ского действия сесквитерпенового у-лактона ахиллина использовали клеточную культуру НТС.
Материал и методы
Ахиллин (1) — сесквитерпеновый лактон гвайано-вого типа, выделенный в АО «Международный научно-производственный холдинг «Фитохимия» из Achillea micrantha Willd и Artemisia leucodes Schrenk [10]. Субстанция зарегистрирована на территории Республики Казахстан, исследуемый образец соответствует
требованиям ФС РК 42-1909-08, количественное содержание - 99,7%. В качестве препарата сравнения использовали гемфиброзил (Sigma-Aldrich, США). Ахиллин и гемфиброзил растворяли в диметилсуль-фоксиде (ДМСО) (ПанЭко, Россия) и использовали в конечных концентрациях от 0,25 до 5,0 ммоль.
В эксперименте использовали перевиваемую клеточную культуру крысиной гепатомы (HTC), полученную из Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург). Клеточную культуру HTC культивировали в 6-луночных планшетах (SPL life science, Корея) до 70-80% конфлюэнтного монослоя (0,5 • 106 клеток в 1 мл среды в течение двух суток) в среде DMEM с L-глутамином («Биолот», Россия) и добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («PAA Laboratories», Австрия), 50 мкг/мл гентамицина («ПанЭко», Россия) (полная среда DMEM) при 37еС в СО2-инкубаторе МСО-5АС («SANYO», Япония) в атмосфере 95% воздуха и 5% СО2. Через 48 ч в инкубационную среду добавляли ахиллин и гемфиброзил в различных концентрациях (в контрольную пробу добавляли соответствующее количество ДМСО) и клетки культивировали 48 ч.
После достижения клетками 70-80% конфлюэнт-ного монослоя (через 48 ч) для моделирования гипер-липидемии клетки инкубировали в присутствии жировой эмульсии — липофундина МСТ/ЛСТ в конечной концентрации 0,05% (Б. Браун Медикал, Россия) -как описали E. Ilan и соавт. [12]. Липофундин добавляли перед внесением препаратов, в контрольную пробу вносили соответствующее количество ДМСО.
Жизнеспособность клеточной линии HTC оценивали через 48 ч после внесения препаратов в культу-ральную среду двумя методами: с использованием МТТ-теста (стандартный колориметрический метод) с применением в качестве реагента соли тетразолия - 3-[4,5-диметилтиазолил-2-ел]-2,5-дифенилтетразолиум бромида (МТТ-реагент) (ПанЭко, Россия) и с 0,1% трипановым синим (ДИАЭМ, Германия). После инкубации с препаратами клетки снимали с планшета раствором трипсина (0,25%) и ЭДТА (0,02%) (ПанЭко, Россия) и отмывали один раз в ^PBS (pH 7,4) (Ambion, США). Количество восстановленного продукта — формазана - измеряли на спектрофотометре СФ-2000 (ОКБ-Спектр, Россия) при длине волны 570 нм. Жизнеспособность в контрольной культуре клеток принимали за 100%. Количество клеток, окрашенных трипа-новым синим, подсчитывали в камере Горяева под световым микроскопом МИКМЕД-1 (Россия) с увеличением (ок. 7 х об. 9). Определяли процент неокрашенных (живых) клеток среди 100% посчитанных. Каждый опыт повторяли 6—7 раз [1, 13, 14].
о
Содержание липидов в клеточной культуре HTC определяли флуоресцентным методом с витальным липофильным красителем Nile Red, который окрашивает капли липидов в цитозоле согласно протоколу [14]. Для этого клетки снимали с пластика раствором трипсин-ЭДТА через 48 ч после внесения препаратов в культуральную среду и отмывали один раз в lxPBS (pH 7,4). Надосадочную жидкость аккуратно аспири-ровали и клетки инкубировали 30 мин с Nile Red (Sigma-Aldrich, США) в конечной концентрации 3 мкмоль. Затем клетки отмывали в lxPBS (pH 7,4) и детектировали флуоресценцию Nile Red на микропланшетном ридере Infinite 200 PRO (Tecan, Швейцария) при длине волны возбуждения 580 нм и эмиссии 630 нм. Каждый опыт повторяли 6 раз [1, 12, 14].
Окрашивание нейтральных липидов с красителем Oil Red O [15] также проводили через 48 ч после внесения препаратов в культуральную среду. Клетки фиксировали в 10%-м забуференном растворе формалина (Biovitrum, Россия) на 10 мин. Затем клетки отмывали в 1xPBS (pH 7,4) в течение 1 мин и 60%-м растворе изопропилового спирта в течение 15 с. Клетки окрашивали Oil Red O (Sigma-Aldrich, США) при 37 °С в течение 1 мин в темноте. Не связавшийся с клетками краситель отмывали в 60%-м изопропиловом спирте в течение 15 с, 3 раза по 3 мин в 1xPBS (pH 7,4) и фотографировали на микроскопе (Биомед, Россия) (об. 25 х ок. 10), оснащенном цифровой камерой DCM 510 [15].
Результаты исследования обрабатывали с использованием программы Microsoft Exсel (2007), стандартного пакета программ SPSS 17.0 for Windows. Результаты представлены в виде выборочного среднего M и ошибки среднего т. Равенство выборочных средних проверяли с применением t-критерия Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при уровне значимости p < 0,05.
Результаты и обсуждение
Известно, что сесквитерпеновые лактоны в зависимости от их структуры обладают цитотоксическим действием и изучаются как противоопухолевые препараты [8]. Поэтому для исследования in vitro фармакологической активности предварительно проводили оценку жизнеспособности клеток при инкубации их в среде с различными концентрациями ахиллина и препарата сравнения. В результате наших экспериментов установлено, что жизнеспособность клеток НТС при культивировании с ахиллином в концентрации от 0,5 до 1,5 ммоль и гемфиброзилом в концентрации от 0,25 до 0,5 ммоль не изменялась по сравнению с контрольной культурой (p > 0,05), и составляла при использо-
вании метода окраски с трипановым синим не менее (97,1 ± 1,5)%, а МТТ-теста - не менее (81,8 ± 2,2)% (рис. 1, 2). При повышении концентрации ахиллина в культуральной среде до 5,0 ммоль жизнеспособность клеток снижалась по сравнению с контролем и составляла (17,3 ± 2,6)% (р < 0,05) (рис. 1). Препарат сравнения гемфиброзил в концентрации 1,0 ммоль цитотоксически действовал на клетки, при этом концентрация живых клеток составляла (16,0 ± 2,5)% (р < 0,05) (рис. 2).
120
0 _I_I_I_I_I_I_
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 5,0 Концентрация ахиллина, ммоль
—Процент жизнеспособных клеток -И- Флуоресценция Nile Red
Рис. 1. Влияние ахиллина на жизнеспособность клеток с применением МТТ-теста и на флуоресценцию Nile Red в клеточной культуре крысиной гепатомы (НТС), M ± m, n = 6. Жизнеспособность клеток и флуоресценцию Nile Red в контроле принимали за 100%. * — статистически значимые различия по сравнению с контролем при p < 0,05
120 -100 -
« 80 -
0 Оч
1 60 -Д 40 -
20 -0 -
0,25 0,50 1,10
Коцентрация гемфиброзила, ммоль
—Процент жизнеспособных клеток -И- Флуоресценция Nile Red
Рис. 2. Влияние гемфиброзила на жизнеспособность клеток с применением МТТ-теста и на флуоресценцию Nile Red в клеточной культуре крысиной гепатомы (НТС), M ± m, n = 6. Жизнеспособность клеток и флуоресценцию Nile Red в контроле принимали за 100%. * — статистически значимые различия по сравнению с контролем при p < 0,05
Добавление ахиллина к культуре НТС приводило к дозозависимому снижению интенсивности флуоресценции Nile Red с (75,3 ± 1,3) до (35,6 ± 2,8)% при концентрации от 0,5 до 5,0 ммоль (рис. 1), гемфибро-зила — с (99,2 ± 1,9) до (57,9 ± 4,9)% при концентрации от 0,25 до 1,0 ммоль (p < 0,05) (рис. 2). Статистически значимое уменьшение интенсивности флуоресценции Nile Red в клетках НТС регистрировалось при концентрации ахиллина 1,0 ммоль и гемфиброзила — 0,5 ммоль, что отражает снижение содержания липи-дов в клеточной культуре.
Полученные результаты подтверждаются данными микроскопии клеток после окрашивания нейтральных липидов в клетках HTC красителем Oil Red O. Под действием 1,0 ммоль ахиллина и 0,5 ммоль гемфибро-зила в клетках снижалось содержание липидных капель, окрашенных Oil Red O, по сравнению с контролем (рис. 3, а, в, г).
С учетом полученных результатов для исследования гиполипидемического действия на модели гипер-липидемии in vitro ахиллин и гемфиброзил использованы в концентрациях от 0,5 до 1,5 ммоль и от 0,25 до 0,5 ммоль соответственно. При этих концентрациях жизнеспособность клеток значимо не изменялась по сравнению с контролем, и отмечалось снижение уровня липидов в клетках.
а
Исследованиями E. Ilan и соавт. показано, что культивирование первичных крысиных гепатоцитов с липо-фундином в течение 48 ч приводит к накоплению триа-цилглицеролов (ТАГ) и жирных кислот в клетках [12]. Поэтому для моделирования экспериментальной гипер-липидемии мы добавляли в культуральную среду жировую эмульсию — липофундин в конечной концентрации 0,05%. При инкубации клеточной культуры НТС в присутствии липофундина в течение 48 ч интенсивность флуоресценции Nile Red в клетках повышалась в 4 раза и составила (48 534,7 ± 1 924) ед. флуоресценции (в контроле — (10 928,4 ± 967,3) ед. флуоресценции) (p < 0,05). Накопление липидов в культуре НТС также подтвердилось данными микроскопии клеток после окрашивания нейтральных липидов красителем Oil Red O (рис. 3). На рис. 3, б (инкубация клеток с липофундином 0,05%) отмечалось больше гранул липидов, окрашенных Oil Red O, чем в контрольной культуре (рис. 3, а).
На экспериментальной модели гиперлипидемии ахиллин проявлял гиполипидемическое действие и уже в концентрации 0,5 ммоль значительно снижал интенсивность флуоресценции Nile Red ((72,5 ± 1,2)%) по сравнению с контролем (p < 0,05) (рис. 4). Гемфиброзил уменьшал содержание липидов в клетках НТС на экспериментальной модели гиперлипидемии до (36,5 ± 3,7)% при концентрации 0,25 ммоль (p < 0,05) (рис. 5).
Рис. 4. Влияние ахиллина на флуоресценцию Nile Red в клеточной культуре крысиной гепатомы (НТС) при культивировании клеток с липофундином в концентрации 0,05%, M ± m, n = 6. Флуоресценцию Nile Red в контроле принимали за 100%. * — статистически значимые различия по сравнению с флуоресценцией контроля при p < 0,05
Рис. 5. Влияние гемфиброзила на флуоресценцию Nile Red в клеточной культуре крысиной гепатомы (НТС) при культивировании с 0,05% липофундином, M ± m, n = 6. Флуоресценцию Nile Red в контроле принимали за 100%. * — статистически значимые различия по сравнению с флуоресценцией контроля при p < 0,05
Способность липофундина индуцировать гиперли-пидемию показана не только на культуре первичных гепатоцитов in vitro [13], но и на экспериментах in vivo [16]. Липофундин при введении экспериментальным животным вызывал повышение в крови уровня ТАГ, общего холестерола и холестерола в ЛПНП. Это обусловлено тем, что высокий уровень экзогенных ТАГ индуцирует синтез АпоВ-100 и холестерола в печени, что, в свою очередь, способствует образованию и секреции липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) [16].
Механизм, с помощью которого ахиллин снижает накопление липидов в клетках крысиной гепатомы, не изучен. В то же время известно, что основными механизмами гиполипидемического действия фибратов, в том числе гемфиброзила, являются снижение синтеза
ТАГ и увеличение их гидролиза [17, 18]. Гемфиброзил, будучи агонистом рецептора, активируемого перокси-сомным пролифератором (PPAR), действует на ядерные рецепторы, увеличивая экспрессию генов, которые регулируют синтез ключевых ферментов липидно-го обмена и белков метаболизма липопротеинов [17]. Снижение синтеза ТАГ происходит за счет ингиби-рующего влияния гемфиброзила на активность микро-сомальной диацилглицеролацилтрансферазы. К тому же гемфиброзил активирует деградацию аполипопро-теина В (АпоВ), что приводит к снижению секреции ЛПОНП [19]. Флавоноид нарингенин, полученный из цитрусовых, снижает секрецию ЛПОНП также за счет увеличения внутриклеточной деградации АпоВ [20]. Полученные нами данные об уменьшении флуоресценции Nile Red и снижении содержания окрашенных Oil Red O липидных капель в цитозоле клеток под влиянием ахиллина могут быть обусловлены ингибирова-нием липогенеза или гидролизом ТАГ. Для установления молекулярных мишеней действия ахиллина на метаболизм липидов в культуре НТС необходимо в дальнейшем исследование экспрессии генов ключевых ферментов липидного обмена.
Заключение
На модели гиперлипидемии, индуцированной ли-пофундином, добавление сесквитерпенового у-лактона ахиллина в инкубационную среду препятствует накоплению липидов в клетках НТС, о чем свидетельствует уменьшение флуоресценции Nile Red и снижение содержания окрашенных Oil Red O липидных капель в цитозоле.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Совета по грантам Президента Российской Федерации, № НШ-4184.2014.7
Литература
1. Ратькин А.В., Арыстан А.И., Яковлева Ю.А., Иванов В.В., Рязанцева Н.В., Чучалин B.C., Адекенов С.М. Влияние сесквитерпенового у-лактона леукомизина на уровень триацилглицеролов в клетках крысиной гепатомы при экспериментальной модели гиперлипидемии // Сиб. мед. обозрение. 2014. Т. 1. С. 44-48.
2. Буеверова Е.А., Драпкина О.М., Ивашкин В.Т. Атероген-ная дислипидемия и печень // Рос. мед. вести. 2008. Т. 13, № 1.С. 17-23.
3. Амосова Е.Н. Гиполипидемическая терапия при ишеми-ческой болезни сердца // Укр. кардиол. журн. 2002. Т. 6. С. 13-18.
4. Ramsey S., Gold E.S., Aderem A. A systems biology approach to understanding atherosclerosis // EMBO Mol. Med. 2010. V. 2. P. 79-89.
5. Kumar D., Parcha V., Maithani A., Dhulia I. Effect and evaluation of antihyperlipidemic activity guided isolated fraction from total methanol extract of Salvadoraoleoides
(Decne.) in Triton WR-1339 Induced hyperlipidemic rats // Pharmacogn. Mag. 2012. V. 8, № 32. P. 314-318.
6. Wyrebska A., Gach K, Szemraj J., Szewczyk K, Hrabec E, Koszuk J., Janecki T, Janecka A. Comparison of anti-invasive activity of parthenolide and 3-isopropyl-2-methyl-4-methyleneisoxazolidin-5-one (MZ-6) - a new compound with a-methylene-y-lactone motif - on two breast cancer cell lines // Chem. Biol. Drug Des. 2013. V. 79. P. 112-120.
7. Wyrebska A, Szymanski J, Gach K, Piekielna J, Koszuk J, Janecki T, Janecka A. Apoptosis-mediated cytotoxic effects of parthenolide and the new synthetic analog MZ-6 on two breast cancer cell lines // Mol. Biol. Rep. 2013. V. 40. P. 1655-1663.
8. Chaturvedi D. Sesquiterpene lactones: structural diversity and their biological activities // Research signpost. 2011. P. 313-334.
9. Роднова E.A., Иванов B.B, Ледюкова С.И, Чучалин B.C., Ратькин A.B, Рахимова Б.Б., Хабаров И.А, Адекенов С.М. Гиполипидемическое действие леукомизина на модели острой гиперлипидемии, индуцированной этанолом // Бюл. сиб. медицины. 2013. Т. 12, № 1. С. 43-48.
10. Адекенов С.М, Гафуров Н.М., Турмухамбетов А.Ж., Ивлев В.И. Терпеноиды Achillea micrantha // Химия природ. соединений. 1987. № 2. 305 с.
11. Морозов С.Ю. Применение симвастатина для лечения и профилактики ишемической болезни сердца // Рус. мед. журн., кардиология. 2009. № 8. С. 606-609.
12. Han E, Tirosh О, Madar Z. Triacylglycerol-mediated oxi-dative stress inhibits nitric oxide production in rat isolated hepatocytes // J. Nutr. 2005. V. 135, № 9. P. 2090-2095.
13. Giri Sh, Nieber K. et al. Telomerase activity and hepatic functions of rat embryonic liver progenitor cell in nanoscaf-
fold-coated model bioreactor // Mol. Cell. Biochem. 2010. V. 336. P. 137-149.
14. Shen Ch, Meng Q, Schmelzer E, Bader A. Gel entrapment culture of rat hepatocytes for investigation of tetracycline-induced toxicity // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2009. V. 238. P. 178-187.
15. Xu S, Huang Y, Xie Y. et al. Evaluation of foam cell formation in cultured macrophages: an improved method with Oil Red O staining and Dil-oxLDL uptake // Cytotechnol-ogy. 2010. V. 62. P. 473-481.
16. Roche L.D, Medina E.A., Perez A.F. et al. Lipofundin-induced hyperlipidemia promotes oxidative stress and atherosclerotic lesions in New Zealand white rabbits // Int. J. Vasc. Med. 2012. V. 2012. P. 1-7.
17. Ozansoy G., Akin F.B. Effects of gemfibrozil treatment on vascular reactivity of streptozotocin-diabetic rat aorta // J. Pharm. Pharmacol. 2004. V. 56. P. 241-246.
18. Umeda Y, Kako Yu, Mizutani K. et al. Inhibitory action of gemfibrozil on cholesterol absorption in rat intestine // The journal of lipid research. 2001. V. 42. P. 1214-1219.
19. Zhu D, Ganji S.H., Kamanna V.S., Kashyap M.L. Effect of gemfibrozil of apolipoprotein B secretion and diacyl-glycerolacyltransferase activity in human hepatoblastoma (HepG2) cells // Atherosclerosis. 2002. V. 164, № 2. P. 221-228.
20. Borradaile N.M., Dreu L.E. et al. Inhibition of hepato-cyte apoB secretion by naringenin: enhanced rapid intra-cellular degradation independent of reduced microsomal cholesteryl esters // J. Lipid Res. 2002. V. 43, № 9. P. 1544-1554.
Поступила в редакцию 19.05.2014 г.
Утверждена к печати 09.10.2014 г.
Иванов Владимир Владимирович — канд. биол. наук, доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии СибГМУ, (г. Томск). Ратькин Александр Валентинович (И) — канд. фарм. наук, доцент кафедры фармацевтической технологии СибГМУ (г. Томск). Пфаргер Юлия Андреевна — аспирант кафедры патофизиологии СибГМУ (г. Томск). Кайдаш Ольга Александровна — аспирант кафедры фармакологии СибГМУ (г. Томск).
Рязанцева Наталья Владимировна — д-р мед. наук, профессор, проректор по стратегическому развитию, инновационной политике и науке, зав. кафедрой молекулярной медицины и клинической лабораторной диагностики СибГМУ (г. Томск).
Адекенов Сергазы Мынжасарович — д-р хим. наук, академик HAH PK, председатель правления АО «Международный научно-производственный холдинг «Фитохимия» (г. Караганда, Республика Казахстан).
Чучалин Владимир Сергеевич — д-р фарм. наук, профессор, декан фармацевтического факультета, зав. кафедрой фармацевтической технологии СибГМУ (г. Томск).
И Ратькин Александр Валентинович, тел.: 8-903-915-3991, 8 (3822) 42-09-50; e-mail: [email protected]
investigation of hypolipidemic effect of sesquiterpene t-lactone ahillin in hepatoma tissue culture (htc) cells
Ivanov V.V.1, Ratkin A.V.1, Pfarger Yu.A.\ Kaidash O.A.1, Ryazantseva N.V.1, Adekenov S.M.2, Chuchalin V.S.1
1 Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation
2 International scientific- industrial holding "Phytochemistry", Karaganda, Kazakhstan
ABSTRACT
Objective. Investigation of hypolipidemic effect of sesquiterpene y-lactone ahillin in hepatoma tissue culture (HTC) cells.
Material and methods. In this study we've evaluated the effect of y-lactone sesquiterpene achillin and gemfibrozil (comparator drug) on the lipid content in the hepatoma tissue culture (HTC) cell which were incubated with a fat emulsion lipofundin by fluorescent method with vital dye Nile Redand staining the cells with the dye Oil Red O. The cell viability was investigated using the MTT-test and staining with Trypan blue.
Results. Cultivation cells HTC with achillin and gemfibrozilat concentrations ranging from 0.5 to 1.5 mM and from 0.25 mM to 0.5 mM, respectively, resulted in dose-dependent decrease of the fluorescence's intensity Nile Red. It reflects a decrease in lipid content in the cells. At these concentrations the drugs didn't have cytotoxic effect and the cell viability didn't change compared to the control culture.
An experimental hyperlipidemia in the hepatoma culture cells was induced by adding to the incubation medium a fat emulsion lipofundin at a final concentration 0.05%. The intensity of fluorescence Nile Red in the cells was increased 4 fold (p < 0.05). This result suggests the significant accumulation of lipids in the cell's cytosol and confirmed by microscopy after staining neutral lipids with the dye Oil Red O. Under these conditions achillin and gemfibrozil reduced lipid content in cells and hadthe effect at concentrations of 0.5 mM and 0.25 mM respectively.
Conclusion. In the lipofundin-mediated model of hyperlipidemia the sesquiterpene lactone achillin prevents the lipid accumulation in cells. It confirms by decrease of fluorescence Nile Red and reduction lipid drops which were stained with Oil Red O in cytosol. To establish the molecular targets of achillin'saction on lipid metabolism in cell culture HTC we need to investigate a gene expression of key enzymes of lipid metabolism.
KEY WORDS: sesquiterpene y-lactone achillin, gemfibrozil, hepatoma tissue culture (HTC) cells, hypolipidemic effect.
Bulletin of Siberian Medicine, 2014, vol. 13, no. 5, pp. 28-35
References
1. Ratkin A.V., Arystan LI, Yakovleva Y.A., Ivanov V.V., Ryazantseva N., Chuchalin V.S., Adekenov S.M. Influence of sesquiterpene g-lactone leucomelaena on the level of tria-cylglycerols in the cells of rat hepatoma in experimental models hyperlipidemia. Sibirskoye meditsinskoye obozrenie — Siberian Medical Review, 2014, no 1, pp. 44-48.
2. Buyeverov E.L., Drapkina O.M., Ivashkin V.T. Atherogenic dyslipidemia and liver. Rossiiskiye meditsinskiye vesti — Russian Medical News, 2008, vol. 13, no. 1, pp. 17-23.
3. Amosova E.N. Lipid-lowering therapy in coronary heart disease. Ukrainskiy kardiologicheskiy zhurnal — The Ukrainian Cardiological Journal, 2002, no. 6, pp. 13-18.
4. Ramsey S., Gold E.S., Aderem A. A systems biology approach to understanding atherosclerosis. EMBO Mol. Med., 2010, vol. 2, pp. 79-89.
5. Kumar D., Parcha V., Maithani A., Dhulia I. Effect and evaluation of antihyperlipidemic activity guided isolated fraction from total methanol extract of Salvadoraoleoides (Decne.) in Triton WR-1339 Induced hyperlipidemic rats. Pharmacogn. Mag., 2012, vol. 8, no. 32, pp. 314-318.
6. Wyrebska A., Gach K., Szemraj J., Szewczyk K., Hrabec E., Koszuk J., Janecki T., Janecka A. Comparison of anti-invasive activity of parthenolide and 3-isopropyl-2-methyl-4-methyleneisoxazolidin-5-one (MZ-6) - a new compound with a-methylene-y-lactone motif - on two breast cancer cell lines. Chem. Biol. Drug Des., 2013, vol. 79, pp. 112120.
7. Wyrebska A., Szymanski J., Gach K., Piekielna J., Koszuk J., Janecki T., Janecka A. Apoptosis-mediated cytotoxic effects of parthenolide and the new synthetic analog MZ-6 on two breast cancer cell lines. Mol. Biol. Rep., 2013, vol. 40, pp. 1655-1663.
8. Chaturvedi D. Sesquiterpene lactones: structural diversity and their biological activities. Research Signpost., 2011, pp. 313-334.
9. Rodnova E.A., Ivanov V.V., Lizukova S.R., Chuchalin V.S., Ratkin A.V., Rakhimov B.B., Khabarov I.A., Adekenov S.M. Hypolipidemic effect leucomelaena on the model of acute hyperlipidemia induced by ethanol. Bulleten sibirskoy meditsini — Bulletin of Siberian Medicine, 2013, vol. 12, no. 1, pp. 43-48.
10. Adekenov S.M., Gafurov N.M., Turmagambetov A.Z., Ivlev V.I. Terpenoids Achillea micrantha. Khimiya prirodnykh soyedineniy — Chemistry of Natural Compounds, 1987, no. 2, pp. 305.
11. Morozov H.E. Use of simvastatin for the treatment and prevention of coronary heart disease. Russkiy meditsikiy zhur-nal, kardiologiya — Russian Journal of Medicine, Cardiology, 2009, no 8. pp. 606-609.
12. Ilan E., TiroshO., Madar Z. Triacylglycerol-mediated oxidative stress inhibits nitric oxide production in rat isolated hepatocytes. J. Nutr, 2005, vol. 135, no. 9, pp. 2090-2095.
13. Giri Sh., Nieber K. et al. Telomerase activity and hepatic functions of rat embryonic liver progenitor cell in nanoscaf-fold-coated model bioreactor. Mol. Cell. Biochem., 2010, vol. 336, pp. 137-149.
14. Shen Ch., Meng Q., Schmelzer E., Bader A. Gel entrapment
culture of rat hepatocytes for investigation of tetracycline-induced toxicity. Toxicol. Appl. Pharmacol., 2009, vol. 238, pp. 178-187.
15. Xu S., Huang Y., Xie Y. et al. Evaluation of foam cell formation in cultured macrophages: an improved method with Oil Red O staining and Dil-oxLDL uptake. Cytotechnology, 2010, vol. 62, pp. 473-481.
16. Roche L.D., Medina E.A., Perez A.F. et al. Lipofundin-induced hyperlipidemia promotes oxidative stress and atherosclerotic lesions in New Zealand white rabbits. Int. J. Vase. Med., 2012, vol. 2012, pp. 1-7.
17. Ozansoy G., Akin F.B. Effects of gemfibrozil treatment on vascular reactivity of streptozotocin-diabetic rat aorta. J. Pharm. Pharmacol., 2004, vol. 56, pp. 241-246.
18. Umeda Y., Kako Yu., Mizutani K. et al. Inhibitory action of gemfibrozil on cholesterol absorption in rat intestine. The journal of lipid research, 2001, vol. 42, pp. 1214-1219.
19. Zhu D., Ganji S.H., Kamanna V.S., Kashyap M.L. Effect of gemfibrozil of apolipoprotein B secretion and diacylglycer-olacyltransferase activity in human hepatoblastoma (HepG2) cells. Atherosclerosis, 2002, vol. 164, no. 2, pp. 221-228.
20. Borradaile N.M., Dreu L.E. et al. Inhibition of hepatocyte apoB secretion by naringenin: enhanced rapid intracellular degradation independent of reduced microsomal cholesteryl esters. J. Lipid Res., 2002, vol. 43, no. 9, pp. 1544-1554.
Ivanov Vladimir V., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation. Ratkin Aleksander V. (H), Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation. Pfarger Yulia A., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation. Kaidash Olga A., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation. Ryazantseva Natalia V., State Medical University, Tomsk, Russian Federation.
Adekenov Sergazy M., International scientific- industrial holding "Phytochemistry", Karaganda, Kazakhstan. Chuchalin Vladimir S., Siberian State Medical University, Tomsk, Russian Federation.
H Ratkin Aleksander V., Ph.: +7-903-915-3991, +7 (3822) 42-09-50; e-mail: [email protected]
