CC BY
3
Гигиена питания
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 2002 УДК 614.35:615.33.012.6
М. Б. Цинберг, Д. Г. Дерябин, И. В. Денисова
ГИГИЕНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ, ПОЛУЧЕННЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГИДРОЛИЗАТОВ МОЛОЧНОГО И СОЕВОГО СЫРЬЯ
ООО «Научно-производственная фирма "Экобиос"», Оренбург
Фармакологические препараты и биологически активные пищевые добавки, содержащие молочнокислые бактерии (МКБ) родов Lactobacillus и Bifidobacterium, а также продукты их жизнедеятельности, в настоящее время находят все более широкое применение при коррекции дисбиотических состояний открытых полостей организма человека, в том числе в условиях интенсивной техногенной нагрузки на экосистему |2—4, 13]. При этом один из традиционных способов [6, 131 получения препаратов МКБ заключается в культивировании специально отобранных производственных штаммов лактобацилл и бифидобактерий на гидролизатно-молочной среде (ГМС), приготовляемой на панкреатическом гидролиза-те коровьего молока. В то же время существование определенной прослойки лиц с непереносимостью молока и молочных продуктов, в некоторых популяциях составляющих до 10% населения [1, 7], значительно сужает сферу применения данных препаратов, что делает актуальным поиск альтернативных трофических субстратов для культивирования МКБ.
Целью настоящей работы явились изучение возможности использования гидролизатно-соевой среды (ГСС) в качестве основы для производства препаратов МКБ 110— 11], а также их сравнительный анализ с препаратами, полученными с использованием гидролизата молочного сырья.
В работе использованы производственные штаммы В. adolescentis МС-42, В. bifidum 1, В. longum В-379, L. acidophilus, L. delbrueckei subsp. bulgaricus 8-79 и L.
plantarum 8PA3. Данные микроорганизмы выращивали на ГМС и ГСС в течение 24—48 ч до достижения ими стационарной фазы роста, после чего полученные препараты исследовали согласно СанПиН 2.3.2.560—96 по совокупности органолептических и физико-химических свойств, в том числе на наличие тяжелых металлов, пестицидов и других загрязнителей, а также по ряду микробиологических характеристик, включающих титр микробных клеток в 1 мл препарата и наличие или отсутствие представителей санитарно-значимых групп микроорганизмов. При изучении биологических характеристик препаратов, значимых для формирования их лечебно-профилактического действия (14], тестировались адгезивная способность МКБ на модели адгезии к поверхности эритроцитов, характеризуемая индексом адгезии эритроцитов (ИАЭ) — средним количеством бактериальных клеток, прикрепившихся к эритроциту; а также показателем активности эритроцитов (АЭ) — процентом красных кровяных клеток, осуществляющих процесс адгезии [I]. Выраженность ингибируюшего действия экзо-продуктов МКБ в отношении Escherichia coli К12 и Staphylococcus aureus 209Р оценивалась индексом бактери-цидности — ИБЦ, определяемым как соотношение ко-лониеобразуюших единиц тест-штаммов в контроле и после сокультивирования с препаратами МКБ [12]. Содержание лизоцима в бесклеточных супернатантах препаратов изучали с использованием в качестве субстрата для лизоцима ацетонированного порошка индикаторной культуры Micrococcus luteus var. lysodeicticus CCM2665 [5].
Таблица I
Сравнительная гигиеническая характеристика препаратов МКБ, полученных с использованием ГМС и ГСС
Показатель
МКБ на ГМС
МКБ на ГСС
СанПиН 2.3.2.560-96
Внешний вид и консистенция Цвет
Вкус и запах
Титруемая кислотность, Т
Свинец, мг/кг
Кадмий, мг/кг
Мышьяк, мг/кг
Ртуть, мг/кг
Афлатоксин В,, мг/кг
Гексахлорциклогексак (сумма изомеров),
мг/кг
ДДТ и его метаболиты, мг/кг Андрин, мг/кг Гептахлор, мг/кг Кельтан, мг/кг Количество МКБ, КОЕ/см3 БГКП (колиформы) S. aureus
Патогенные микроорганизмы, в том числе
сальмонеллы
Дрожжи, КОЕ/см3
Плесень, КОЕ/см3
Однородная мутная жидкость
с визуальным ростом МКБ
Коричневый, равномерный
по всей массе
Кисломолочный
70-120
0,07
0,01
Не обнаружено
10'-10'
В 10 см3 не обнаружены То же
В 100 см3 не обнаружены
Менее 5 То же
Однородная мутная жидкость с визуальным ростом МКБ Светло-коричневый, равномерный по всей массе Кислый с привкусом сои 90-150 0,006 0,001
Не обнаружено
Ю'-Ю10
В 10 см3 не обнаружены То же
В 100 см3 не обнаружены
Менее 5 То же
Не более 0,1 Не более 0,03 Не более 0,05 Не более 0,005 Не более 0,006 Не более 0,05
Не более 0,05 Не допускается (< 0,002) Не допускается (< 0,002) Не допускается Не менее 10' В 10 см3 не допускаются То же
В 100 см3 не допускаются
Не более 10 То же
Таблица 2
Биологические характеристики препаратов МКБ, полученных с использованием ГМС и ГСС
Группа производственных штаммов Сред:! для культивировании Адгезивность Антагонизм (ИБЦ) Лизоцимная активность (свободный лизошш. мкг/мл)
ИАЭ АЭ. % в отношении E.coli в отношении S. aureus
Bifidobacterium spp. ГМС 0,59 ± 0,06 36,6 ± 3,1 1,5 ± 0,16 2,1 ± 0,4 0.6 ± 0,12
ГСС 0,87 ± 0,12* 41,9 ± 3,87 3.1 ± 0,5* 17,1 ± 5,1** 0,6 ± 0,1
Lactobacillus spp. ГМС 0,59 ± 0,04 41,9 ± 3,7 4.5 ± 1.1 159 ± 95 1,5 ± 0,2
ГСС 0.58 ± 0.08 40,1 ± 3,5 5,1 ± 1,1 975 ± 80,8** 0,5 ± 0,07**
Примечание . Одна звездочка — р < 0.01. две — р < 0,001.
При органолептической характеристике препаратов (табл. I) МКБ было установлено, что они имели сходные показатели и представляли собой однородную мутную жидкость коричневого (при использовании ГМС) или светло-коричневого (при использовании ГСС) цвета с видимым ростом бифидо- или лактобактерий, специфическим кисломолочным запахом и вкусом. Титруемая кислотность препаратов характеризовалась величинами 70—150 Т, при этом лактобациллы приводили к более существенным сдвигам кислотности, чем бифидобактерии, а при использовании питательной среды на основе гид-ролизата соевого сырья устойчиво регистрировались более низкие итоговые значения данного параметра.
Результаты анализа присутствия токсичных элементов, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что использование как ГМС, так и ГСС позволяет производить препараты МКБ, соответствующие действующим гигиеническим нормативам и по большинству параметров демонстрирующие отсутствие определяемых токсикантов. При этом содержание тяжелых металлов — свинца и кадмия — также было ниже установленных Сан Пи Н 2.3.2.560—96 пороговых величин, однако использование ГСС позволяло на порядок снизить их содержание по сравнению с препаратами МКБ, полученными с использованием ГМС.
При микроскопическом исследовании в препаратах лактобацилл обнаруживались крупные неспорообразую-щие грамположитедьные палочки с закругленными концами, по морфологическим и тинкториальным свойствам соответствующие роду Lactobacillus, а при изучении препаратов бифидобактернй микроскопическая картина была представлена расположенными одиночно, парами (в том числе V-образно) и иногда "палисадом" грамиоло-жительными неспорообразуюшими, вариабельными по размерам, булавовидными и разветвленными палочками, что является одним из характерных признаков представителей рода Bifidobacterium |9]. Определенное методом наиболее вероятных чисел количественное содержание МКБ соответствовало нормативным величинам или превышало их, при этом по сравнению с ГМС использование ГСС позволяло повысить выход биомассы примерно на порядок, что может объясняться присутствием в соевом сырье, помимо высококачественных белков, приравниваемых по аминокислотному составу к белкам животного происхождения, дополнительных бифидогепных факторов — олигосахаридов |7, 8|. Как видно изданных, представленных в табл. I, в нормируемых объемах препаратов МКБ все санитарно-значимые группы микроорганизмов отсутствовали.
Таким образом, использование ГСС позволяет получать препараты МКБ, по содержанию токсичных элементов, микотоксинов, пестицидов и санитарно-значи-мых групп микроорганизмов полностью отвечающие нормативам СанПиН 2.3.2.560—96 "Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов", а по некоторым параметрам даже превосходящие препараты МКБ, полученные с использованием ГМС.
При изучении биологических свойств МКБ, значимых для реализации их лечебно-профилактического действия (табл. 2), мы оценивали их адгезивность, в значи-
тельной степени определяющую способность микроорганизмов к закреплению в колонизируемой экологической нише. Результаты подобного исследования позволили констатировать, что при культивировании на ГМС изученные производственные штаммы МКБ достоверно не различались по данному признаку и их следует оценивать как низкоадгезивные (значения ИАЭ от 0,44 ± 0,08 до 0,71 ± 0,23, значения АЭ от 32,0 ± 5,2 до 47,2 ± 9,0%). При культивировании же на ГСС на фоне некоторой разнонаправленности регистрируемых эффектов основной тенденцией было повышение адгезивной способности МКБ, наиболее выраженное у бифидобактернй: ИАЭ на ГСС составил 0,87 ± 0,12 против 0,59 ± 0,06 на ГМС (р < 0,01).
Еще одним свойством, значимым для определения терапевтической ценности препаратов МКБ, является их антагонистическая активность в отношении условно-патогенных микроорганизмов, наиболее типичными грамотрица-тельными и неположительными представителями которых являются соответственно Е. coli и S. aureus (см. табл. 2). При проведении данного этапа работы было установлено, что наибольшую антагонистическую активность в отношении Е. coli К12 проявляли представители рода Lactobacillus (ИБЦ = 4,5 ± 1,1) с максимальной выраженностью у L. plantarum (ИБЦ = 6,8 ± 2,5) и минимальной у L. del-brueckei subsp. bulgaricus (ИБЦ = 2,9 ± 0,6). На этом фоне бифидобактерии проявляли значительно меньшую антагонистическую способность (ИБЦ= 1,5 ±0,16). Учитывая важное значение активности ионов водорода в развитии бактерицидного действия препаратов МКБ, мы провели сопоставление значений ИБЦ и итогового значения рН в культуральной жидкости. При этом была установлена достоверная положительная корреляционная зависимость между названными параметрами, характеризуемая значением коэффициента корреляции г = 0,6888 и при пересчете через коэффициент детерминации свидетельствующая о том, что окало 50% бактерицидного эффекта препаратов МКБ в отношении Е. coli определяется их кислотностью.
При изучении антагонистической активности препаратов МКБ на ГМС в отношении S. aureus был воспроизведен ряд описанных выше зависимостей. В частности, показана наибольшая бактерицидность препаратов лактобацилл (ИБЦ = 159 ± 95), приблизительно на 2 порядка превышающая таковую у бифидобактерий (ИБЦ = 2,1 ± 0,4) и возрастающая в ряду L. acidophilus 8,8 ± 3,6 L. delbrueckei subsp. bulgaricus 57,6 ± 30 L. plantarum 410 ± 241. При этом в формировании бактери-цидности важная роль также принадлежала формирующейся в препарате рН, связанной с величинами ИБЦ положительной корреляционной связью (г= 0,4919).
Анализ бактерицидности препаратов МКБ, выращенных на ГСС, позволил констатировать некоторое усиление их бактерицидного эффекта в отношении Е. coli, наиболее выраженное у бифидобактерий — в 2 раза по сравнению с таковым у препаратов, полученных с использованием ГМС (ИБЦ = 3,1 ± 0,5; р < 0,01). Что же касается лактобацилл, влияние культивирования на ГСС для них было выражено меньше, что ни в одном случае не привело к достоверному изменению бактерицидности. При этом выявленные изменения бактерицидности вновь в значительной степени могли быть объяснены
дальнейшим сдвигом рН в кислую сторону, достигающей на ГСС более низких значений (4,4 ± 0,05 против 4,7 ± 0,06 на ГМС), что подтверждается сохранением положительной корреляционной связи между значениями ИБЦ и рН (г= 0,4181).
С другой стороны, использование ГСС вело к чрезвычайно высокому росту значений ИБЦ в отношении S. aureus у всех изученных нами препаратов МКБ, напрямую уже не связанному со сдвигами рН в культуральной жидкости. В целом подобный рост результировался в 10-кратном увеличении ИБЦ (424 ± 351 против аналогичного показателя на ГМС, равного 43,09 ± 3,9; р < 0,001), при этом расчетные значения коэффициента детерминации свидетельствовали о не более чем 10% вкладе активности ионов водорода в формирование бактерицидности МКБ на ГСС.
Для оценки причин различия уровней бактерицидности по отношению к S. aureus при использовании ГМС и ГСС на завершающем этапе работы нами было изучено присутствие данного фермента в бесклеточных суперна-тантах препаратов МКБ. При этом в случае культивирования на ГМС наибольшая выраженность продукции ли-зоцима регистрировалась у представителей рода Lactobacillus (1,5 ± 0,2 мкг/мл) с максимумом у L. delbrueckei subsp. bulgaricus (1,9 ±0,5 мкг/мл) и минимумом у L. plantarum (1,1 ±0,3 мкг/мл). Представители рода Bifidobacterium при культивировании на ГМС характеризовались меньшей выраженностью данного признака (от 0,6 ± 0,2 до 1,3 ± 0,7 мкг/мл) с минимумом у В. adoles-centis и максимумом у В. bifidum. С другой стороны, при культивировании МКБ на ГСС для 5 из 6 изученных штаммов было продемонстрировано снижение продукции лизоцима, наиболее выраженное у представителей рода Lactobacillus — в 3 раза (до уровня 0,5 ± 0.07 мкг/ мл; р < 0,001), в результате чего различия по данному признаку между лактобациллами и бифидобактериями нивелировались.
Обсуждая полученные результаты, необходимо отметить, что, несмотря на важное значение, традиционно придаваемое присутствию лизоцима в препаратах МКБ, его определенные концентрации оказывались достаточно низкими и в несколько раз уступали концентрации данного фермента в биологических жидкостях организма человека. В связи с этим некая разнонаправленность эффектов при использовании ГСС, проявляющаяся в снижении концентрации свободного лизоцима в препаратах МКБ на фоне роста бактерицидности, очевидно, объясняется стимуляцией выработки отличных от лизоцима антибиотических субстанций, проявляющих активность преимущественно против грамположительных микроорганизмов.
Выводы. 1. Доказана возможность использования питательной среды на основе гидролизата соевого сырья для культивирования производственных штаммов МКБ при соответствии токсикологических и микробиологических параметров получаемых препаратов действующим гигиеническим нормативам.
2. Препараты МКБ, выращенные на гидролизатно-соевой среде, по своим биологическим свойствам не уступают, а в ряде случаев превосходят препараты, полученные с использованием гидролизатно-молочной среды, что проявляется в повышении их адгезивного потенциала и формировании более выраженных антагонистических свойств в отношении условно-патогенных микроорганизмов.
3. Полученные результаты позволили разработать принципиально новые БАД — "Соя—бифидум", "Соя— лактум", получить на них регистрационные удостовере-
ния и пройти необходимые согласования в НИИ питания при РАМН, ФЦГСЭН и Департаменте Госсанэпиднадзора Министерства здравоохранения РФ |10, 11].
Литература
1. Барановский А. Ю., Кондрашина Э. А. // Дисбактери-оз и дисбиоз кишечника. — СПб, 2000. — С. 77—97.
2. Бондаренко В. М., Учайкин В. Ф., Мурашова О. А., Абрамов Н. А. // Дисбиоз, современные возможности профилактики и лечения. — М., 1995. — С. 8— 11, 16-17.
3. Брилис В. И., Брилене Т. А., Ленцнер X. П., Ленцнер А. А. // Лаб. дело. - 1986. - № 4. - С. 210-212.
4. Ильина Р. М., Молокеев А. В , Никулин Г. Л., Молоке-ева Н. В. // Гиг. питания. - 2000. - № 6. - С. 35-38.
5. Каграмова К. А., Ермольева 3. В. // Антибиотики. — 1966. - Т. 11, № 10. - С. 917-919.
6. Казаков А. В // Переработка пищевой продукции. — 2000. - № 7/12. - С. 25-26.
7. KoeaiieHKO Н. К., Тиньянова Н. 3., КачалайД. П. и др. // Микробиол. журн. — 1990. — Т. 52, № 6. — С. 53-58.
8. Манвелова М. А., Чешева В. В., Плясунова Н. Г. // Медицинские аспекты микробной экологии: Сб. науч. тр. МНИИЭМ. - М., 1991. - С. 18-26.
9. Новик Г. И. // Журн. микробиол. - 1998. - Т. 67, № 3. - С. 376-383.
10. Пат. на изобретение № 2169472. РФ. Цинберг М. Б., Цинберг И. М., Денисова И. В. Способ получения бактериальной закваски для кисломолочного продукта. - М., 2001.
11. Пат. по заявке на изобретение № 2000104406/13. РФ. Цинберг М. Б., Цинберг И. М., Денисова И. В. Способ производства кисломолочного продукта. — М„ 2001.
12. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. М. О. Бир-гера. - М„ 1973. - С. 167-177.
13. Цинберг М. Б., Денисова И. В. // Среда обитания и здоровье населения: Материалы Всероссийской науч.-практ. конф. — Оренбург, 2001. — С. 182—183.
14. Шендеров Б. А. // Медицинская микробная экология и функциональное питание. — М., 1998. — Т. 1. — С. 200-233.
Поступила 21.12.01
Summary. The paper reflects the results of a comparative study of preparations of lactic acid bacteria (LAB), which are based on the hydrolysates of raw milk and soya bean materials, by using methods to determine the organoleptic and physic-ochemical properties, microbiological characteristics including the titer of microbial cells per ml of the preparation and the presence/absence of representatives of sanitary significant groups of microorganisms, the persistent properties of microorganisms. By summarizing the findings, it can be stated that it is possible to use a raw soya-bean hydrolysate-based nutrient medium to cultivate technical LAB strains with the compliance of the toxicological and microbiological parameters of the prepared preparations with the current sanitary standards. The LAB preparations grown on the hydrolysate-soya-bean medium have been protected with the patents of Russia. Their biological properties are highly competitive with those and, in some cases, superior to hydrolysate-milk medium-based preparations. This presents in their adhesive potential and in the formation of more pronounced antagonistic properties against opportunistic microorganisms.
