CC BY
12ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2008, том 50, № 4, с. 589-598
СИНТЕЗ, ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ
УДК 541.64:547.466
ГИПЕРРАЗВЕТВЛЕННЫЙ ПОЛИЛИЗИН, МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ПО КОНЦЕВЫМ АМИНОГРУППАМ ЛИЗИНА ОСТАТКАМИ ГИСТИДИНА: СИНТЕЗ И СТРУКТУРА1
© 2008 г. Г. П. Власов*, А. П. Филиппов*, И. И. Тарасенко*, Е. Б. Тарабукина*, Г. А. Панкова*, И. Е. Ильина*, А. А. Шпырков*, Е. В. Скворцова**, А. И. Скворцов**, В. И. Воробьев**
*Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук 199004 Санкт-Петербург, Большой пр., 31 **Институт цитологии Российской академии наук 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4 Поступила в редакцию 26.02.2007 г. Принята в печать 27.11.2007 г.
С целью регулирования молекулярной массы и размера гиперразветвленного полилизина, а также возможности модификации аминогрупп его N-концевых лизиновых остатков разработан метод синтеза полимера полимеризацией N-карбоксиангидрида №-карбобензоксилизина в условиях восстановительного удаления №-карбобензоксигруппы действием водорода над активированным палладием в присутствии обрывателя полимеризации - активированного эфира №-трет-бутилоксикар-бонилгистидина. Структура полученных полимеров изучена методами капиллярного электрофореза, кругового дихроизма и молекулярной гидродинамики.
Создание полимерных носителей биологически активных веществ - одно из приоритетных направлений развития химии высокомолекулярных соединений. Последние десять лет отмечены, в частности, значительным интересом к созданию полимерных носителей, способных обеспечить целевую доставку ДНК в ядро клетки [1] для решения задач генной терапии. В ходе исследований был определен круг наиболее перспективных носителей ДНК, отличительной особенностью которых является то, что все они являются поликатионами и их структура близка сферической. Среди таких носителей оказались лизиновые и полиамидоаминные дендримеры [2-9], разветвленный полиэтиленимин [10, 11] и катионные ли-посомы [12, 13]. Линейный полилизин также мо-
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (коды проектов 04-03-33032, 05-03-33152) и Гранта государственной поддержки ведущих научных школ (НШ-1823.2003.3), Программы фундаментальных исследований Отделения химии наук о материалах РАН "Создание и изучение макромолекул и макромолекулярных структур новых поколений".
E-mail: gpvlasov@hq.macro.ru (Власов Геннадий Петрович).
жет быть использован для связывания и компак-тизации ДНК при ее доставке в ядро клетки [14], но уровень трансфекционной активности ДНК в комплексе с линейным полилизином низкий. Было найдено, что усиление трансфекционной ДНК-активности комплекса линейного полилизина с ДНК может быть достигнуто при модификации его боковых №-аминогрупп остатками ги-стидина [15]. В настоящее время принято, что носители ДНК должны быть биосовместимыми, биодеградирующими и неиммуногенными [16]. Среди перечисленных выше носителей ДНК этим требованиям полностью отвечают только лизиновые дендримеры, в то время как биосовместимость и биодеградирумость полиамидоамин-ных дендримеров, тем более разветвленного по-лиэтиленимина и катионных липосом, не только весьма сомнительна, но и в принципе невозможна, что проявляется, в частности, в токсичности указанных носителей [17, 18]. Однако возможность практического использования лизиновых дендримеров ограничивается проблемами их син-
Таблица 1. Условия синтеза гиперразветвлеииых полилизииов, модифицированных гистидином, и их строение по данным аминокислотного анализа
Полимер Соотношение К-карбоксиангидрид-лизина : активированный эфир гистидина Мольное соотношение Мольное соотношение К-концевых аминокислот
массовое мольное лизин : гистидин* (лизин : гистидин)**
1 1 : 1 1.8 5.6 1 : 34
2 10 : 1 17.5 75.3 1 : 14
* По данным аминокислотного анализа и ** капиллярного электрофореза.
теза [19] - обычно дендримеры получают с использованием достаточно трудоемких и длительных методик пептидного синтеза, классического синтеза [4], при синтезе в растворе, твердофазного синтеза [6, 8], при синтезе на полимерном носителе.
Недавно нами был предложен практически одностадийный метод получения гиперразветв-ленных полиаминокислот на основе лизина полимеризацией К-карбоксиангидрида №-карбобен-зоксилизина в условиях восстановительного удаления защитной №-карбобензоксигруппы при действии водорода в присутствии активированного палладия [20]. Изучение полученных соединений показало, что их структура близка к структуре ли-зиновых дендримеров [19]. Сравнение трансфек-ционной активности ряда сферических носителей [9] (звездообразные конъюгаты белков, лизи-новые дендримеры и их полимерные звездообразные конъюгаты, гиперразветвленный полилизин и гиперразветвленный полилизин, модифицированный по концевым аминогруппам гистидином) показало, что среди исследованных носителей трансфекционная активность комплекса ДНК с модифицированным гистидином гиперразветвленным полимером является максимальной и приближается к активности такого хорошо изученного носителя ДНК, как полиэтиленимин, выгодно отличаясь от него биосовместимостью, неиммуногенно-стью и нетоксичностью. В настоящей работе
изложены сведения о синтезе гиперразветвлен-ного полилизина, модифицированного по концевым аминогруппам остатками гистидина, и об его структуре.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Синтез гиперразветвленного полилизина, модифицированного по И-концевым аминогруппам гистидином
Для получения указанного соединения на стадии синтеза мы использовали специально полученный регулятор полимеризации К-карбоксиан-гидрида №-карбобензоксилизина, а именно, пен-тафторфениловый эфир Ка-трет-
бутилоксикарбонил(К1т-бензилоксиметил)гисти-дина (ВОС-Ы18(1Ч1т-Вот)-ОРРР), ^-защитная группа которого устойчива в условиях каталитического гидрирования. Синтез гиперразветвленного полилизина с одновременным регулированием его ММ и модификацией концевых аминогрупп проводили по аналогии с работой [20] в условиях каталитического восстановительного удаления №-карбобензоксизащитной группы с К-карбоксиангидрида №-карбобензоксилизина при действии газообразного водорода в присутствии активированного палладия и обрыванием процесса полимеризации К-карбоксиангидрида:
О
II
Ш-С-О-СН;
(СН2)4
Н1Ч-СН-С=О I I О=С-О
о
Ш2 (СН2)4
_гпн2/ре н» н^-С^^О
-С7н8 | |
О=С-О
КА
О II
Н1Ч-С-О-СН2
(СН2)4 Ш(СОСНШ)и— Н
ч /
(Сн2)4 НК-СН-С=О
I I
ОС-О
(СН2)4
Н1Ч-СН-С=О I I
О=С-
О
О II
Н1Ч-С-О-СН2
(СН2)4 Ш(СОСНШ)и— Н
(СН2)4 Н2^— СН— СО-№1
(СН2)4
Н1Ч-СН-С=О I I О=С-О
(КА - К-карбоксиангидрид).
Как следует из схемы, аминогруппа К-карбок-сиангидрида ¿-лизина, освободившаяся в ходе каталитического удаления №-карбобензоксизащит-ной группы, сразу же выступает в роли инициатора полимеризации К-карбоксиангидрида, что вызывает рост олигомерной (полимерной) цепочки. В процессе дальнейшего каталитического гидрирования продолжается удаление карбобен-зоксизащитных групп как с №-аминогрупп К-карбоксиангидрида лизина (это ведет к появлению новых инициирующих центров полимеризации К-карбоксиангидрида), так и с №-аминогрупп образовавшихся олигомерных (полимерных) цепочек (при полимеризации на них новых порций К-карбоксиангидрида происходит ветвление полимера). Возможна также реакция дополнительного "ветвления" растущего полимера за счет полимеризации К-карбоксиангидридного цикла, находящегося на карбоксильном конце растущей олиго-£-лизиновой (полилизиновой) цепи. Присутствующий в реакционной среде активированный пентафторфениловый эфир Ка-трет-бутилоксикарбонил-(К1т-бензилоксиметил)гистиди-на по достижении определенной длины полимер-
ных цепочек и с учетом изменившегося начального соотношения К-карбоксиангидрида лизина и активированного эфира гистидина начинает конкурировать с К-карбоксиангидридом №-карбо-бензоксилизина и модифицирует аминогруппы К-концевых остатков лизина растущих полимерных цепей, прекращая рост полимерных цепей.
Чтобы определить возможность регулирования молекулярных масс и размеров гиперраз-ветвленных полилизинов, мы проводили синтез гиперразветвленных полилизинов при массовом соотношении К-карбоксиангидрид №-карбо-бензоксилизина и пентафторфениловый эфир Ка-трет-бутилоксикарбонил-(К1т-Вот)гистиди-на, равном 1 : 1 и 10:1 соответственно (табл. 1, полимеры 1 и 2). Это отвечает мольному соотношению К-карбоксиангидрид лизин : активированный эфир гистидина 1.8 : 1 для первого полимера и 17 : 1 для второго. По данным аминокислотного анализа образовавшихся полимеров, реальное соотношение лизина и гистидина составило 5.6 : 1 и 75.3 : 1 соответственно (табл. 1).
Количественное определение К-концевых аминокислотных остатков в полученных гипер-
AU 0.015
0.010
0.005
(а)
0.004
0.002
(б)
0.010
0.005
(в)
3 6 9
Время, мин
Рис. 1. Электрофореграммы: а - стандартная смесь Na- и ^-моно-БМР-лизина (1), Na-, №-ди-DNP-лизина (2), Na-, NIm-ди-DNP-гистидина (3);
• - гидролизат DNP-производного полимера 1 (табл. 1): 1 - Na-, Ne-ди-DNP-лизин (4.75 х х 10-9 моль/мл), 2 - Na-, NIm-ди-DNP-гистидин (1.62 х 10-7 моль/мл), мольное соотношение концевых аминокислот лизин : гистидин равно 1 : 34; в - гидролизат DNP-производного полимера 2 (табл. 1): 1 - Na-, №-ди^№-лизин (5.35 х х 10-9 моль/мл), 2 - Na-, ^т-ди^№-гистидин (7.66 х 10-8 моль/мл): мольное соотношение концевых аминокислот лизин : гистидин составило 1 : 14. Экспериментальные условия: кварцевый капилляр с общей длиной 45 см (длина до детектора 38 см) и внутренним диаметром 75 мкм, 5 мМ фосфатный буфер (рН 7.1), напряженность поля 330 В/см, детектирование при 360 нм. AU - absorbance units.
разветвленных полилизинах, выполненное с использованием метода капиллярного электрофореза [21, 22], позволило оценить долю гистидина, связанного с концевыми аминогруппами лизина гиперразветвленного полилизина, и проследить, как изменение их соотношения влияет на строение полимеров (рис. 1). Оказалось, что при переходе от соотношения реагентов К-карбоксиан-гидрид лизина : активированный эфир гистидина, равного 10 : 1, к соотношению 1 : 1 (табл. 1, полимеры 2 и 1) мольное соотношение К-концевых ги-стидиновых остатков, введенных в гиперразветв-ленный полилизин, по отношению к оставшимся К-концевым остаткам лизина возрастает с 14 : 1 до 34 : 1, т.е. действительно происходит увеличение содержания доли гистидина, связанного с аминогруппами лизина внешней сферы гиперразветвленного полилизина. Вопрос о влиянии изменения соотношения мономер : инициатор на строение образующихся разветвленных полимеров рассмотрен ниже при анализе их вторичной структуры.
Вторичная структура гиперразветвленного
полилизина, модифицированного гистидином
Вторичную структуру полученных полимеров, а именно, способность олиголизиновых или поли-лизиновых цепей, находящихся вне точек "ветвления" (диацилированных остатков лизина), давать упорядоченную вторичную а-спиральную структуру определяли с помощью метода кругового дихроизма [20]. Согласно данным табл. 2, в воде (рН 6.4) и в разбавленной соляной кислоте (рН 2.0) во всех образцах полимеров преобладает структура беспорядочного клубка со значительной примесью р-структуры. а-Спиральность в полимерах в этих условиях практически отсутствует, что связано с наличием катионных зарядов на №-аминогруппах остатков лизина, находящихся вне точек "ветвления" и приводящих в свою очередь к беспорядочному клубку. В щелочном растворе (рН 10), когда №-аминогруппы лизина де-протонированы и полилизин способен существовать в виде а-спирали, доля а-спиральности для полимера 1 составляет 13%, в то время как для полимера 2 а-спиральность возрастает более чем в 3 раза и составляет уже 41%. В хорошем раство-
1
3
2
2
Таблица 2. Элементы вторичной структуры гиперразветвленного полилизина, модифицированного по N-концевым аминогруппам гистидином
Полимер Элементы вторичной структуры, %
а-спираль Р-структура* Р-поворот клубок
Вода (pH 6.4)
1 4.9 39.6/4.1 22.3 35.6
2 4.4 37.3/3.5 HCl (pH 2.0) 25.1 36.4
1 6.8 45.2/5.2 18.9 31.3
2 6.9 43.6/5.1 19.8 31.5
hbp(K) 1
2
NaOH (pH 10.0)
9.9 28.0/4.8 21.1
13.8 19.5/4.8 21.2
40.7 6.8/5 17.3 80%-ный трифторэтанол
40.3 28.2
hbp(K) 14.6 24.7/28.0 21.1 -
1 21 18.3/6.1 17.9 35.3
2 47.6 6.1/5.4 14.4 25.8
Примечание. hbp(K) - hyper branched polylysine (K - lysine в однобуквенном коде) - гиперразветвленный полилизин, полученный без обрывателя [20].
* В числителе - антипараллельная, в знаменателе - параллельная.
Таблица 3. Гидродинамические и молекулярные характеристики гиперразветвленного полилизина в 0.2 M водном растворе NaCl
Полимер [П], см3/г (при 21°C) k V , см3/г S0, ед. Сведберга D0 х 107, см2/с Msd х 10-3 Mw X 10-3
1 24 0.30 0.669 1.2 7.5 12 110
2 52 0.29 0.617 1.4 3.1 30 600
рителе (трифторэтаноле) доля а-спиральности для тех же полимеров также увеличивается: для полимера 2 она - 49% и для полимера 1 - 21%. Сопоставление этих данных с результатами К-кон-цевого анализа, полученными с помощью капиллярного электрофореза, позволяет предположить, что увеличение в реакционной среде доли обрывателя полимеризации приводит к формированию полимера, в котором вне точек "ветвления" имеются только короткие олиголизиновые фрагменты, не способные образовывать устойчивые а-спиральные структуры. В то же время уменьшение доли обрывателя полимеризации приводит к образованию полимера с более длин-
ными полимерными цепями вне точек ветвления; эти цепи способны давать устойчивую а-спираль.
Молекулярные характеристики гиперразветвленного полилизина, модифицированного по концевым аминогруппам гистидином
Молекулярно-конформационные свойства ги-перразветвленных полилизинов, модифицированных по К-концевыми лизиновым остаткам гистидином, были исследованы в водно-солевых растворах методами молекулярной гидродинамики и оптики. Как следует из табл. 3, для исследованных образцов полимеров получены относи-
1/к х 102, см2/с 8 -
следованных образцов по величине коэффициента поступательного трения
Величину гидродинамического радиуса Як растворенных частиц, точнее радиуса гидродинамически эквивалентной сферы, достаточно просто оценить, используя значения коэффициента диффузии Э и константы седиментации 50, по соотношениям
г = кБГ/Б = 6гсп<Л
4 8
Время г х 10-4, с
Рис. 2. Зависимость дисперсии диффузионной границы от времени для раствора полимера 2 (табл. 1).
тельно невысокие гидродинамические молекулярные массы Мж. Однако при этом значения характеристической вязкости [п] намного превосходят величины, которые можно было бы ожидать для твердых сферических частиц. Действительно, в соответствии с формулой Эйнштейна для непроницаемых сфер [п]сф = 2.5 V, для исследованных образцов полимеров [п]сф = 161.8 см3/г. В то же время метод светорассеяния дает величину М„, на порядки превосходящую значения Мж. Применение метода динамического рассеяния света позволило зарегистрировать в растворе одного из исследуемых образцов (табл. 3, полимер 2) две моды: быструю и медленную. Размеры частиц, соответствующих медленной моде, составляют порядка 300 нм. Вероятно, именно такие частицы и дают основной вклад при определении М„ методом светорассеяния. Следует отметить, что медленные частицы были зафиксированы и в диффузионном эксперименте. Это проявилось в сильном изменении наклона диффузионного графика с течением времени (рис. 2). Частицы, соответствующие быстрой моде, имеют размеры менее 10 нм, что достаточно хорошо согласуется со значением М8Е). По-видимому, частицы, ответственные за быструю моду и коэффициент поступательной диффузии, определенный по начальному наклону диффузионной кривой, являются изолированными макромолекулам гиперразветвленного полимера. В пользу этого предположения свидетельствует и оценка гидродинамических размеров макромолекул ис-
8о =
М80 1 - Ур0
Г N д
м
80
1- Уро
6ппоК NA
(1)
(2)
Здесь кБ - постоянная Больцмана и - число Авогадро. Вычисления по формулам (1), (2) приводят к значениям Як = 3 нм для полимера 1 и 7 нм для полимера 2 (табл. 3).
Вопрос о природе медленной моды более сложен, и на сегодняшний день он остается открытым. Это могут быть как высокомолекулярные молекулы полимера, напоминающие звездообразные полилизиновые конъюгаты лизиновых дендримеров [6], в которых к сильно разветвленному "ядру" одноточечно привиты длинные полилизиновые цепи, так и лабильные ассоциативные структуры, формирующиеся в статическом состоянии раствора. Последнее заключение представляется также вероятным, поскольку в седи-ментационном эксперименте никаких аномалий не наблюдалось, а способность к ассоциации лизиновых дендримеров, соединений, структурно весьма близких гиперразветвленному полилизину [20], была недавно обнаружена нами с использованием метода поляризованной люминесценции [23, 24].
Таким образом, в результате исследования ги-перразветвленных полилизинов, аминогруппы К-концевых остатков которых модифицированы гистидином, показано, что наличие в реакционной среде в момент получения гиперразветвлен-ных полиаминокислот при восстановительном каталитическом удалении №-карбобензоксигруп-пы с К-карбоксиангидрида №-карбобензоксили-зина регулятора-обрывателя полимеризации -активированного эфира Ка-трет-бутилоксикар-бонилгистидина позволяет контролировать как ММ полимера, так и одновременно модифициро-
4
и
вать его N-концевые аминогруппы гистидином. Это обусловливает достаточно высокую ДНК-связывающую и ДНК-трансфекционную активность образующегося гиперразветвленного полилизина [9].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реактивы
В работе использовали №-карбобензокси-L-лизин, L-аланин, №-трет-бутилоксикарбо-нил^^-бензилоксиметил^-гистидин, трифос-ген, палладий на угле, трифторуксусную кислоту, трифторметансульфокислоту, тиоанизол, этан-дитиол, №-карбобензокси-£-лизин, динитрофе-нил-(DNP)-производные аминокислот: Na-DNP-лизина, №^№-лизина, №-,№-ди^№-лизина и №^№-глутаминовой кислоты производства "Fluka" (Германия). Растворители, полученные из Открытого акционерного общества "Вектон" (Санкт-Петербург), очищали и сушили перед использованием.
Оборудование
При очистке полимеров с помощью гель-хроматографии использовали колонки, заполненные BioGel P2 (BIORAD Laboratories, США), детекцию проводили на спектрометре 2138 ЦуюоМ-Б (Прага). Аминокислотный анализ выполняли на анализаторе ААА Т339 М ("Microtechna", Прага, Чехословакия). Вторичную структуру полимеров определяли методом кругового дихроизма на ди-хрографе "Mark V" ("Jobin Ivon", Франция). Элементы вторичной структуры рассчитывали, используя программу CDNN V2.1 (Gerald Böhm/Institute für Biotechnologie Martin - Luther - Universität Hall - Wittenberg, Germany. http://bioinformatik.bio-chemtech.unihall.de/cd_spec/references.htm).
Капиллярный электрофорез осуществляли на приборе «Анализатор капиллярный ионный "На-нофор-01"» производства Института аналитического приборостроения РАН (Санкт-Петербург, Россия).
Методы молекулярной гидродинамики и оптики
Образцы гиперразветвленных полилизинов, полученных при разном соотношении N-карбок-
сиангидрид лизина : активированный эфир гисти-дина исследовали методами молекулярной гидродинамики и оптики. Все опыты проводили при температуре 21.0°С. Растворителями служили водно-солевые растворы (0.2 М КаС1) с плотностью р = 1.004 г/см3 и динамической вязкостью П0 = 100 сП.
Для определения ММ методом статического светорассеяния использовали фотогониодиффу-зометр "БоГюа". Измерения проводили по стандартной методике [25] при длине волны света = = 546 нм, калибровка прибора по бензолу Ру = = 2.32 х 10-5 см-1. Значения Мк полимера рассчитывали по формуле
cH
1
'90
P(90°) Mw
+ 2 A2 c,
(3)
где H - оптическая постоянная.
Методом динамического рассеяния света находили средний гидродинамический радиус Ян макромолекул полимера. Оптическая часть установки для этих экспериментов укомплектована гониометром БоШеог (источник света Не-Ке-лазер с длиной волны ^о = 632.8 нм и мощностью ~10 мВ). Корреляционную функцию интенсивности рассеянного света получали с помощью коррелятора РИоШеог-РС с числом каналов 288 (Закрытое акционерное общество "Антекс", Россия). Данные обрабатывали методом кумулянтов и методом регуляризации Тихонова.
Скоростную седиментацию изучали в ультрацентрифуге МОМ-3180 (Венгрия) при скорости вращения ротора 45000 об/мин. Седиментацион-ную границу формировали искусственно методом наслаивания растворителя на раствор и регистрировали с помощью рефрактометрической оптической системы Филпота-Свенссона. Седимента-ционные диаграммы имели унимодальный характер.
Поступательную диффузию исследовали, используя диффузометр Цветкова, оснащенный поляризационным интерферометром [25, 26]. Коэффициент диффузии О раствора с концентраций с рассчитывали по методу площадей и максимальных ординат. Зависимости дисперсии диффузионной границы от времени имели линейный характер; по их наклону определяли значения О. Учитывая, что в области сильного разбавления О
обычно не зависит от с, в качестве константы поступательной диффузии Э0 макромолекул сверх-разветвленных полилизинов принимали значения коэффициента Э, полученные при конечных концентрациях с < 0.10 г/дл.
Седиментационно-диффузионные ММ полимера рассчитывали по уравнению Сведберга.
Характеристическую вязкость [п] измеряли в водно-солевом растворе (0.2 М КаС1) при 21°С в капиллярном вискозиметре Оствальда с временем течения г0 = 88.2 с. Значения [п] находили, экстраполируя приведенную вязкость пуд/с к нулевой концентрации в соответствии с уравнением Хаггинса
Пуд/с = [П] + к '[п]2с,
(4)
где к' - константа Хаггинса, характеризующая молекулярные взаимодействия в растворе [26].
Синтез реагентов
Синтез К-карбоксиангидрида №-карбобензок-си-Ь-лизина проводили из №-карбобензокси-Ь-лизина и трифосгена согласно методике [27]. Пентафторфениловый эфир Ка-ВОС-(К1т-Вот)гистидина синтезировали из Ка-ВОС-(К1т-Вот)гистидина и пентафторфенола согласно работе [28].
Синтез гиперразветвленного поли-Ь-лизина, модифицированного по концевым аминогруппам лизина гистидином (табл. 1, полимер 2)
Раствор 1.5 г К-карбоксиангидрида №-карбо-бензокси-Ь-лизина и 0.15 г пентафторфенилового эфира К-трет-бутилоксикарбонил-(К1т-бензил-оксиметил)гистидина в 50 мл диоксана помещали в круглодонную трехгорлую колбу с магнитной мешалкой и к нему прибавляли 0.15 г палладия на угле и 2 капли ледяной уксусной кислоты. Гидрирование проводили при пропускании равномерного тока водорода и перемешивании раствора в течение 4 ч при 40-45°С. Через 4 ч палладий на угле отфильтровывали, промывали 10 мл диоксана и раствор оставляли на 3 суток при 40°С. Затем ди-оксан отгоняли в вакууме до объема 5 мл и продукт высаждали в петролейный эфир. Выпавший полимер отфильтровывали и сушили в эксикаторе. Получили 1.8 г полимера.
Снятие защитных групп с полимера. В круглодонную колбу с магнитной мешалкой помещали 1.8 г полимера, растворенного в 18 мл трифторук-сусной кислоты. К раствору прибавляли при перемешивании 1.8 мл трифторметансульфокисло-ты и 1.8 мл тиоанизола. Смесь перемешивали 0.5 ч при 0°С и затем 1 ч при комнатной температуре. После окончания перемешивания к раствору деблокированного полимера в трифторуксус-ной кислоте добавляли 100 мл сухого серного эфира. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали 3 раза порциями серного эфира по 20 мл и сразу подвергали очистке с использованием гель-хроматографии.
Очистка полимера с использованием гель-хроматографии. Полимер растворяли в 4 мл 6%-ной уксусной кислоты и наносили на колонку (60 х 2.5 см), заполненную Сефадексом в-10. В качестве подвижной фазы использовали 6%-ную уксусную кислоту. Соответствующую фракцию лиофили-зовали. Получили 0.3 г полимера (табл. 1, полимер 2).
Аналогично из 1.4 г К-карбоксиангидрида Ка-карбобензокси-Ь-лизина и 1.4 г пентафторфенилового эфира К-трет-бутилоксикарбонил-(К1т-бензилоксиметил)гистидина (соотношение К-карбоксиангидрид лизина : активированный эфир гистидина равно 1 : 1) получили 0.3 г полимера 1 (табл. 1).
Аминокислотный анализ полимеров. Мольное соотношение лизина и гистидина для полученных образцов гиперразветвленного поли-Ь-лизина, модифицированного гистидином, как и содержание основного вещества (полимера) в навеске, определяли с помощью аминокислотного анализа после гидролиза образцов действием 6 К соляной кислоты в течение 24 ч в ампуле при 110°С после отгонки водного раствора соляной кислоты на вакуумном испарителе.
Определение И-концевых аминогрупп с помощью капиллярного электрофореза
Модификация гиперразветвленных поли-Ь-лизинов 2,4-динитрофторбензолом. 1.2 мг полимера растворяли в 3 мл бикарбонатного буфера (рН 8.6) и обрабатывали при комнатной температуре в течение 12 ч раствором 5 мг динитрофтор-бензола в 3 мл диоксана. Выпавший модифициро-
ванный полимер отфильтровывали, промывали водой, спиртом и эфиром. После сушки в эксикаторе полимер гидролизовали в 6 N соляной кислоте в ампуле при 110°С в течение 24 ч. После отгонки водного раствора соляной кислоты на вакуумном испарителе остаток использовали для определения количества динитрофенилпроизвод-ных аминокислот (DNP-аминокислот) с помощью капиллярного электрофореза.
Капиллярный электрофорез гидролизатов полимеров. Капиллярный электрофорез DNP-про-изводных концевых аминокислот проводили в 5 мМ фосфатном буфере (рН 7.1) в кварцевом капилляре с общей длиной 45 см (длина до детектора 38 см) и внутренним диаметром 75 мкм при напряженности поля 330 В/см. Детектирование осуществляли при 360 нм. Найденные значения концентраций N-концевых аминокислот для ги-перразветвленного полилизина (соотношение N-карбоксиангидрид : активированный эфир гисти-дина равно 1 : 1, полимер 1 в табл. 1) составили: ди^№-лизин - 4.75 х 10-9 моль/мл и ди-DNP-ra-стидин - 1.62 х 10-7 моль/мл, т.е. мольное соотношение концевых аминокислот гистидин : лизин для данного образца было 34 : 1 (рис. 16). Значения концентраций N-концевых аминокислот для гиперразветвленного полилизина (соотношение N-карбоксиангидрид : активированный эфир ги-стидина равно 10 : 1, табл. 1, полимер 2) составили: ди^№-лизин - 5.35 х 10-9 моль/мл и ди-DNP-гистидин - 7.66 х 10-7 моль/мл, т.е. мольное соотношение концевых аминокислот гистидин : лизин для данного равно образца равно 14 : 1 (рис. 1в).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Methods in Molecular Medicine / Ed. by M.A. Findeis Totowa. New York: Humane Press Inc., 2001. V. 65.
2. Kukowska-Latallo J.F., Bielinska A.U., Johnson J., Spindler R., Tomalia D.A., Baker JR., jr. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. № 10. P. 4897.
3. Tansey W., Ke S., Cao X.-Y., Marites P., Wallace S., Li C. // J. Controlled Release. 2004. V. 94. № 1. P. 39.
4. Ohsaki M, Okuda T., Wada A., Hirayama T., Nii-dome T., Aoyagi H. // Bioconjug. Chem. 2002. V. 13. № 3. P. 510.
5. Okuda T., Kidoaki S., Ohsaki M., Koyama Y, Yoshika-wa, Niidome T., Aoyagi H. // Organic Biomol. Chem. 2003. V. 1. № 10. P. 1270.
6. Власов Г.П., Корольков В.И., Панкова Г.А., Тара-сенко И.И., Баранов А Н., Глазков П.В., Киселев А.В., Остапенко О.В., Лесина Е.А., Баранов B.C. // Биоорган. химия. 2004. Т. 30. № 1. С. 1.
7. Okuda T., Sugiyama A., Niidome T., Aoyagi H. // Biomaterials. 2004. V. 25. № 3. P. 537.
8. Власов Г.П., Корольков В.И., Гурьянов И.А., Баянова Н.В., Баранов А Н., Киселев А.В., Лесина Е.А., Баранов В С. // Биоорган. химия. 2005. Т. 31. № 2. С. 167.
9. Власов Г.П. // Биоорган. химия. 2006. Т. 32. № 3. C. 227.
10. PollandH., Remy J.-S., Loussouarn G, Demolombe S. // Biol. Chem. 1998. V. 273. № 13. P. 7507.
11. Boletta A., Benigni A., Lutz J., Remuzzi G, Soria M.S., Monaco L. // Human Gene Ther. 1997. V. 8. № 10. P. 1243.
12. Faneca H., Simoes S., Pedroso de Lima M.C. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1567. № 1. P. 23.
13. Behr J.P, Deminea B, Loeffler J.P, Perez-Mutul J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. № 18. P. 6982.
14. Pouton C.W., Lucas P., Thomas B.J., Uduehi A.N., Mil-roy D.A., Moss S.H. // J. Controlled Release. 1998. V. 53. № 1-3. P. 289.
15. Midoux P., Monsigny M. // Bioconjug. Chem. 1999. V. 10. № 3. P. 406.
16. Morris M.C, Chaloin L., Heitz F., Davita G. // Current Opinion in Biotechnology. 2000. V. 11. № 5. P. 461.
17. Malik N., Wiwattanapatapee R., Klopsch R., Lorenz K., Frey H, Weener J.W., Meijer E.W., Paulus W., Duncan R. // J. Controlled Release. 2000. V. 65. № 1-2. P. 133.
18. Remy J.S., Abdallah B., Zanta M.A., Boussif O., Behr J.P., Demeneix B. // Adv. Drug Deliv. Rev. 1998. V. 30. № 1-3. P. 85.
19. Власов Г.П., Павлов Г.М., Баянова Н.В., Корнее-ва Е.В., Эбель C, Ходорковский М. А., Артамонова Т.О. // Докл. РАН. 2004. Т. 399. № 3. С. 366.
20. Власов Г.П., Тарасенко И.И., Валуева С В., Кип-пер А.И., Тарабукина Е.Б., Филиппов А. П., Авдеева Е. В., Воробьев В.И. // Высокомолек. соед. А. 2005. Т. 47. № 5. С. 731.
21. David Arráez Román, Antonio Segura Carretero, Carmen Cruces Blanco, Alberto Fernández Gutiérrez // Biomed. Chromatogr. 2004. V. 18. № 7. P. 422.
22. Cortacero-Ramireza, Segura-Carreterob A., Cruces-Blancob C., Hernainz-Bermudez de Castrob M.,
Fernandez-Gutierrez A. // Food Chemistry. 2004. V. 87. № 3. P. 471.
23. AnufrievaE, Ananieva T., BayanovaN, Vlasov G, Kra-kovyak M., Nazarova O., Nekrasova T., Panarin E., SmyslovR. // Macromol. Symp. 2006. V. 237. № 1. P. 1.
24. Ануфриева E.B., Краковяк М.Г., Ананьева Т.Д., Власов Г.П., Баянова Н.В., Некрасова Т.Н., Смыслов Р.Ю. // Высокомолек. соед. А. 2007. Т. 49. № 6. С. 1013.
25. Цветков В Н., Эскин B.E., Френкель С.Я. // Структура макромолекул в растворах. М.: Наука, 1964.
26. Цветков В Н. // Жесткоцепные полимерные молекулы. Л.: Наука, 1986.
27. Daly W.H., Poche D. // Tetrahedron Lett. 1988. V. 29. № 46. P. 5859.
28. Kisfaludy L., Low M, Nieky O. // Liebigs Ann. Chem. 1973. № 9. P. 1421.
Hyperbranehed Poly(L-lysine) Modified with Histidine Residues via Lysine Terminal Amino Groups:
Synthesis and Structure
G. P. Vlasova, A. P. Filippova, I. I. Tarasenkoa, E. B. Tarabukinaa, G. A. Pankovaa, I. E. Il'inaa, A. A. Shpyrkova, E. V. Skvortsovab, A. I. Skvortsova, and V. I. Vorob'evb
a Institute of Macromolecular Compounds, Russian Academy of Sciences, Bol'shoi pr. 31, St. Petersburg, 199004 Russia b Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences, Tikhoretsii pr. 4, St. Petersburg, 194064 Russia e-mail: gpvlasov@hq.macro.ru
Abstract—A method of preparing hyperbranehed poly(L-lysine) via the polymerization of Ne-carbobenzoxy-L-lysine-N-carboxyadhydride has been developed in order to regulate the molecular mass and size of this polymer and to modify amino groups of its N-terminal lysine residues. This method includes the reductive removal of a Ne-carbobenzoxy group by hydrogen over activated palladium in the presence of a chain termination agent—activated ether of Na-tert-butyloxycarbonylhistidine. The structure of the polymers has been studied by capillary electrophoresis, circular dichroism, and molecular hydrodynamics.
