CC BY
60
уда 577.334 .
Вестник СПбГУ. Сер. 3, 2003,. вып. 2 (№ 11)
О- Ю. Япкоьский, Ю. А. Эйсмоптп
ГИДРОКСИЛЬНЫЙ РАДИКАЛ —ПРОДУКТ И ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ ЭФФЕКТОР КИСЛОРОДЗАВИСИМОЙ АНТИМИКРОБНОЙ СИСТЕМЫ ЛЕЙКОЦИТОВ
Среди химически активных субстанций, образующихся в живых системах (преимущественно несанкционированным путем в ходе побочных «паразитарных» реакций) и обладающих токсическим действием, наиболее разрушительные свойства присущи гид-роксильному радикалу (НО ). Связано это как чрезвычайно высоким редокс-потенци-алом НО' (В0 = +2,32В, рН7), что позволяет ему окислять практически любое химическое соединение, так и свободнорадикальной природой данного агента. Последнее обусловливает дальнейшую экспансию деструктивных процессов в тканях организма по типу цепных реакций перекисного окисления [4].
Основным путем образования НО- в организме выступает реакция-разложения пе-роксида водорода при участии молекул-восстановителей, среди , которых доминируют ионы железа:
Н202 + Ре2+ Ре3+ + ОН" + НО- . (1)
Отметим, что аналогичная реакция восстановления гидроперекисей органических веществ (различной химической природы) ведет к иному результату: образованию ал-коксильных радикалов, поскольку они не способны конкурировать с НО- за электрон:
ЫООН + Ре3*' Ре3+ + ОН" + Ш> (но не НО- + ЯО"). (1а)
Источником ионов железа для осуществления реакции (1) выступают металлопро-теиды: трансферрин, ферритин, гемпротеиды и др., экстракция ионов металла из состава которых может осуществляться путем нескольких деструктивных механизмов. В частности, самый короткий путь Для образования НО' — восстановительный — демонстрируют, например, первые 2 упомянутые белка, содержащие железо в ферри-форме (Ре3+) и не способные «удерживать» ионы Ре2+ в специализированных участках молекулы. В качестве восстановителей ионов железа могут выступать различные факторы, одноэлектронный окислительно-восстановительный потенциал редокс-пар которых ниже, чем у редокс-пары Ре3+/Ре2+ (аскорбат, 02~ и др.).
Последнее утверждение не является абсолютным и справедливо лишь для стандартных условий. При наличие в реакционной среде факторов даже с более высоким редокс-потенциалом (Во), но находящихся преимущественно в восстановленном состоянии, может сложиться ситуация когда нестандартный потенциал (В) окажется ниже, чем у пары Ре3+/Ре2+. Данная ситуация находит отражение в известном уравнении Нернста: В — Во + (КТ/пР)1п([окисл.]/[восст.]), где [окисл.] « [восст.].
Реально «освобожденные» ионы металла оказываются в слабо хелатированном состоянии, образуя неспецифические комплексы с высоко- и низкомолекулярными структурами тканей организма (белки, ДНК/1*ЙК, фосфолипи^ды мембран и липопротеидов, гликозаминогликаны и др.). По сути, именно эти биосубстраты-хелагоры и являются мишенью деструктивного действия НО", обладающего вследствие своей активности крайне низким радиусом миграции (менее 0,01 мкм) и времени жизни (не более 10~9 с) [4].
® О. Ю. Янковский, Ю. А. Эйсмонт, 2003
Между тем накапливаются данные, которые могут свидетельствовать в пользу существования специализированного механизма генерации НО-/ Данные эти касаются результатов исследования химических процессов, ответственных за реализацию био-цидного действия кислородзависимых антимикробных факторов лейкоцитов [2]. В этом случае источником гидроксильных радикалов способны выступать конечные продукты кооперации лейкоцитарной ферментной системы, представленной NADPH-оксидазой, миелопероксидазой (МПО) и индуцибельной NO-синтазой.
Индивидуально каждый из перечисленных ферментов катализирует образование следующих оксидантов:
NADPH-оксидаза: 02 + е~ Oy (а также Н2О2 — продукт дисмутации радикалов О^"); МПО: Н202 4- С1- Н20 4- ОСГ;
. NO-синтаза: аргинин 4- 2Ö2 4- Зе~ -» цитрулин + 2Н20 4- NO .
Среди этих агентов лшпь гипохлорит (0С1~),"а также продукт рекомбинации радикалов 02~ и N0' (0=N-0-0~ — пероксинитрит). признаны в качестве основных эффекторов биоцидного действия лейкоцитов. В условиях, близких к нейтральным, молекулы обоих оксидантов существуют в виде протежированных и анионных форм, содержащихся приблизительно в равных количествах (величины рКа для гипохлорита и перокси-нитрита равны соответственно 7,5 и 6,8).
Естественно, что при подкислении среды (в очаге воспаления или в фагосоме лейкоцита — область функционирования этих агентов) доля протонированных форм увеличивается. Причем, как и в случае любых окислительно-восстановительных реакций с участием Н+, оба редокс-реагента—Н0С1 и .ONOOH — выступают более мощными окислителями, чем их депротонированные формы: Eq —Ео 4- (RT/nF)ln[H+]. ЭтО же' справедливо и в отношении их кинетической реактивности, о чемсвидетелъс^вуютза-' висимости соответствующих констант скоростей от величины [Н+]: А:1„абл = fci[H+]/(-K"a 4- [Н+])— для реакций с участием протонированных реагентов, А;2набл — +
[Н+]) — для тех же реакций, но где действуют их депротонированные формы [1].
Однако более важным является то обстоятельство, что Н0С1 и ONOOH способны подвергаться следующим спонтанным превращениям. В частности, гипохорная кислота не устойчива и способна распадаться с образованием очень сильного окислителя — атомарного кислорода [3]. Последний, отрывая электрон у большинства субстратов, превращается в еще более сильный окислитель — НО-:
Н0С1 «-> HCl 4- О, (2)
О + е~ + Н+НО-. * ' (3)
Отметим, что по своим кинетическим свойствам НО' примерно в 500 раз болеё активен, чем атомарный кислород, которьШ уступает гидроксильному радикалу и в тер-' модинамическом отношении (¿Зо=+1,71 В, рН7—для одноэлектронного и Eq = +2,01, рН7-~для двухэлектронного путей окисления) [4].
Сходная картина имеет место и в случае гидропероксинитрита, но уже прямо расщепляющегося на гидроксильный радикал и менее сильный окислитель — нитрит-ра-дикал:
ONOOH NOj + НО-, к = 0,8 с"1. (4)
Конкурентом реакции (4) выступает несколько более быстрый процесс с, образованием нитрат-иона, в основе которого, как предполагается, лежит следующий механизм:
ONOOH N0^ + H+, к — 1,3 с"1.
(5)
Исследование кинетики реакции (4) показало, что за время около 1 с. на свободные радикалы распадается более половины молекул HOONO (период полупревращения — xi/2 = 1п2/к) [5]. Тем не менее инструментально удается зарегистрировать лишь 1-4% НО'. Предполагается, что в модельных экспериментах, в отсутствие биосубстратов —
перехватчиков свободных радикалов, может иметь место также цепь превращений:
■ -t
0N00H->N02 + H0 -»NOJ+H+. (6)
Взаимодействие НО' даже с валентнонасьпценными молекулами, характеризуется константами скоростей,. верхняя граница которых близка к диффузионному пределу (около 1011М-1 • с-1). Поскольку реакция диспропорционирования N0¿ и НО- является межрадикальной, то теоретически ее константа могла бы быть еще выше, приближаясь к частоте столкновений реагирующих частиц. Следовательно, есть основание полагать, что именно цепь реакций (6), а не постулированный процесс (5)., и выступает в качестве реального механизма разложения пероксинитрита до нитрат-иона.
В условиях in vivo, при подавляющем избытке валентнонасьпценных молекул-мишеней во внутренней среде организма, скорости реакций взаимодействия N0¿ и НО с такими мишенями могут оказаться не только сопоставимыми с межрадикальной, но и превысить последнюю. Это обусловлено тем, что, вопреки очень высоким константам скоростей межрадикальных реакций, концентрация радикалов в реакционной среде будет сравнительно мала и не сможет составить конкуренцию валентнонасьпценным молекулам: vi = fci[Ri][R2], v2 — fc2[R'][RH] =fcs[R'] (так как [RH]>>[R]). Следовательно, in vivo вполне может сложиться ситуация, при которой будет выполнено условие vi « V2, хотя и будет иметь место к\ » Причем для гидроксильного радикала, как уже упоминалось, часто наблюдается близость величин констант скоростей к\ и А^-
Однако в случае действительно низкого выхода НО-радикалов причиной могло бы быть следующее. А именно — высокая реактивность растворенного в водной среде СО2 (но не его гидролизованной формы: НСО3 ) в отношение пероксинитрита. В результате ONOOH станет расходоваться по конкурентному реакции (4) маршруту (6):
. ONOOH .+ С02 СО^ + NO2 +Н+, к = 4,6 • 104 М^-с"1. (7)
До последнего времени основным антиоксидантом, лимитирующим деструктивное действие ONOOH в организме, считалась мочевая кислота. Однако константа скорости разрушения пероксинитрита в этом случае примерно в 300 раз меньше: к = 155 М-1 • с-1. Если же учитывать концентрацию урата в плазме крови (около 0,3 ммоль/л), а также концентрацию С02 (около 1 ммоль/л), то окажется, что растворенная двуокись углерода почти в 1000 раз более эффективна (это следует из сопоставления рассчитанных констант скоростей псевдопервого порядка: кураТ = 0,3 ммоль/ л-155 М-1 • с"1 = 0,046 • с"1 и fccoa = 1 ммоль/л • 4,6 • 104 М"1 • с"1 =46 с"1).
Наряду с кооперацией NADPH-оксйдазы и NO-синтазы для продукции НО'(на уровне их каталитических продуктов: О^-Ь NO' ONOO" реакция 4)., имеет место и аналогичное взаимодействие NADPH-оксидазы с МПО:
НОС1 + 02~ С1- + 02 + НО',';' (8)
т.е. механизм генерации НО', альтернативный процессу (2)—(3). 100
В отличие от «близкодействующих» радикалов НО, молекулы НОС1 й ОКГООН (а также N0' и О^-) являются более долгоживущими и мигрируют на более значительные расстояния. Поэтому генерация НО' по механизму реакций (2)—(4), (8) осуществляется в объеме' жидкой фазы, а не на поверхности биоструктур (при участии «иммобилизованных» на них случайным образом «свободных» ионов металла). '' ;
Однако в аналогичном «сайт-специфическом» поражении молекул-мишёней гид-роксилъным радикалом при участии ассоциированного железа вместо Н2О2 (реакция (1)) может выступать и гипохлорная кислота
Н0С1 +■ Ре2+ СГ 4- Ре3+ + НО- . (9)
По механизму реализации эта реакция аналогична реакции (8). Однако в данном случае вместо жидкофазного супероксидного радикала (0^~) донором электрона является слабо хелатированное железо.
Поскольку именно Н0С1 и ОИООН выступают в качестве источника образования гидроксильных радикалов, оценка их доли при конкретном значении рН по отношению к депротонированным формам приобретает особое значение. Для этого можно использовать известное уравнение Гендерсона—Гессельбаха: рН = рКа + ^([А~]/[АН]), где А- и АН — соответственно депротонированная и протонированная формы оксидантов. Преобразуем данное выражение в более удобную для расчета форму
[АН]/[А~] = ЮрЛГ~Рн. (10)
Для гипохлорной кислоты или гидропероксинитрита уравнение (10) приобретает следующий вид:
[НОС1]/[ОСГ] = 10^53"рН, (10а)
[ОШОН]/[ОШО-] 106'8~Рн. (106)
Если есть возможность определить обшую концентрацию оксиданта в реакционной среде ([АН + А-^), уравнение Гендерсона—Гессельбаха позволяет оценить и концентрацию той или иной его формы:
[АН] = 10_рН[АН + А-у(1(ГРн + 10~РК), (11)
[А"] = 10~рК[АН + А"Ь/(10-рН + 10"рК). (12)
Для определения концентраций обеих форм гипохлорита и пероксинитрита уравнения (11) и (12) выглядят следующим образом:
[НОС1] = 10-рН[гипохлоритУ(10-рН + Ю"7'53), - (11а)
[ОС1~] = 10-7'53[гипохлорит]4/(10"рН + 10"7'53), (12а)
[ОШОН] = 10~рН[пероксинитрит]<;/(10'""рН + 10~6'8), (116)
[ОЖЮ-] = 10-6'8[пероксинитритУ(10-рН + 10"6'8). (126)
Наиболее простым, доступным и в то же время адекватным методом определения общего содержания гипохлорита является тауриновый [7]. В основе его лежит реакция
НОС1(ОС1-) + Н2М—СН2—СНг—ЭОзН -ч Н20(0Н") 4- С1НМ-СН2~-СН2-80зН, (13)
продукт которой —тауринхлорамин (C1HN—СНа—CHi—SO3H) легко идентифицировать гттктрпфптпмртричйски*
Создание экспериментальных моделей генерации гвдроксильных радикалов на основе реакции (8), может быть осуществлено либо традиционным способом —с применением ферментов-продуцентов (ксантиноксидазы), либо с использованием надпе-роксида калия —КОг (стабилизированный препарат суперошгщддого радикала— В.последнем случае преимуществом является то, что таким образом конструируется менее сложная и экспериментально легче контролируемая химическая модель процесса (8>
• КОг обычно применяется в качестве поглотителя С02 с одновременной регенерацией Ог в замкнутых объектам (подводных лодках и космических кораблях) [3]:
4К02 + 2С03 = 2K2CÔ? 4- 302. (14)
Определение общей концентрации пероксинитрита дня широкой лабораторной практики пока еще мало доступно и требует дорогостоящего оборудования и персонала соответствующей квалификации. Однако целенаправленный поиск специфических химических реагентов для прямого определения пероксинитрита продолжается. В настоящее время удалось решить основную технологическую проблему: получить стабилизированный препарат — натриевую соль пероксинитрита 0=N—О—ONa ( OXIS Health Products, Inc.; USA).
Таким образом, наряду с каталитическими механизмами образования активных метаболитов кислорода (АМК) и экспериментально установленными высоко реактивными производными таких метаболитов, существует принципиальная возможность целенаправленной генерации кислород-зависимой биоцидной системой лейкоцитов и наиболее мощного среди таких агентов — НО-.
В качестве потенциального источника образования НО-радикалов в лейкоцитах способны выступать ферменты-продуценты АМК этих клеток (МПО, NADPH-оксидаза и NO-синтаза), действующие кооперативно на уровне'взаимодействия продуктов их катализа.
Summary ■....,
Yankovsky О. Yu., Eismont Yu. A. Hydroxyl radical — product and potential effector of oxigen-depen-dent leucocyte antimicrobial system.
Hydroxyl radical (HO ) is the most disruptive chemical agent for living systems. The possibility of existence of a specialized mechanism for purposeful production of hydroxyl radical, was developed. The cooperation between leukocytic enzymes, generators of active forms of oxygen, is at the basis of the proposed mechanism. The conditions, under which interaction between catalyzed by such enzymes reaction products can provide HO' formation, were discussed.
Литература
1. Березин И. В., К лесов А. А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М., 1976. 2. Кокряков В, Н. Биология антибиотиков животного происхождения. СПб., 1999. 3. Слеса-рев В. И. Химия: Основы химии живого. СПб., 2000. 4. Янковский О. Ю. Токсичность кислорода и биологические системы. СПб., 2000. 5. Malinski T., Patton S., Pierchala В., Kubaszewski Е., Grun-feld S., Rao К. V.S., Tomboulian P. Kinetics pf nitric oxide release in the presence of superoxide in the endocardium as measured by a porphyrinic sensot / / Frontiers of Reactive Oxygen Species in Biolology and Medicine / Ed. by K.Asada, T.Yoshikawa. Amsterdam, 1994. P. 207-210. 6. Squadrito G.L., Cueto R., Splenser A.E., Valavanidis A., Zhang H., Uppu R. M., Pryor W. A. Reaction of uric acid with peroxyni-trite and implication for the mechanism of neuroprotection by uric acid // Arch. Biochem. Biophys. 2000. < Vol. 376, N 2. P. 333-337. 7. Weiss S.J., Klein R., Slivka A., Wei M. Chlorination of taurine by human neutrophils // J. Clin. Invest. 1982. Vol.70, N 3. P..598-607.
Статья постргйла в редакцию 16 января 2003 г.
