CC BY
34
УДК :616.15—07:616.15
ГИПЕРКОАГУЛЯЦИОННЫЙ СИНДРОМ ПРИ ИШЕМИЧЕСКОМ ИНСУЛЬТЕ
О.Ю. Матвиенко1, Ю.А. Наместников1, Е.А. Хаит1, О.Г. Головина1,
1 2 2 Л.П. Папаян , Д.В. Герасименко , Е.В. Мельникова ,
22 М.И. Кадинская , И.Ю. Ефимова
ФГУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» Федерального медико-биологического агентства, Санкт-Петербург,
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
Проанализирован гиперкоагуляционный синдром при ишемичес-ком инсульте. Гемостатический потенциал плазмы крови пациентов оценивали с использованием широко применяемых методов исследования системы гемостаза, а также теста генерации тромбина, открывающего новые возможности выявления гиперкоагуляционного статуса при данной патологии.
Ключевые слова: ишемический инсульт, гиперкоагуляция, микрочастицы, тест генерации тромбина
Key words: ischemic stroke, hypercoagulation, microparticles, thrombin generation assay
Около 9 млн человек в мире страдают цереб-роваскулярными болезнями. Основное место среди них занимают инсульты, которые каждый год поражают от 5,6 до 6,6 млн человек и уносят около 4,6 млн жизней. Смертность от цереброваску-лярных заболеваний уступает лишь смертности от заболеваний сердца и опухолей всех локализаций и достигает в экономически развитых странах 11 — 12% [6]. В России регистрируется около
1 Матвиенко Олеся Юрьевна, научный сотрудник лаборатории свертывания крови ФГУ «РосНИИГТ» ФМБА. Тел.: 8 (812) 274-56-50; факс: 8 (812) 71725-50. E-mail:matolesya@mail.ru.
2 Герасименко Денис Владимирович, врач-невролог клиники неврологии СПб ГМУ ГОУ ВПО им. И.П. Павлова. Тел.: + 7 (812) 499-71-83. E-mail: mariaguera@hotmail.com.
400 тыс. новых инсультов в год, 80% из них составляют ишемические [2,3]. Ишемическоое повреждение головного мозга протекает в основном на фоне атеросклеротического поражения сосудов артериального русла, в генезе которого большую роль играет активация тромбоцитов и эндотелиальных клеток, а также изменение реологических свойств крови [5,14]. Это подразумевает наличие гиперкоагуляционного статуса у пациентов, который не всегда удается выявить обычными методами исследования гемостаза. Необходимо отметить, что под действием активирующих и повреждающих стимулов, а также при увеличении напряжения сдвига текущей крови, которые сопутствуют развитию заболевания, происходит повышенное образование микрочастиц различными клетками крови и эндотелиоци-тами [4,11,12]. В некоторых работах уделяется
внимание антигенной структуре и количеству микрочастиц у пациентов с ишемическим инсультом [14]. Влияние их на коагуляционную активность крови при данной патологии не изучалось, тогда как в силу своих особенностей микрочастицы могут активно вмешиваться в процессы гемокоагуляции. Объясняется это тем, что они экспрессируют на своей поверхности отрицательно заряженные фосфолипиды, которые служат матрицей для сборки прокоагулянтных комплексов, а также основной триггер коагуля-ционного каскада — тканевый фактор (ТР). Микрочастицы способны участвовать не только в усилении, но и в распространении гемостатического потенциала, так как обладают высокой подвижностью [4,15]. Учитывая вышесказанное, закономерно предположить, что микрочастицы вносят значительный вклад в развитие нарушений гемостаза при ишемическом инсульте. Высокая частота ишемических нарушений мозгового кровообращения, значительная летальность, риск инвалидизации и тяжелых осложнений обусловливают необходимость новых исследований, которые позволят с большей достоверностью оценивать состояние гиперкоагуляции, сопровождающее ишемический инсульт, а также предоставят дополнительные сведения о патогенетических основах заболевания.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Для исследований использовали кровь из вены, взятую у 15 пациентов с ишемическим инсультом в возрасте от 31 до 86 лет не позднее 7 суток от начала заболевания, и у 97 практически здоровых лиц (контрольная группа). Кровь брали с 3,2% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Образцы бедной тромбоцитами плазмы получали путем двойного центрифугирования при 22°С: на первом этапе — в течение 10 мин при ускорении 120§, на втором — 30 мин при 2500g. Коагуляционную активность микрочастиц определяли в плазме, полностью свободной от тромбоцитов, которую получали путем центрифугирования образцов бедной тромбоцитами плазмы в течение 5 мин при 14000§. Для оценки гемостати-ческого потенциала плазмы крови определяли ряд показателей. Скрининговые коагуляционные тесты (индекс АПТВ, протромбиновый тест по Квику, тромбиновое время, концентрацию фибриногена по Клауссу) проводили рутинными методами, принятыми в лабораторной практике. Активность факторов
VIII, XII и антитромбина (АТ) определяли на автоматическом коагулометре Helena (Helena, UK), рис-томицин-кофакторную активность фактора Вилле -бранда — на анализаторе агрегации тромбоцитов АР (Solar, Беларусь). Для оценки концентрации D-диме-ра использовали полуколичественный метод латекс-ной агглютинации (Diagnostica Stago, Roche, France). Определение хагеманзависимого лизиса эуглобули-новой фракции плазмы (ХПа-ЗЭЛ) проводили методом Г.Ф. Еремина и А.П. Архипова [1]. Состояние плазменного звена гемостаза оценивали также с помощью теста генерации тромбина (Calibrated Automated Thrombogram) [10]. С помощью этого же метода исследовали коагуляционную активность, ассоциированную с микрочастицами. В качестве триггеров в реакциях генерации тромбина использовали следующие реактивы: «PPP-Reagent», содержащий отрицательно заряженные фосфолипиды и TF (конечная концентрация — 4 мкМ и 5 пМ соответственно), «PRP-Reagent», содержащий рекомбинантный TF (конечная концентрация — 1 пМ) и «MP-Reagent», включающий фосфолипиды (конечная концентрация — 4 мкМ). Для активации коагуляции применяли реактив «FluCa-kit», состоящий из субстрата тромбина, меченного флюоресцентной меткой, и Са2+. Измерения проводили относительно калибровочного раствора, который включал калибратор и образец исследуемой плазмы. Все образцы плазмы и соответствующих калибровочных растворов измеряли в триплетах на планшетном флюориметре Fluoroskan (ThermoFisherScientific, Finland) при 37 C и длине волн возбуждения и эмиссии 390 и 460 нм соответственно. С помощью прилагаемого программного обеспечения оценивали следующие параметры тромбо-граммы: lag-фазу (мин) — время инициации свертывания, ЕТР (нМ'мин) — эндогенный потенциал тромбина, Peak — максимальную концентрацию тромбина, ttPeak (мин) — время достижения максимальной концентрации тромбина.
Для описания полученных данных определяли значение медианы (Ме) и 50% доверительный интервал. Сравнение результатов, полученных в группах пациентов и доноров, проводили с использованием критерия Манна — Уитни. Использовали пакет «STATISTICA 6.0».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Обследование пациентов в острой фазе ише-мического инсульта показало, что основные тесты скрининговой коагулограммы не обнаруживают выраженных отклонений, которые могли
бы характеризовать степень нарушений в системе гемостаза. Так, показатели индекса АПТВ, протромбинового теста по Квику, тромбинового времени оставались в пределах нормальных значений. Уровень фибриногена у лиц с ишемическим инсультом, несмотря на достоверные различия между группами пациентов и доноров (Ме — 3,60 г/л, 50% ДИ: 2,83-4,04 г/л против Ме -2,73 г/л, 50% ДИ: 2,54-2,93 г/л, р < 0,01), в среднем не отличался от нормальных значений и не мог однозначно свидетельствовать о состоянии гиперкоагуляции.
Исследование других показателей гемостаза, которые отличаются большей специфичностью к выявлению гиперкоагуляционных изменений, позволили установить значительный рост активности фактора VIII и фактора Виллебранда у пациентов с ишемическим инсультом (табл. 1).
В работах, посвященных изучению гемостаза при ишемическом инсульте, повышенные значения факторов VIII и Виллебранда рассматриваются как значимые факторы риска развития ишемического поражения головного мозга [8,9]. Фактор XII, судя по последним данным литературы, оказывает существенное влияние на процесс тромбообразования [7,13]. Активность фактора XII в нашем исследовании не превышала нормальных значений, хотя отмечалась тенденция к ее увеличению у пациентов по сравнению со здоровыми лицами. То же самое можно сказать и о времени ХПа-ЗЭЛ. Несмотря на то что у отде-
Примечание. ** — р < 0,0001. ИИ — ишемический инсульт.
льных больных этот показатель был повышен, статистически значимая разница по результатам теста между группами пациентов и доноров не выявлялась, что указывает на сохранность баланса между реакциями коагуляции и фибрино-лиза. Уровень Э-димера, высокие значения которого говорят об активации фибринолиза, а также об увеличении образования тромбина, был выше нормальных значений (>1000 нг/мл) у большинства обследованных пациентов (87%). Активность антитромбина в целом по группе оставалась в пределах нормальных значений (Ме — 107%, 50% ДИ: 101-114,7%).
Таким образом, из всех исследованных показателей у больных с ишемическим инсультом результаты только четырех тестов - концентрации фибриногена, активности факторов VIII и Виллебранда, и уровня Э-димера - позволяли говорить о наличии гиперкоагуляционных изменений. Однако фактор Виллебранда и фибриноген являются белками острой фазы, их содержание может повышаться независимо от состояния гиперкоагуляции и отражать остроту процесса. Высокий уровень Э-димера также нельзя рассматривать как специфичный маркер церебро-васкулярных заболеваний.
Приведенные выше данные позволили заключить, что используемые в клинической практике тесты коагулограммы не выявляют в полной мере ту степень гиперкоагуляции, которая должна развиваться у пациентов, исходя из патогенетических основ ишемического нарушения кровообращения.
Результаты исследования гемостатического потенциала плазмы у больных с ишемическим инсультом при помощи теста генерации тромбина, глобального теста, позволяющего оценить динамику образования тромбина, ключевого фермента гемостаза, в зависимости от суммарного действия активаторов и ингибиторов этого процесса, представлены в табл. 2 и 3. Использование в качестве триггера генерации тромбина реактива «PPP-Reagent» не обнаружило каких-либо различий в показателях тромбограмм между пациентами и здоровыми лицами (см. табл. 2).
Как видно из табл. 2, эндогенный потенциал тромбина, а также максимальная его концентрация, основные показатели, которые характеризуют общий гемостатический потенциал плазмы,
Таблица 1
Показатели отдельных тестов коагулограммы у пациентов с ишемическим инсультом Ме (50% ДИ: 25-й и 75-й процентили)
Показатели Пациенты с ИИ (п = 15) Здоровые лица
Активность 184,00** 101,00
фактора VIII, % (159,00—199,00) (82,00—173,90)
(п = 30)
Активность 170,00** 97,00
фактора (130,00—220,00) (84,00—142,60)
Виллебранда, % (п = 69)
Активность 122,50 110,00
фактора XII, % (100,00—157,50) (90,00—125,00)
(п = 35)
Время 410,00 335,00
ХПа-ЗЭЛ, с (335,00—530,00) (270,00—574,00)
(п = 50)
Таблица 2 Показатели тромбограмм пациентов с ишемическим инсультом и здоровых лиц, полученные при использовании в качестве триггера реактива «PPP-Reagent» Ме (50% ДИ: 25-й и 75-й процентили)
были практически одинаковы в обеих группах. По-видимому, высокая конечная концентрация фосфолипидов и ТР (4 мкМ и 5 пМ соответственно), которые входят в состав реактива, нивелирует различия в генерации тромбина в бедной тромбоцитами плазме пациентов и доноров, используемой для постановки теста.
Учитывая, что в патогенезе инфаркта миокарда значимую роль играют атеросклеротичес-кое поражение сосудов и изменение реологических свойств крови, сопровождающиеся образованием значительного количества микрочастиц как клетками крови, так и эндотелиоцитами, мы оценили коагуляционную активность плазмы, обусловленную микрочастицами. С этой целью выполнение теста генерации тромбина проводили в плазме, полностью свободной от тромбоцитов (см. «Материал и методы»). В качестве триггеров
реакции использовали реактивы «PRP-Reagent» и «MP-Reagent». Реактив «PRP-Reagent», в котором содержится только рекомбинантный TF, позволяет определить степень участия отрицательно заряженных фосфолипидов мембраны микрочастиц в процессе образования тромбина. Реактив «MP-Reagent», состоящий только из фосфолипидов, дает возможность оценить вклад TF, экспрессированного на микрочастицы, в развитии процесса коагуляции. Полученные данные см. в табл. 3.
Постановка теста с использованием реактива «PRP-Reagent» дала возможность обнаружить у больных с ишемическим инсультом выраженное повышение показателей эндогенного потенциала тромбина и максимальной его концентрации по сравнению с соответствующими значениями в группе доноров, что указывает на наличие гипер-коагуляционного статуса у пациентов с ишемическим инсультом. Добавление в плазму реактива «MP-Reagent» выявило менее выраженные различия между обследуемыми группами. При этом значимая разница отмечалась только между показателями, характеризующими максимальную концентрацию тромбина. Значение ЕТР в группе пациентов имело лишь тенденцию к повышению по сравнению с соответствующим значением в группе доноров. В то же время при данном варианте постановки теста достоверные различия обнаружены по временным параметрам (Lag-фаза и ttPeak), что указывает на значение TF, экспрессированного на микрочастицы, в инициации и увеличении скорости образования тромбина.
Показатели «PRP-Reagent» «MP-Reagent»
пациенты с ИИ (n = 13) здоровые лица (n = 32) пациенты с ИИ (n = 14) здоровые лица (n = 65)
Lag-фаза, мин ETP, нМ-мин Peak, нМ ttPeak, мин 10,33* (9,54—11,37) 1276,50** (1179,00—1679,50) 61,13** (48,30—73,04) 19,39 (18,17—20,50) 8,93 (8,15—9,56) 471,84 (380,90—565,00) 18,40 (12,01—20,33) 19,90 (18,67—21,00) 12,75* (10,97—15,30) 1349,50 (1217,21 — 1559,50) 207,22* (157,69—258,40) 16,44* (13,99—18,59) 14,44 (12,78—16,17) 1211,67 (1008,50—1427,00) 153,45 (106,90—193,28) 19,04 (17,00—20,60)
Примечание.* — р < 0,05, ** — р < 0,0001. ИИ — ишемичечский инсульт.
Показатели Пациенты (n = 13) Здоровые лица (n = 83)
Lag-фаза, 2,32 2,33
мин (2,32—3,33) (2,00—2,67)
ETP, 1668,00 1676,67
нМ*мин (1478,00—1830,24) (1515,67—1814,00)
Peak, нМ 277,15 307,12
(252,34—338,14) (282,64—347,30)
ttPeak, мин 5,66 (5,33—6,55) 5,00 (4,44—5,63)
Таблица 3
Показатели тромбограмм пациентов с ишемическим инсультом и здоровых лиц, полученные при использовании в качестве триггера реактивов «PRP-Reagent» и «MP-Reagent»
Ме (50% ДИ: 25-й и 75-й процентили)
ВЫВОДЫ
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о наличии гиперкоагуляционного состояния у больных с ишемическим инсультом, которое с высокой долей достоверности выявляет тест генерации тромбина. В развитии этого состояния, по всей вероятности, большое значение имеют микрочастицы, присутствующие в плазме пациентов. Экспрессируя на своей поверхности в первую очередь отрицательно заряженные фос-фолипиды, а также ТР, они значительно увеличивают коагуляционный потенциал плазмы обследованных больных.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. М.: Ньюдиамед, 2001. 285 с.
2. Гулевская Т.С., Моргунов В.А., Верещагин Н.В. и др. «Симптомные» и «асимптомные» атеросклеротические бляшки внутренней сонной артерии (исследование биоп-татов, полученных при операции каротидной эндартерэк-томии) // Неврологический журн. 1999. № 2. С. 12-17.
3. Джибладже Д.Н., Кугоев А.И., Лагода О.В. Атероскле-ротическое поражение сонных артерий в патогенезе «немых» инфарктов в полушариях головного мозга // Ангиология и сосудистая хирургия. 1997. № 3. С. 47-53.
4. Зубаиров Д.М., Зубаирова Л.Д. Роль микровезикул в гемостазе - новое направление в изучении патофизиологии гемостаза // Вестник гематологии. 2005. Т. 1. №2. С. 15-20.
5. Патология сонных артерий и проблема ишемического инсульта / под ред. Джибладже Д.Н. М.: Золотой теленок, 2002. 207 с.
6. Скворцова В.И., Стаховская Л.В., Айриян Н.Ю. Эпидемиология инсульта в Российской федерации [Электронный ресурс] // Системные гипертензии. 2005. Т. 7. № 1. URL. http://old.consilium-medicum.com/media/ system/05_01/10.shtml.
7. Caen J., Wu Q. Hageman factor, platelets and polyphosphates: early history and recent connection // J. Thromb. Haemost. 2010. Vol. 8. № 8. P. 1670-1674.
8. Folsom A.R., Rosamond W.D., Shahar E., et al. Prospective study of markers of hemostatic function with risk of ischemic stroke // Circulation. 1999. Vol. 100. № 7. P. 736-742.
9. Hanson E., Jood K., Karlsoon S. et al. Plasma levels of von Willebrand factor in the etiologic subtypes of ischemic stroke // J. Thromb. Haemost. 2011. Vol. 9. № 2. P. 275-281.
10. Hemker H.C., Giestin P., Dieri R.A. et al. Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma // Path Haem Thromb. - 2003 - Vol. 33 (1). - P. 4-15.
11. Nieuwland P., Stark A. Platelet — derived microparticles In: Alan D. Michelson ed. — Platelets, chapter 20, 2 edn. Elsevier Inc., 2007. P. 403-414.
12. Pontiggia L., Steiner B., Ulrichts H.D., et al. Platelet mi-croparticle formation and thrombin generation under high shear are effectively suppressed by a monoclonal antibody against GPIba // Thromb. Haemost. 2006. Vol. 96. № 6. P. 774-780.
13. Schmaier A.H., LaRusch G. Factor XII: new life for an old protein // Thromb. Haemost. 2010. Vol. 104. № 5. P. 915-918.
14. Simak J., Gelderman M.P., Yu H. et al. Circulating en-dothelial microparticles in acute ischemic stroke: a link to severity, lesion volume and outcome // J. Thromb. Hae-most. 2006. Vol. 4. № 6. P. 1296-1302.
15. Weerhaim A., Kolb A., Sturk A. et al. Phospholipid compozi-tion of cell- derived microparticles determined by one-demen-sional high-perfomance thin-layer chromatography // Ann Clin. Biochem. 2002. Vol. 302. № 2. P. 191-198.
Поступила 27.04. 2011
Академик Андрей Воробьев: Я — насквозь советский человек
Ньюдиамед, 2010 г. — 948 с. ISBN 978-5-88107-081-6
Это книга о выдающемся враче, ученом и замечательном человеке академике Андрее Ивановиче Воробьеве, составленная в значительной мере из его выступлений, статей, клинических разборов, интервью, публикаций комментариев авторов-составителей.
Читатель увидит, как пульсирует мысль, формируются непростые решения.
В книге много исторических параллелей, необычных для современности взглядов по вопросам этики и морали. Книга одинаково интересна как врачам всех специальностей, так и читателям без медицинского образования.
По вопросам приобретения обращаться: Издательство «Ньюдиамед» www.zdrav.net E-mail: mtpndm@dol.ru (499) 782-31-09
АНДРЕЙ ÖOPO&btB:
Я - насквозь советский человек
