CC BY
8
Turczaninowia 26, 2: 59-81 (2023) DOI: 10.14258/turczaninowia.26.2.4 http://turczaninowia.asu.ru
ISSN 1560-7259 (print edition)
TURCZANINOWIA
ISSN 1560-7267 (online edition)
УДК 582.675.1:58.087+575.86(470)
Геометрическая морфометрия и филогенетический анализ таксонов
рода Delphinium юга России
А. С. Кашин1' 3*, А. В. Богослов1' 4, А. С. Пархоменко1' 5, И. В. Шилова1' 6, Т. А. Крицкая1' 7, Р. А. Муртазалиев2' 8
1 Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н. Г. Чернышевского, ул. Астраханская, д. 83, г. Саратов, 410012, Россия
2 Прикаспийский институт биологических ресурсов Дагестанского ФИЦ РАН, ул. М. Гаджиева, д. 45, г. Махачкала, 367000, Россия
3E-mail: [email protected]; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0002-2342-2172
4E-mail: [email protected]; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0002-2248-1285
5E-mail:[email protected]; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0002-9948-7298
6E-mail: [email protected]; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0002-9828-4229
7E-mail: [email protected]; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0003-0181-3022
8E-mail: [email protected]; ORCID iD: https://orcid.org/0000-0002-2895-213X
* Автор для переписки
Ключевые слова: анализ Байеса' геометрическая морфометриЯ' канонический анализ' таргетное секвениро-вание' Delphinium.
Аннотация. Методами геометрической морфометрии проанализирована форма листовых пластинок 665 образцов 18 видов рода Delphinium. Методом канонического анализа в пределах подрода Delphinastrum относительно хорошо отделился D. elatum и в несколько меньшей мере D. uralense' в то время как D. litwinowii, D. pubiflorum, D. duhmbergii' D. subcuneatum фактически не разделились. В пределах подрода Oligophyllon этим методом хорошо отделился D. caucasicum. Разделились также облака рассеяния точек D. freynii + D. puniceum + D. sergii' с одной стороны' и D. fedorovii + D. gelmetzicum - с другой. Delphinium arcuatum' D. bracteosum, D. crispulum' D. flexuosum' D. mariae между собой не разделились. Характер обособления групповых видовых выборок в пространстве канонических переменных и относительная их близость друг к другу могут быть связаны с экологическим или географическим сходством мест произрастания популяций изученных видов' а также с влиянием гибридизационных процессов в зоне вторичного контакта видов. Различия в форме листовых пластинок в основном связаны с шириной сегментов' длинами центрального сегмента средней лопасти и нерасчленённой части листовой пластинки' степенью её рассечения' формой основания' расстоянием между нижними лопастями. Исходя из результатов секвенирования ДНК межгенного транскрибируемого спейсера ITS2' не вызывает сомнений видовая самостоятельность D. puniceum' D. macropogon D. mariae' D. samurense и D. pubiflorum. Поддерживается синонимичность D. freynii и D. sergii с приоритетным названием D. schmalhausenii. Delphinium cuneatum' D. subcuneatum' D. duhmbergii и D. litwinowii следует считать синонимами с приоритетным названием D. cuneatum. Таксономический статус D. dictyocarpum' D. elatum и D. uralense требует дальнейшего уточнения. Это связано' вероятно' с лёгкостью их гибридизации с D. cuneatum в сим-патрических популяциях в зонах перекрывания ареалов. Delphinium arcuatum' D. bracteosum' D. caucasicum' D. crispulum' D. elisabethae' D. fedorovii, D. flexuosum, D. gelmetzicum и D. speciosum плохо разделяются' что также может быть связано с гибридизационными процессами. Они нуждаются в более подробном изучении.
Поступило в редакцию 11.09.2022 Принято к публикации 30.06.2023
Submitted 11.09.2022 Accepted 30.06.2023
Geometric morphometrics and phylogenetic analysis of Delphinium taxa from south of Russia
A. S. Kashin1, A. V. Bogoslov1, A. S. Parkhomenko1, I. V. Shilova1, T. A. Kritskaya1, R. A. Murtazaliev2
1 Saratov State University, Astrakhanskaya St., 83, Saratov, 410012, Russian Federation
2 Caspian Institute of Biological resources of Daghestan Federal Research Center of RAS,
M. Gadzhieva St., 45, Makhachkala, 367000, Russian Federation
Keywords: Bayesian analysis, canonical variate analysis, Delphinium, geometric morphometrics, targeted sequencing.
Summary. The leaf blade's shape of 665 samples of 18 taxa from the genus Delphinium was analyzed using geometric morphometrics method. Within the subgenus Delphinastrum, D. elatum and, to a lesser extent, D. uralense were relatively well separated by canonical analysis, while D. litwinowii, D. pubiflorum, D. duhmbergii, and D. subcuneatum were not actually separated. Within the subgenus Oligophyllon, D. caucasicum was well separated by this method. The scatter clouds of D. freynii + D. puniceum + D. sergii on the one hand, and D. fedorovii + D. gelmetzicum on the other hand, also separated. D. arcuatum, D. bracteosum, D. crispulum, D. flexuosum, and D. mariae did not separate from each other. The nature of such separation of species groups observed in the space of canonical variables and their relative proximity to each other can be associated with the habitat similarity of their populations driven by ecological or geographical conditions, as well as the influence of hybridization processes in the zone of secondary contact of species. The differences in leaf blade's shape are mainly related to the width of the segments, the lengths of the central segment of the middle lobe and the undissected part of the leaf blade, the degree of its dissection, the shape of the base and the distance between the lower lobes. Based on the results of DNA sequencing of the intergenic transcribed spacer ITS2, the taxonomic independence of D. puniceum, D. macropogon, D. mariae, D. samurense, and D. pubiflorum is beyond any doubt. The synonymy of D. freynii and D. sergii is supported, with the priority name of D. schmalhausenii. D. cuneatum, D. subcuneatum, D. duhmbergii, and D. litwinowii should be considered as synonyms with the priority name of D. cuneatum. The taxonomic status of D. dictyocarpum, D. elatum, and D. uralense needs further clarification. This is probably related to their easy hybridization with D. cuneatum in sympatric populations within the overlapping areas. Delphinium arcuatum, D. bracteosum, D. caucasicum, D. crispulum, D. elisabethae, D. fedorovii, D. flexuosum, D. gelmetzicum, and D. speciosum are poorly separated, which can also be associated with hybridization processes. They need to be studied in more detail.
Введение
Род Delphinium L. включает, по разным данным, от 200 (Nevskiy, 1937)-300 (Tzvelev, 2001; Fedorov, 2003) до 365 (Malyutin, 1987; Fedorov, 2003)-519 (Plants of the World Online, 2023) видов. Уже этот разброс представлений о числе видов в роде указывает на то, что в систематике данного рода ещё много неясного и неустоявшегося. При этом до последнего времени, по крайней мере в русскоязычной ботанической литературе, продолжают активно описываться новые виды - в частности, во флорах Кавказа (Luferov, 2012; Murtazaliev, Luferov, 2021), Алтая (Ebel, 2006), Сибири (Ebel, 2007; Kurbatskiy, 2017).
Представители рода Delphinium распространены в Северном полушарии от умеренно тёплых и субтропических областей до горных районов тропиков (Tzvelev, 2001). Отдельные таксоны рода, такие как D. elatum L., D. dictyocarpum DC. или D. cuneatum Stev. ex DC., весьма широко рас-
пространены как в природе, так и в культуре. Это, как полагают, служит причиной высокой морфологической изменчивости растений в пределах ареалов (Malyutin, 1973, 1987, 1992). В таком случае целая группа близкородственных таксонов с невсегда чёткой экологической и географической дифференциацией, образующих, вероятно, на стыке ареалов переходные формы, рядом исследователей принимается за один вид (Tutin et al., 1993; Fedorov, 2003; Yelenevskiy et al., 2009). Например, Н. И. Фёдоров (Fedorov, 2003) характеризует такие группы как сингамеоны в понимании V. Grant (1981) или Р. В. Камелина (Kamelin, 2009). Однако Н. Н. Цвелёв (Tzvelev, 1996, 2001), напротив, считает таксоны подобных комплексов самостоятельными видами, объединяя в группы, называя последние «агрегатами».
Как следствие, Н. Н. Цвелёв (Tzvelev, 2001) для Восточной Европы указывает 19 видов рода Delphinium. Из них 15 относятся к сек-
ции Delphinastrum DC. и четыре - к секции Diedropetala Huth. В секции Delphinastrum им выделены четыре группы: 1) D. aggr. elatum L. с пятью видами (D. elatum, D. alpinum Waldst. et Kit., D. cryophilum Nevski, D. nacladense Zapal., D. villosum Stev.); 2) D. aggr. cuneatum Stev. ex DC. с четырьмя видами (D. cuneatum, D. subcuneatum Tzvel., D. litwinowii Sambuk, D. duhmbergii Huth); 3) D. aggr. dictyocarpum DC. с четырьмя видами (D. pubiflorum Turcz., D. dictyocarpum, D. cyanan-thum Nevski, D. uralense Nevski); 4) D. aggr. chei-lanthum Fisch. с двумя видами (D. middendorffii Trautv., D. grandiflorum L.). В секции Diedropetala он объединяет в группу D. aggr. fissum Waldst. et Kit. три вида (D. leiocarpum Huth, D. pallasii Nevski, D. sergii Wissjul.), оставляя самостоятельным D. puniceum Pall.
При таком понимании объёма видов в пределах юго-восточной части европейского ареала рода произрастают, например, 10 видов. Из секции Delphinastrum полностью представлена группа D. aggr. cuneatum: D. cuneatum, D. subcu-neatum, D. litwinowii, D. duhmbergii; более половины видов из группы D. aggr. dictyocarpum: D. pubiflorum, D. dictyocarpum, D. uralense; один вид из группы D. aggr. elatum: D. elatum. Из секции Diedropetala встречаются два вида - эндемичный D. sergii из группы D. aggr. fissum и D. puniceum.
Однако во «Флоре Европы» (Tutin et al., 1993) D. cuneatum, D. subcuneatum, D. litwinowii, D. duhmbergii отнесены к одному виду с приоритетным названием D. cuneatum. Delphinium pubiflorum и D. dictyocarpum отнесены к D. dictyocarpum DC. ssp. dictyocarpum, а D. uralense - к D. dictyocarpum DC. ssp. uralense. При этом D. sergii не выделен из D. schmalhausenii Albov. При таком понимании в пределах исследованной части ареала рода произрастают только 5 видов: из секции Delphinastrum - D. cuneatum, D. dictyocarpum и D. elatum; из секции Diedropetala - D. schmal-hausenii и D. puniceum.
В понимании Н. И. Малютина (Malyutin, 1987), в пределах юго-восточной части европейского ареала рода произрастают 8 видов: из секции Delphinastrum - D. elatum, D. cuneatum, D. litwinowii, D. iliense Huth. (= D. duhmbergii), D. dictyocarpum; из секции Koloboretala Huth -D. grandiflorum (= D. pubiflorum); из секции Oligophyllon Dimitrova - D. schmalhausenii (= D. ser-gii) и D. puniceum. При этом число и объём секций, принятых у данного автора, не совпадает с таковыми у T. G. Tutin et al. (1993) и Н. Н. Цвелё-ва (Tzvelev, 2001).
Противоречивая картина получена и при использовании молекулярно-генетических методов анализа последовательностей фрагментов ядерной и хлоропластной ДНК, предпринятого для реконструкции филогении секции Diedropetala рода Delphinium в пределах североамериканской части её ареала (Koontz et al., 2009). Использованный авторами метод максимальной экономии в пределах построенного консенсус-ного филогенетического дерева по последовательностям ДНК образцов 62 из 67 видов выявил незначимую бутстреп поддержку и слабое разрешение многих из исследованных таксонов секции.
Филогенетические отношения в другой крупной секции Delphinastrum подвергались исследованию с использованием молекулярно-ге-нетических маркёров только в рамках анализа филогении трибы Delphinieae (Warm.) Schrod. (Jabbour, Renner, 2011, 2012). При этом были использованы образцы 54 из 150 видов данной секции. Из таксонов, являющихся предметом настоящего исследования, были взяты только по одному гербарному образцу D. elatum (Урал) и D. cuneatum (Самарская обл.). При анализе пла-стидных и ядерных последовательностей (ITS1-5.8S-ITS2 и trnL-trnF) методом максимального правдоподобия эти виды не разделились, хотя по представлениям Н. И. Малютина (Malyutin, 1987), они относятся к разным подсекциям секции Delphinastrum, а по представлениям Н. Н. Цвелёва (Tzvelev, 2001) - к разным агрегатам. Во «Флоре Европы» (Tutin et al., 1993) они указаны как самостоятельные виды.
Нами ранее на основе методов нумерическо-го и филогенетического анализов (nrITS barcode) проведено уточнение таксономического статуса 10 видов Delphinum (D. cuneatum, D. dictyocarpum, D. duhmbergii, D. elatum, D. litwinowii, D. pubiflorum, D. puniceum, D. sergii, D. subcunea-tum, D. uralense), произрастающих на юго-востоке Европейской России. Анализ неметрического многомерного шкалирования (NMDS) по совокупности 54 морфологических признаков достоверно разделяет только D. puniceum, D. sergii, D. uralense и D. pubiflorum при фактической не-разделённости остальных видов. Метод «Random forest» и филогенетический анализ последовательностей ITS региона методом MrBayes указывают на видовую самостоятельность D. puniceum из секции Diedropetala, а также D. elatum, D. uralense, D. dictyocarpum и D. pubiflorum из секции Delphinastrum. По резуль-
татам анализа однозначно синонимичными являются D. litwinowii, D. cuneatum, D. subcunea-tum, D. duhmbergii с приоритетным названием D. cuneatum. Показано, что большую проблему для таксономии исследованных видов секции Delphinastrum составляют наличие множества переходных или гибридных форм в районах контактов их ареалов и зависимость проявления морфологических признаков, в том числе и так-сономически значимых, от погодных и природно-климатических условий (Kashin et al., 2021).
Методы геометрической морфометрии нашли широкое применение в ботанике. Много исследований посвящено именно выяснению специфики изменчивости форм тех или иных структурных элементов разных видов (Conesa et al., 2012; Mijnsbrugge et al., 2016; Chitwood, Otoni, 2017; Miljkovic et al., 2019; Neto et al., 2019; Márquez et al., 2021; Strelin et al., 2021). Однако до последнего времени отсутствуют работы по геометрической морфометрии представителей рода Delphinium. Исключение составляет только исследование, посвящённое формообразованию цветочных структур у Delphinieae (Chen et al., 2018). Кроме того, следует указать работы по исследованию формы листовых пластинок у комплекса Ranunculus auricomus L., относящегося, как и род Delphinium, к семейству Ranunculaceae (Hodac et al., 2018; Karbstein et al., 2020).
Цель настоящей работы состояла в уточнении таксономического статуса и филогенетических отношений Delphinium Северного Кавказа и юго-востока Европейской России по результатам анализа изменчивости формы листовой пластинки и молекулярно-генетического полиморфизма.
Материал и методы
Всего исследовано 79 популяций 23 таксонов рода Delphinium Северного Кавказа и юго-востока Европейской России (рис. 1).
Геометрическая морфометрия. Для геометрической морфометрии использованы листовые пластинки 665 образцов из 38 популяций 18 таксонов рода Delphinium Европейской России (табл. 1, рис. 1). Во флоре юго-востока Европейской России материал был собран в период с 2017 по 2020 гг. из девяти популяций D. litwinowii, шести популяций D. pubiflorum, трёх популяций D. puniceum, по одной популяции - D. dictyocarpum, одной D. duhmbergii, D. sergii, D. subcuneatum. Во флоре Северного
Кавказа материал был собран в 2021 г. из четырёх популяций D. flexuosum M. Bieb, трёх популяций D. crispulum Rupr., по одной из популяций D. arcuatum N. Busch, D. bracteosum Somm. et Lev., D. caucasicum C. A. Mey, D. fedorovii Dimitrova, D. freynii Conrath, D. gelmetzicum Dimitrova, D. mariae N. Busch. Кроме того, в анализе были использованы листовые пластинки из гербар-ных сборов генеративных растений популяций Южного Урала, собранных Н. И. Фёдоровым. Использовались листовые пластинки растений из одной популяции D. elatum и одной популяции D. uralense, собранных в 1997 г.
Для анализа использовались наиболее типичные для конкретного таксона листовые пластинки из середины побега растений зрелого генеративного состояния. В анализе использовались от 7 до 30 образцов из каждой популяции. Отсканированные изображения были скомпилированы вместе, после чего с помощью программного пакета «tpsUtil» был собран TPS файл (Vasilev et al., 2018). С помощью него в программе «tpsDig2» было расставлено по 30 меток-ландмарок. Учитывая сложность формы листовой пластинки, в двух последующих вариантах анализа было расставлено по 66 и 84 метки-ландмарки соответственно (рис. 2). Однако увеличение числа меток-ландмарок принципиально не изменили результатов анализа. Ландмарки были размещены таким образом, чтобы зафиксировать все основные морфологические особенности (признаки) формы листовой пластинки и её элементов - ширину сегментов, расстояние между нижними лопастями, характер и степень рассечения, форму основания листовой пластинки. При этом в расстановке меток принимали во внимание схему, ранее применённую для Ranunculus auricomus (Hodac et al., 2018; Karbstein et al., 2020), относительно близкого к Delphinium.
В результате расстановки меток-ландмарок были получены их «сырые» координаты. Далее в программе «MorphoJ» исходные координаты были преобразованы посредством генерализованного Прокрустова анализа с помощью соответствующей процедуры «Procrustes fit» (Klingenberg, 2011).
Кроме того, были получены усреднённые каркасные формы по двум используемым в анализе генеральным выборкам - таксонов подрода Delphinastrum и подрода Oligophyllon. По такому же принципу были созданы каркасы, описывающие среднюю форму листовых пластинок в видовых выборках.
Исследованные популяции различных таксонов рода Delphinium и коды доступа к их секвенированным
последовательностям ДНК в базе данных GenBank
№ ID* Географическое расположение Координаты Код доступа GenBank
Северная широта Восточная долгота
Подрод Delphinastrum (DC.) Peterm.
Delphinium cuneatum Stev. ex DC.
1 C-l-1 C-l-2 C-l-3 Ульяновская обл., Инзенский р-н, м/у с. Дракино и Коржевка 54°1Г11.6" 46°24'27.3" МТ137573 МТ137574 МТ137575
2 C-2-1 Республика Марий-Эл, Новоторъяльский р-н, окр. с. Лобаны 56°58'13.4" 48°28'42.8" МТ137565
3 C-3-1 Самарская обл., Исаклинский р-н, окр. с. Исаклы 54°6'53.2" 51°29'40.3" МТ137572
4 C-4-1 Самарская обл., Сергиевский р-н, окр. п. Серноводск 53°564" 51°13'8.3" МТ137576
5 C-5-1 C-5-2 C-5-3 Самарская обл., Борский р-н, НП «Бузулукский бор» 52059'9Л" 5Г5941.1" МТ137569 МТ137570 МТ137571
6 C-6-1 C-6-2 C-6-3 Республика Удмуртия, Алнашский р-н, с. Варзи-Ятчи 56°7'8.4" 52°49'37.5" МТ137566 МТ137567 МТ137568
7 C-7-1 C-7-2 C-7-3 Республика Башкортостан, Туймазинский р-н, оз. Кандрыкуль 54°29'5" 54°7'30" МТ137562 МТ137563 МТ137564
8 C-8-1 Республика Башкортостан, Чишминский р-н, окр. с. Кара-Якупово 54°33'51.7" 55°30'30.5" МТ137577
Delphinium dictyocarpum DC.
9 Dc-1-1 Оренбургская обл., Бузулукский р-н, окр. с. Карачево 53°6'53.4" 52°17'19.1" МТ137584
10 Dc-2-1 Оренбургская обл., Тюльганский р-н, м/у п. Тюльган и с. Ташла 52°22'12.2" 56°11'2.9" -
11 Dc-3-1 Dc-3-2 Dc-3-3 Республика Башкортостан, Аургазинский р-н, р. Аургазы 54°8'22" 55°36,21" МТ137581 МТ137582 МТ137583
12 Dc-4-1 Dc-4-2 Dc-4-3 Республика Башкортостан, Ишимбайский р-н, гора Тратау 53°32'36.4" 56°6'29.3" МТ137578 МТ137579 МТ137580
13 Dc-5-1 Республика Башкортостан, Баймакский р-н, окр. с. Акмурун 52°ЗГ41.9" 58°10'8.3" МТ137585
№ т* Географическое расположение Координаты Код доступа вепБапк
Северная широта Восточная долгота
Ое1рЫтит йиктЬег^И НиЛ
14 Бт-Ы Вт-1-2 Бт-ЬЗ Воронежская область, Таловский р-н, окр. ст. Таловая 51°4'27.5" 40°46'43.9" МТ137586 МТ137587 МТ137588
Ое1рЫпшт еШит Ь.
15 Е-1-1 Е-1-2 Е-1-3 Самарская обл., Челно-Вершинский р-н, окр. с. Токмакла 54°207.8" 51°10,12.1" МТ137598 МТ137599 МТ137600
16 Е-2-1 Е-2-2 Е-2-3 Самарская обл., Исаклинский р-н, окр. с. Исаклы 54°6'53.2" 51°29'40.3" МТ137592 МТ137593 МТ137594
17 Е-3-1 Е-3-2 Е-3-3 Самарская обл., Борский р-н, НП «Бузулукский бор» 52°59'9.1" 51°59'41.1" МТ137595 МТ137596 МТ137597
18 Е-4-1 Республика Башкортостан, Белорецкий р-н, окр. д. Баскан 53°55'43.2" 57°57'43.6" МТ137604
19 Е-5-1 Республика Башкортостан, Иглинский р-н, окр. с. Тавтиманово 54°54'21.5" 56°39' 11.3" МТ137602
20 Е-6-1 Е-6-2 Е-6-3 Республика Башкортостан, Архангельский р-н, окр. д. Азово 54°28'6" 57°5'13" МТ137589 МТ137590 МТ137591
21 Е-7-1 Республика Башкортостан, Учалинский р-н, окр. д. Ягудино 54°1'29.4" 59°5'21.2" МТ137601
22 Е-8-1 Республика Башкортостан, Баймакский р-н, окр. с. Тубинский 52°54'20.3" 58° 14' 18.1" МТ137603
Ое1рЫпшт Ши>тои>и БатЬик
23 Ь-1-1 Ь-1-2 Ь-1-3 Воронежская обл., Острогожский р-н, окр. д. Владимировка 50°39'43.6" 39°0'57.4" МТ137617 МТ137618 МТ137619
24 Ь-2-1 Тамбовская обл., Тамбовский р-н, окр. с. Орловское 52°33,56.8' 41°11'44.7" -
25 Е-3-1 Пензенская обл., Пензенский р-н, окр., с. Поперечное 52°59'36.3" 44°20'1.2" -
26 Е-4-1 Пензенская обл., Колышлейский р-н, окр. х. Островцы 52°49'41.6" 44°28'10" -
27 Е-5-1 Е-5-2 Е-5-3 Пензенская обл., Лунинский р-н, окр. с. Большой Вьяс 53°51'31" 45°28,26.6" МТ137623 МТ137624 МТ137625
п> О 2 п> н "С 8 ■С п>
о *
X
2 о "С ►в* о 2 п> н "С 8
►в* »
О м п> 8 а н
2 £
п>
о *
8=
8
:= 2
Н
Я о о я о в
О р р Ё О Я
З4 и з-Р 5' 8 3 и
: "С
№ ю* Географическое расположение Координаты Код доступа СепВапк
Северная широта Восточная долгота
28 Ь-6-1 Пензенская обл., Никольский р-н, окр. с. Коржевка 53°44'0.9" 46°15'32.5" -
29 Ь-7-1 Ульяновская обл., Инзенский р-н, окр. с. Валгуссы 54°4'41.1" 46°1Г24.8" -
30 Ь-8-1 Ь-8-2 Ь-8-3 Республика Мордовия, Дубенский р-н, окр. с. Енгалычево, заказник «Латинский склон» 54°18,28.1" 46°25,36.5" МТ137611 МТ137612 МТ137613
31 Ь-9-1 Ь-9-2 Ь-9-3 Республика Мордовия, Ромодановский р-н, окр. с. Болтино 54°29'4.9" 45°32'36.3" МТ137620 МТ137621 МТ137622
32 Ь-10-1 Ь-10-2 Ь-10-3 Ульяновская обл., Карсунский р-н, окр. с. Котяково 54°16'58.4" 46°43'43.2" МТ137605 МТ137606 МТ137607
33 Ь-11-1 Ь-11-2 Ь-11-3 Ульяновская обл., Вешкаймский р-н, окр. с. Зимнёнки 54°2'21.5" 46°54,47.1" МТ137614 МТ137615 МТ137616
34 Ь-12-1 Ь-12-2 Ь-12-3 Ульяновская обл., Майнский р-н, окр. с. Сиуч 54°19,3.1" 47°48'49.4" МТ137608 МТ137609 МТ137610
35 Ь-13-1 Ульяновская обл., Чердаклинский р-н, м/у с. Петровское и Богдашкино 54°23'32.8" 49°2'50" -
Ое1рЫпшт риЫАогит Тигсг.
36 Р-1-1 Р-1-2 Р-1-3 Р-1-4 Тамбовская обл., Инжавинский р-н, окр. с. Екатеринополье 52°16'18.2" 42°52'8.6" МТ137626 МТ137627 МТ137628 МТ137629
37 Р-2-1 Саратовская обл., Красноармейский р-н, окр. с. Каменка 50°42'52.5" 45°16'33.7" -
38 Р-3-1 Р-3-2 Р-3-3 Саратовская обл., Татищевский р-н, окр. д. Ильиновка 51°4Г13.8" 45°4Г21.5" МТ137630 МТ137631 МТ137632
39 Р-4-1 Ульяновская обл., Новоспасский р-н, окр. с. Новая Лава 53°3'23.2" 47°34'46.3" МТ137639
40 Р-5-1 Ульяновская обл., Радищевский р-н, окр. п. Гремячий 52°59'48.3" 47°42'14.9" -
СТ\ СТ\
№ ID* Географическое расположение Координаты Код доступа GenBank
Северная широта Восточная долгота
41 P-6-1 P-6-2 P-6-3 Ульяновская обл., Радищевский р-н, окр. д. Белогоровка 52°47'37.2" 47°47'22.5" МТ137633 МТ137634 МТ137635
42 P-7-1 P-7-2 P-7-3 Саратовская обл., Хвалынский р-н, окр. с. Акатная Маза 52°24'20" 47°4Т32" МТ137636 МТ137637 МТ137638
Delphinium subcuneatum Tzvel.
43 S-l-1 S-1-2 S-l-3 Самарская обл., Красноярский р-н, окр. с. Б. Каменка 53°35Т7" 50°35'58.4" МТ137640 МТ137641 МТ137642
Delphinium uralense Nevski
44 U-l-1 U-l-2 U-l-3 Республика Башкортостан, Зианчуринский р-н, окр. д. Худобандино 52°9'50.5" 57°1'33.2" МТ137646 МТ137647 МТ137648
45 U-2-1 U-2-2 U-2-3 Республика Башкортостан, Зианчуринский р-н, окр. д. Верхний Муйнак 52°0'50.7" 56°57'23" МТ137643 МТ137644 МТ137645
46 U-3-1 U-3-2 U-3-3 Республика Башкортостан, Зианчуринский р-н, окр. д. Каргала 52°7'32.6" 57°5'9.9" МТ137649 МТ137650 МТ137651
Подрод Oligophyllon Dimitrova
Delphinium arcuatum N. Busch
47 Ar-1-1 Республика Дагестан, Докузпаринский р-н, м/у с. Текипиркент и Куруш 41017'23Л" 47°50ТЗ" ON622677
Delphinium bracteosum Somm. et Lev.
48 Br-1-1 Республика Дагестан, Агульский р-н, окр. с. Чираг-Кара 41°49'43.3" 47°28'52.8" ON622678
49 Br-2-1 Республика Дагестан, Акушинский р-н, окр. с. Ниж. Мулебки 42°19'30.2" 47°34Т1.3" ON622679
50 Br-3-1 Республика Дагестан, Лакский р-н, окр. п. Кума 4Г47'56" 47°27'52.8" ON622680
Delphinium caucasicum C. A. Mey.
51 Ca-1-1 Республика Дагестан, Докузпаринский р-н, окр. с. Куруш 41°14'51.1" 47°48'6.7" ON622681
г> О 2 гт> н "d S ■С гт> п ?!
X
2 о "d ►в* о 2 гт> н "d S
►в*
s
»
о 1-1 гт> Я а
S £
г> о 7! S
я=
я
t: S
н fa я о о я о в
О р
р Ё
м s О Я
з-Р 5' я 3 и : "d
№ ID* Географическое расположение Координаты Код доступа вепБапк
Северная широта Восточная долгота
Delphinium crispulum Rupr.
52 Cr-1-1 Республика Дагестан, Гунибский р-н, северо-восточный склон Гунибского плато (фиолетовая форма) 42°24'32.6" 46°54'30.3" ON622682
53 Cr-2-1 Республика Дагестан, Гунибский р-н, восточный склон Гунибского плато (белая форма) 42°25'8.2" 46°53'9.2" ON622683
54 Cr-3-1 Республика Дагестан, Ботлихский р-н, восточный берег оз. Казеной-ам 42°46'43.2" 46°9'21.5" ON622684
55 Cr-4-1 Республика Дагестан, Унцукульский р-н, окр. с. Аракани 42°36'53.5" 47°3'25.3" ON622685
56 Cr-5-1 Республика Дагестан, Хунзахский р-н, окр. с. Ахалчи 42035'8Л" 46°387.3" -
Delphinium elisabethae N. Busch
57 El-1-1 El-1-2 Республика Карачаево-Черкессия, Зеленчукский р-н, долина р. Маруха, сосновый лес (гербарий БЕ) 43°44'49.7" 41°3845.3" ON622686
Delphinium fedorovii Dimitrova
58 Fd-1-1 Республика Дагестан, Тляратинский р-н, Заповедник Тляратинский 41°58'11.9" 46°30'32.8" ON622687
59 Fd-2-1 Республика Дагестан, Тляратинский р-н, восточный склон ущелья р. Махчалор 41°5б44.7" 46°ЗГ25.2" ON622688
Delphinium flexuosum M. Bieb.
60 Fl-1-1 Республика Дагестан, Докузпаринский р-н, м/у с. Текипиркент и Куруш 41°19'50" 47°52'10.9" ON622689
61 Fl-2-1 Республика Дагестан, Ботлихский р-н, оз. Казеной-ам 42°46'51.7" 46°9'21.5" ON622690
62 Fl-3-1 Республика Дагестан, Хасавюртовский р-н, окр. с. Сиух 42°35'33.7" 46°33'17.5" -
63 Fl-4-1 Республика Дагестан, Унцукульский р-н, окр. с. Аракани 42°37'5.8" 47°4'44.5" -
Delphinium freynii Conrath
64 Fr-1-1 Республика Дагестан, Буйнакский р-н, по дороге к тоннелю на опушке леса 42°47'25.4" 46059'15Л" ON622691
65 Fr-2-1 Республика Дагестан, Кизилюртовский (Казбековский) р-н, окр. п. Дубки 43°Г22.3" 46°50'54.4" ON622692
66 Fr-3-1 Республика Дагестан, Казбековский р-н, окр. п. Пионерный 43°2'24.9" 46°5Г34.7" ON622693
Delphinium gelmetzicum Dimitrova
67 Gl-1-1 Республика Дагестан, Рутульский р-н, окр. с. Джиных, на берегу р. Самур 41°404.2" 47°3'5.2" ON622694
68 Gl-2-1 Республика Дагестан, Ахтынский р-н, окр. с. Хнов, ущ. Джавган-Дере 47°27'9.9" 47°28'37.7" ON622695
Delphinium macropogon Prokh.
69 Mc-1-1 Республика Дагестан, окр. г. Махачкала, на запад по трассе 42°56'14.4" 47°22'4.9" ON622697
№ ID* Географическое расположение Координаты Код доступа вепБапк
Северная широта Восточная долгота
Delphinium mariae N. Busch
70 Mr-1-1 Республика Дагестан, Акушинский р-н, окр. с. Гумрамахи, на берегу р. Акуша 42°14Т4.2" 47°20Т8.3" ON622696
Delphinium puniceum Pall.
71 Pn-1-1 Ростовская обл., Морозовский р-н, окр. х. Грузинов 48°27'36.7" 41°42'48.6" МТ137559
72 Pn-2-1 Республика Калмыкия, Малодербетовский р-н, окр. с. Плодовитое 47°35'34" 44°23'57.3" МТ137556
73 Pn-3-1 Астраханская обл., Ахтубинский р-н, юго-восточный склон г. Б. Богдо 48°8'25.9" 46°51'29.5" МТ137557
74 Pn-4-1 Волгоградская обл., Палласовский р-н, окр. оз. Эльтон 49°12'53.3" 46°41'51.6" МТ137558
75 Pn-5-1 Pn-5-2 Волгоградская обл., Дубовский р-н, окр. х. Полунино 49°38'51.5" 44°55Т9.8" МТ137560 МТ137561
Delphinium samurense Murtazaliev et Luferov
76 Sm-1-1 Sm-1-2 Республика Дагестан, Рутульский р-н, окр. с. Джиных 41°40'34" 47°2Т8.6" ON622699 ON622698
Delphinium sergii Wissjul.
77 Sg-1-1 Воронежская обл., Калачеевский р-н, окр. х. Рассоховатое 50°25'51.4" 40°31'47.4" ON622700
Delphinium speciosum M. Bieb.
78 Sp-2-1 Республика Дагестан, Курахский р-он, окр. с. Хвередж 41°41'54.1" 47.630222 ON6227Q2
Delphinium speciosum var. ironorum (M. Bieb.) N. Busch
79 Sp-1-1 Республика Карачаево-Черкессия, угц. Средняя Эрмани (гербарий ЬЕ, собр. и опр. Е. и Н. Буш) 43°29'29.1" 41°5'35.5" ON622701
Примеч.: * - первая цифра после буквенного индекса соответствует номеру популяции, вторая - номеру особи. Прочерк в ячейке означает отсутствие данных.
н
я о о я о и
О р
р Ё
м s О я
З4
з'Р 5' я 3 Ö : "d
Рис. 1. Географическое расположение исследованных популяций Delphinium. Условные обозначения см. табл. 1.
Рис. 2. Схема расстановки 30(а), 66(b) и 84(c) меток-ландмарок на листовой пластинке растения из рода Delphinium.
Ординация точек, отвечающих формам листовых пластинок Delphinium, была выполнена посредством канонического дискриминантного анализа (CVA). Кроме того, в векторном графическом редакторе были собраны схемы, дающие представления о трансформации формы листовых пластинок при изменении значений той или иной оси. Использовались каркасные изображения, полученные в программе «MorphoJ». Также по значениям дистанций расстояния Махала-нобиса, был проведён кластерный анализ с использованием метода невзвешенного попарного
среднего (UPGMA). Число бутстреп-перестано-вок при этом составило 10000.
Был проведён регрессионный анализ с целью выяснения зависимости формы от размера листовой пластинки. Последнее необходимо для достоверного установления наличия алломе-трии (Klingenberg, 2022). В качестве зависимой переменной (отклика) в данном случае были использованы Прокрустовы координаты, а в качестве независимой (предиктора) - логарифм размера центроида, предварительно высчитанного.
Для выявления возможного влияния флуктуирующей и направленной асимметрии листовой пластинки на вариацию формы использовали Прокрустов дисперсионный анализ (Procrustes ANOVA). Все расчёты и визуализация результатов были выполнены с помощью программных пакетов «Past 4.03» (Hammer, 2001) и «MorphoJ 1.07» (Klingenberg, 2011).
Молекулярно-генетический анализ. ДНК выделяли из листьев или листочков околоцветника, высушенных в силикагеле, с использованием набора «NucleoSpin® Plant II» (MACH-EREY-NAGEL, Germany) согласно протоколу производителя.
Ранее для анализа выборки из образцов девяти видов, произрастающих на юго-востоке Европейской России (без Северного Кавказа), использовали полный межгенный транскрибируемый спейсер (ITS1-5.8S-ITS2) рибосомаль-ной ДНК (Kashin et al., 2021). В работе с кавказскими видами возникли трудности со спейсером ITS1, поскольку эта область не амплифицирова-лась ни одним из возможных праймеров (ITS-1, ITS-5, (White et al., 1990); ITS-A, ITS-SF (Blattner, 1999); NNC-18S10 (Wen, Zimmer 1996); ITS-FD (Balthazar et al., 2000). По-видимому, у этих видов (кроме D. caucasicum, D. macropogon Prokh. и D. mariae, у которых весь регион ITS1-5.8S-ITS2 воспроизводился нормально) ITS1 содержит протяженную делецию, которая препятствует отжигу праймера. Поэтому для работы с этими видами использовали только область ITS2, которую амплифицировали при помощи праймеров ITS-3 и ITS-4 (White et al., 1990).
Секвенирование десяти некодирующих и потенциально высоко вариабельных регионов хлДНК (cpDNA): ndhC-trnV, ndhF, petA-psbJ, psbE-petL, trnT-psbD (Dong et al., 2012), trnC-petN (Lee, Wen, 2004) и trnL-trnF, trnH-psbA, trnS-trnG, matK (Jabbour et al., 2012) оказалось неинформативным (перечисленные регионы содержали единичные замены либо были полностью идентичны). Поэтому филогенетический анализ проводили только по ITS2.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в объеме 50 ц1. Реакционная смесь содержала 10 ц1 готовой реакционной смеси MaGMix (по 200 ^M каждого dNTP, 1,5 mM MgCl2, 1,5 ед. SmarTaqDNA-полимеразы и буфер; Dialat Ltd., Москва, Россия), 35 ц1 деионизированной воды, 3,4 pmol каждого праймера и 5 ц1 исходной ДНК. ПЦР проводили в амплификаторе Mastercycler gradient (Eppendorf, Germany) по следующему
алгоритму: изначальная денатурация в течение 5 мин при 95 °C, затем 35 циклов по 30 сек при 95 °C, 30 сек при 55 °C и 2 мин при 72 °C, с финальной элонгацией в течение 10 мин при 72 °C. Продукты ПЦР были очищены на агарозном геле и элюированы при помощи NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up kit (MACHEREY-NAGEL, Germany).
Секвенирование проводили на секвенаторе «ABI PRISM 3130 XL» с использованием набора реактивов «BIG DYE TERMINATOR kit ver. 3.1» согласно протоколу производителя на базе компании «Синтол» (Москва, Россия).
Прямые и обратные последовательности редактировали и выравнивали вручную в программе «BioEdit 7.0.5.3» (Hall, 1999). Полученные последовательности ДНК депонированы в базе данных «GenBank» (табл. 1). В анализ также были включены последовательности нескольких образцов Aconitum L. и Consolida (DC.) S. F. Gray, импортированные из GenBank, в качестве внешних групп.
Полученную матрицу анализировали методом Байеса с использованием «MrBayes 3.1.23» (Ronquist, Huelsenbeck, 2003). Модель эволюции последовательностей оценивали с помощью информационного критерия Акаике (AIC) с использованием «jModeltest 3.7» (Darriba et al., 2012). Два независимых цикла с четырьмя марковскими цепями были проведены в течение 10 миллионов поколений с отбором каждых 100 деревьев. «Выгоревших деревьев» не оказалось, поэтому все деревья были объединены в один набор данных и получено дерево консенсуса по правилу большинства. Байесовские апостериорные вероятности были рассчитаны для этого дерева в «MrBayes 3.1.23».
Результаты исследований
Исследование методами геометрической морфометрии. Анализ проводили отдельно для каждого из двух подродов (в понимании Н. И. Малютина (Malyutin, 1987)).
Подрод Delphinastrum (DC.) Peterm. В результате процедур предварительной обработки в программе «MorphoJ» были получены схемы каркасы, дающие представление о средней форме листовых пластинок в видовых выборках секции Delphinastrum при расстановке 30 меток-ландмарок (рис. 3a). Видно, что средние формы по таксонам в большинстве случаев заметно отличаются - как между собой, так и от каркаса
средней формы по генеральной совокупности. В целом, различия в форме листовых пластинок связаны с длинами центрального сегмента средней лопасти и нерасчленённой части листовой пластинки, положением краевых точек верхних и нижних лопастей, а также характером основа-
ния листовой пластинки и расстоянием между нижними лопастями. Средние каркасные формы таксонов близки к средней форме по всей выборке у Б. зиЬсипеаШт и в несколько меньшей степени - у Б. duhmЬergii и Б. йШуосагрыт.
Рис. 3. Результаты анализа методами геометрической морфометрии подрода Бе1рЫпа$^ит при расстановке 30 меток-ландмарок: а - средние формы листовых пластинок видов подрода. Красным цветом показан каркас средней формы конкретного вида, серым - каркас средней формы по генеральной совокупности; Ь - орди-нация точек, соответствующих формам листовых пластинок особей видов подрода, методом канонического дискриминантного анализа. По краям осей показаны экстремальные формы листовых пластинок, соответствующие конечным числовым значениям осей; с - изменение каркасов формы листовых пластинок видов подрода согласно значениям на осях канонических переменных; й - дендрограмма на основании дистанций расстояния Махаланобиса для видов подрода Бе1рЫпа$^ит.
При ординации точек, соответствующих образцам таксонов подрода Бе1рЫпа$^ит, в пространстве первых двух канонических переменных, объясняющих 78 % дисперсии, наблюдалось их следующее распределение (рис. 3Ь). Преимущественно в правой части области ординации расположилось единое облако рассеяния, образованное образцами таксонов Б. duhmЬergii,
Б. \itwinowii, Б. риЬфогит. В этом общем облаке в большей степени обособлены точки рассеяния, соответствующие образцам Б. риЬфогит. Листовые пластинки этих трёх таксонов в большинстве своём отличаются относительно широкими сегментами, средней (по отношению к другим таксонам) длиной нерасчленённой части и большим расстоянием между нижними
лопастями, клиновидным, вытянутым в черешок основанием. В понимании Н. Н. Цвелё-ва (Tzvelev, 2001), два из них - D. duhmbergii и D. litwinowii - относятся к D. aggr. cuneatum, а третий (D. pubiflorum) - к D. aggr. dictyocarpum. Ранее по результатам таргетного секвенирова-ния региона ITS показано хорошее разделение между двумя этими видами-агрегатами, в то время как D. duhmbergii и D. litwinowii не разделились и интерпретированы как синонимы с приоритетным названием D. cuneatum (Kashin et al., 2021). Однако результаты изучения формы листовых пластинок методами геометрической морфометрии недостаточно полно разделили между собой и представителей разных видов-агрегатов.
К описываемому облаку в левой части пространства ординации примешиваются точки рассеяния, соответствующие образцам других групповых выборок. В частности, довольно значительно присутствие точек, отвечающих образцам D. subcuneatum и D. dictyocarpum. Это соответствует тому, что D. duhmbergii, D. litwinowii, D. subcuneatum объединяются Н. Н. Цвелёвым в D. aggr. cuneatum, а D. pubiflorum и D. dictyocarpum - в D. aggr. dictyocarpum. Для формы листовой пластинки D. dictyocarpum характерны: относительно широкое расстояние между нижними лопастями при средней ширине сегментов в целом, небольшая нерасчленённая часть, клиновидное или слабо клиновидное основание. Для листовых пластинок D. subcuneatum характерны средние по ширине сегменты и нерасчле-нённая часть, небольшой центральный сегмент средней лопасти, относительно широкое расстояние между нижними лопастями и слабо клиновидное основание.
Фактически за пределами общего облака рассеяния точек, соответствующих образцам D. duhmbergii, D. litwinowii, D. pubiflorum, оказались только облака рассеяния точек, соответствующих образцам D. elatum и D. uralense, между собой также хорошо разделившиеся. Согласно положению точек, для листовых пластинок D. uralense характерны: относительно узкие сегменты, небольшая нерасчленённая часть, удлинённый центральный сегмент средней лопасти, небольшое расстояние между нижними лопастями, обрубленное или слабо клиновидное основание. Для листовых пластинок D. elatum характерны относительно широкие сегменты, значительная нерасчленённая часть, небольшой центральный сегмент средней лопасти и неши-
рокое расстояние между нижними лопастями, а также - обрубленное или слабо клиновидное основание.
В целом распределение точек рассеяния хорошо иллюстрирует высокий полиморфизм форм в популяциях исследованных таксонов. Разделились фактически только D. elatum и D. uralense. В меньшей степени разделились D. subcuneatum и D. dictyocarpum, частично перекрываясь облаками рассеяния своих точек с остальными исследованными таксонами подрода.
Закономерность изменения формы листовых пластинок таксонов подрода Delphinastrum в пределах осей, образованных двумя первыми каноническими переменными, состоит в следующем. Изменение формы вдоль первой канонической переменной от нулевой точки, отвечающей средней форме генеральной совокупности, направо сопряжено с сужением сегментов листовой пластинки, увеличением длины центрального сегмента средней лопасти, вытягиванием основания листовой пластинки в черешок и образованием «клина», увеличением расстояния между нижними лопастями. От нулевой точки налево происходят обратные процессы: увеличение ширины сегментов, уменьшение длины центрального сегмента средней лопасти, образование обрубленного основания, уменьшение расстояния между нижними лопастями (рис. 3c).
По второй канонической переменной от средней формы вверх происходит сужение сегментов листовой пластинки, увеличение длины центрального сегмента средней лопасти, образование обрубленного основания листовой пластинки, уменьшение расстояния между нижними лопастями. От исходной средней формы вниз происходят обратные процессы: увеличение ширины сегментов, уменьшение длины центрального сегмента средней лопасти, образование клиновидного основания, увеличение расстояния между нижними лопастями (рис. 3c).
Построенная на основании дистанций расстояния Махаланобиса дендрограмма (рис. 3d) показывает, что наиболее обособлен D. elatum, образующий отдельный кластер. Остальные таксоны образуют второй кластер, в свою очередь разбивающийся на отдельные подкласте-ры первого порядка. Один из них образован D. uralense, а другой объединяет оставшиеся пять таксонов, в котором D. subcuneatum выносится отдельной ветвью, в то время как остальные четыре объединяются.
Проведённый регрессионный анализ показал достаточно слабую зависимость формы листовой пластинки от логарифма размера центроида, выступающего в данном случае размерным показателем. Перестановочный (permutation) тест опроверг нулевую гипотезу об отсутствии зависимости формы от размера при достоверном уровне значимости (p = 0,409). Однако полученный уровень значимости имеет пограничное значение, близкое к допустимому. Поэтому обоснованно полагать, что имеет место крайне слабая аллометрическая зависимость формы от
Результаты Прокрустова дисперсионного ;
размеров листовой пластинки и размерный компонент вносит достаточно малый вклад в изменчивость формы листовых пластинок таксонов подрода Delphinastrum.
Прокрустов дисперсионный анализ показал слабое влияние флуктуирующей асимметрии (сумма квадратов (88) = 1,542) на форму и отсутствие влияния направленной асимметрии (88 = 0,011) на таковую. При этом указанные значения в обоих случаях намного меньше, чем у влияния различий между образцами (8 = 6,896) (табл. 2).
Таблица 2
ализа для таксонов подрода Delphinastrum
SS MS df F P (param.)
Individual 6,896 0,000 7280 4,47 < 0,0001
Side 0,011 0,000 28 1,90 0,0030
Ind * Side 1,542 0,000 7280
Примеч.: individual - вариация между образцами; side - направленная асимметрия; Ind * Side - флуктуирующая асимметрия; SS - сумма квадратов; MS - средняя сумма квадратов; df - число степеней свободы; F - критерий Фишера; P (param.) - уровень значимости.
Подрод Oligophyllon Dimitrova. В результате процедур предварительной обработки в программе «MorphoJ» были получены схемы каркасы, дающие представление о средней форме листовых пластинок в групповых выборках подрода Oligophyllon при расстановке 30 меток-ландмарок (рис. 4a). Средние формы по таксонам в большинстве случаев заметно отличаются как между собой, так и от каркаса средней формы по общей совокупности. Различия формы листовых пластинок связаны с теми же параметрами, что и у таксонов подрода Delphinastrum. При этом средние каркасные формы лишь у трёх таксонов (D. crispulum, D. flexuosum, D. mariae) близки средней форме по всей выборке.
При ординации точек, соответствующих образцам таксонов подрода Olygophyllon, в пространстве первых двух канонических переменных, объясняющих 69 % дисперсии, наблюдалось их следующее распределение (рис. 4b). В правой части пространства ординации с двух сторон от оси 2 расположилось хорошо отделившееся от остальных облако рассеяния точек, соответствующих образцам D. freynii, D. puniceum, D. sergii. Листовые пластинки данного конгломерата характеризуются узкой шириной сегментов, сильным, вплоть до жилок рассечением, длинным центральным сегментом средней лопасти, различным расстоянием между нижними лопастями - от среднего до совсем незначительного, обрубленным основанием. Интересно, что ареалы
этих трёх таксонов пространственно разделены. Растения D. puniceum произрастают в крайне ксерофитных условиях Нижнего Поволжья и Калмыкии, D. sergii - в более мезофитных условиях Воронежской обл., D. freynii - также в более мезофитных условиях горного Дагестана.
В верхней части области ординации с обеих сторон от оси 1 расположилось хорошо отделившееся от остальных облако рассеяния точек, соответствующих образцам D. caucasicum. Для листовых пластинок этого таксона характерны небольшой центральный сегмент средней лопасти, небольшое расстояние между нижними лопастями листовой пластинки, небольшая длина нерасчленённой части, обрубленное или слабо клиновидное основание.
В центральной части области ординации расположилось облако рассеяния, образованное точками, соответствующими образцам пяти таксонов - D. arcuatum, D. bracteosum, D. crispu-lum, D. flexuosum, D. mariae. Точки D. arcuatum, D. bracteosum, D. crispulum, D. flexuosum располагаются несколько левее от центра области ор-динации, а точки, соответствующие листовым пластинкам D. mariae, находятся ближе к центру области ординации. От остальных таксонов данного облака D. mariae отличают несколько более узкие сегменты и более широкое расстояние между нижними лопастями. Наиболее близко к точкам D. mariae располагаются точки D. crispu-lum.
Рис. 4. Результаты анализа методами геометрической морфометрии подрода Oligophyllon при расстановке 30 меток-ландмарок: а - средние формы листовых пластинок видов подрода. Красным цветом показан каркас средней формы конкретного вида, серым - каркас средней формы по генеральной совокупности; Ь - орди-нация точек, соответствующих формам листовых пластинок особей видов подрода, методом канонического дискриминантного анализа. По краям осей показаны экстремальные формы листовых пластинок, соответствующие конечным числовым значениям осей; с - изменение каркасов формы листовых пластинок видов подрода согласно значениям на осях канонических переменных; й - дендрограмма на основании дистанций расстояния Махаланобиса для видов подрода Oligophyllon.
Ниже описанного облака, частично перекры-ваясь с ним, расположилось облако рассеяния точек, соответствующих образцам ещё двух таксонов D. /е^юуи и D. gelmetzicum. Их листовые пластинки характеризуются относительно узкими сегментами, значительным рассечением, длинным центральным сегментом средней лопасти и небольшим расстоянием между нижними лопастями, обрубленным или слабо клиновидным основанием.
Изменение формы вдоль первой канонической переменной от нулевой точки, отвечающей средней форме генеральной совокупности, направо сопряжено с сужением сегментов листо-
вой пластинки, увеличением длины центрального сегмента средней лопасти, уменьшением длины нерасчленённой части, некоторым увеличением расстояния между нижними лопастями. От нулевой точки налево происходят обратные процессы: увеличение ширины сегментов, уменьшение длины центрального сегмента средней лопасти, увеличение длины нерасчленённой части, уменьшение длины между нижними лопастями. По второй канонической переменной от средней формы вверх происходит увеличение ширины сегментов, уменьшение длины центрального сегмента средней лопасти, увеличение длины нерасчленённой части, сокращение
расстояния между нижними лопастями листовой пластинки. От средней формы вниз происходит сужение сегментов листовой пластинки, увеличение длины центрального сегмента средней лопасти, уменьшение длины нерасчленён-ной части, некоторое увеличение расстояния между нижними лопастями (рис. 4с).
Построенная на основании дистанций расстояния Махаланобиса дендрограмма (рис. 4^ распадается на два кластера. Первый (левый) кластер объединяет D. freynii, D. puniceum и D. sergii; второй (правый) - оставшиеся виды. При этом второй кластер с достаточно высокой бутстреп поддержкой распадается на подкласте-ры первого порядка, из которых один - представлен D. caucasicum, а второй - объединяет семь оставшихся таксонов. Он, в свою очередь, распадается на два подкластера второго порядка, один из которых объединяет D. fedorovii и D. gelmetzicum, а второй - D. arcuatum, D. Ьш^ teosum, D. crispulum, D. flexuosum, D. mariae. При этом последний из указанных видов отделяется от D. arcuatum, D. bracteosum, D. crispulum, D. fle-xuosum.
Проведённый регрессионный анализ, так же как в отношении таксонов подрода Delphinastrum, показал достоверную зависимость формы листовой пластинки от логарифма размера центроида, выступающего в данном случае размерным показателем. Перестановочный (permutation) тест опроверг нулевую гипотезу об отсутствии зависимости формы от размера при высоком уровне значимости (p < 0,0001). Следовательно, имеет место алломе-трическая зависимость формы от размеров листовой пластинки. Однако, так же как у таксонов подрода Delphinastrum, размерный компонент вносит достаточно малый вклад в изменчивость формы листовых пластинок видов подрода.
Прокрустов дисперсионный анализ показал слабое влияние флуктуирующей асимметрии (сумма квадратов (SS) = 3,183) на форму и отсутствие влияния направленной асимметрии (SS = 0,008) на таковую. При этом указанные значения в обоих случаях намного меньше, чем у влияния различий между образцами (SS = 12,949) (табл. 3).
Таблица 3
Результаты Прокрустова дисперсионного анализа для таксонов подрода Oligophyllon
SS MS df F P (param.)
Individual 12,949 0,001 11284 4,07 < 0,0001
Side 0,008 0,000 28 1,06 0,3771
Ind * Side 3,183 0,000 11284
Примеч.: individual - вариация между образцами; side - направленная асимметрия; Ind * Side - флуктуирующая асимметрия; SS - сумма квадратов; MS - средняя сумма квадратов; df - число степеней свободы; F - критерий Фишера; P (param.) - уровень значимости.
Полиморфизм нуклеотидных последовательностей региона ITS2. На филогенетическом дереве, построенном в результате анализа гапло-типов межгенного транскрибируемого спейсера ITS2 методом Байеса, все образцы Delphinium подразделились на два кластера (рис. 5).
Первый из них распался на два подкластера первого порядка и одну отдельную ветвь, образованную образцом D. macropogon. Один под-кластер первого порядка объединяет образцы неразделившихся D. freynii и D. sergii. Второй подкластер первого порядка разделяется на два подкластера второго порядка, один из которых объединяет все образцы D. puniceum, второй -образцы D. samurense Murtazaliev et Luferov.
Второй кластер распался на два подкластера первого порядка и две отдельные ветви. Первый подкластер распадался на три подкластера вто-
рого порядка: 1) образцы D. arcuatum; 2) образцы D. caucasicum; 3) образцы неразделившихся остальных D. bracteosum, D. crispulum, D. elisa-bethae N. Busch, D. fedorovii, D. flexuosum, D. gel-metzicum и D. speciosum M. Bieb. Второй подкла-стер первого порядка распался на шесть клад: 1) D. cuneatum + D. subcuneatum + D. duhmbergii + D. litwinovii + образцы из первой, второй и третьей популяций D. elatum, произрастающих на западной границе ареала; 2) большинство образцов D. uralense; 3) D. dictyocarpum + один образец из третьей популяции D. pubiflorum; 4) уральские популяции D. elatum; 5) остальные образцы D. pubiflorum; 6) образцы второй популяций D. uralense. Отдельные ветви образовали образцы D. mariae и один образец из первой популяции D. bracteosum.
1Ж —O.Q
-^ОТ
- С 7 1 С 7 2 С"7"3 -Ell L U 2 Dm f 3 Е ГГ С 2 1 С 5 1 С 5 2
■ С_5_3 С 3 1 С"1 1
■ С~Г2
......... С 1 3
......... С 4 1
..........с е 1
..........Dru 1 1
......... Dm 1 2
......... Е ГГ
..........Е 2 2
.......... Е 2 3
......... Е 3 1
Е 3 2
......... Е"3"3
---- Е~1"2
-----------L 1<Т 1
----------L 10 2
----------L 10 3
----------L 12 1
— L 12 3 L в 1 L 6 2 L_8 3 L 1T 1 L 11-2 L 1ГЗ L~1 1 L 1 2 L 1 3 L 9 1 18! L S 3 L 5 1 L 5 2 L '5 3
s~n
ET3 U 2 1 LP 3 1
U 3 3 LT1~1 Ü 3 2 С 6 1 С 6 2 С 6 3 De Ä 1
b
Рис. 5. Филогенетическое дерево, построенное методом Байеса для региона ITS2 ядерной ДНК 24 исследуемых таксонов Delphinium. Условные обозначения см. табл. 1. Внешние группы: * - Consolida armeniaca (JF331883) + C. olopetala (JF331895); ** - Aconitum kusnezoffii (KR082763). Масштаб: 0,02 (expected changes per site).
a
Обсуждение
По результатам изучения форм листовой пластинки таксонов подрода Delphinastrum методом канонического анализа при расстановке 30 ме-ток-ландмарок относительно хорошо разделились только D. elatum и D. uralense, в то время как D. litwinowii, D. pubiflorum, D. duhmbergii, D. sub-cuneatum фактически не разделились. В пределах подрода Oligophyllon этим методом хорошо отделился D. caucasicum. Разделились также облака рассеяния точек D. freynii + D. puniceum + D. sergii с одной стороны и D. fedorovii + D. gelmetzicum -с другой. Delphinium arcuatum, D. bracteosum, D. crispulum, D. flexuosum, D. mariae между собой не разделились, образовав одно общее облако рассеяния точек в центральной части области ординации.
Как уже говорилось, увеличение числа меток-ландмарок до 66 (рис. 6) или 84 (не показано) принципиально не изменили результатов анализа, что, на наш взгляд, указывает на высокое соответствие выявленного характера разделения исследуемых таксонов объективной картине изменчивости морфологии листовой пластинки у исследованных таксонов.
Интересно, что при анализе таксонов подрода Oligophyllon в случае исключения из него
образцов наиболее полиморфных D. crispulum и D. flexuosum разделение остальных таксонов Северного Кавказа становится более внятным (рис. 7). В этом случае кроме D. caucasicum хорошо отделяется D. mariae. Кроме того, относительно хорошо разделяются D. bracteosum и D. arcuatum, однако абсолютно не разделяются между собой D. fedorovii и D. gelmetzicum.
С использованием геометрической морфоме-трии показано, что различия в форме листовых пластинок таксонов подродов Delphinastrum и Oligophyllon в основном связаны с шириной сегментов, длинами центрального сегмента средней лопасти и нерасчленённой части листовой пластинки, степенью её рассечения, формой основания, обрубленной или клиновидной, расстоянием между нижними лопастями.
Проведённый анализ изменчивости форм листовых пластинок у исследованных таксонов свидетельствует о том, что этот признак потенциально может быть использован для разделения таксонов рода Delphinium Европейской России. Однако сложность формы листовой пластинки, характерная для Delphinium, делает фактически невозможным универсальный алгоритм расстановки ландмарок для листовых пластинок всех таксонов. Разделение таксонов методами геометрической морфометрии услож-
няется ещё и тем, что параметры листовой пластинки таксонов существенно зависят от по-годно-климатических условий. В связи с этим широко варьируют, зачастую перекрываясь друг с другом. Высокая вероятность гибридизации между рядом видовых таксонов создают дополнительную сложность для разделения их методами геометрической морфометрии. Так, приведённые результаты указывают на сложный характер филогенетических отношений целого ряда кавказских видов рода, а также таксонов Б. aggr. йШуосатрыт и Б. aggr. сынваШт.
Характер обособления групповых видовых выборок в пространстве канонических переменных и относительная их близость друг к другу может быть связана с экологическим или
географическим сходством мест произрастания популяций изученных таксонов. Подобная зависимость была показана ранее (Kashin et al., 2021).
В результате анализа гаплотипов межгенного транскрибируемого спейсера ITS2 методом Байеса образцы всех исследованных таксонов распределились по 14 группам. При этом расположение и сгруппированность гаплотипов таксонов, занимающих ареалы на юго-востоке Европейской России, на филогенетическом дереве, построенном в результате анализа ITS2 методом Байеса, в основном соответствует распределению гаплотипов этих же таксонов, полученных при секвенировании полного региона ITS (Kash-in et al., 2021).
Рис. 6. Результаты анализа методами геометрической морфометрии подрода Ов1ркта$^ыт при расстановке 66 меток-ландмарок: а - средние формы листовых пластинок видов подрода. Красным цветом показан каркас средней формы конкретного вида, серым - каркас средней формы по генеральной совокупности; Ь - орди-нация точек, соответствующих формам листовых пластинок особей видов подрода, методом канонического дискриминантного анализа. По краям осей показаны экстремальные формы листовых пластинок, соответствующие конечным числовым значениям осей; с - изменение каркасов формы листовых пластинок видов подрода согласно значениям на осях канонических переменных; й - дендрограмма на основании дистанций расстояния Махаланобиса для видов подрода Ов1ркта$^ыт.
Рис. 7. Ординация точек, соответствующих формам листовых пластинок особей видов подрода Oligophyllon, методом канонического дискриминантного анализа с использованием 66 меток-ландмарок при исключении из анализа образцов Delphinium crispulum и D. flexuosum.
Топология внешних групп соответствует филограммам, полученным другими авторами (Jabbour, Renner, 2012).
Исходя из полученных результатов анализа гаплотипов межгенного транскрибируемого спейсера ITS2, не вызывает сомнений видовая самостоятельность D. puniceum, D. macropogon, D. mariae и D. samurense. Поддерживается синонимичность D. freynii и D. sergii; в настоящее время оба эти таксона приняты в качестве синонимов D. schmalhausenii, согласно «World Checklist of Vascular Plants» (WCVP, 2023). Достаточно обособленными являются образцы D. pubiflorum. Объединение одного образца, идентифицированного по морфологическим ключам как D. pubiflorum, в подкластер с образцами D. dictyocarpum может свидетельствовать о гибридизации между этими таксонами. Delphinium cuneatum, D. subcuneatum, D. duhmbergii и D. lit-
winowii следует считать синонимами с приоритетным названием D. cuneatum. Delphinium dictyocarpum, D. elatum и D. uralense, по-видимому, легко гибридизируют с D. cuneatum в симпатри-ческих популяциях в зонах перекрывания ареалов, что существенно усложняет разделение этих таксонов. Они не формируют самостоятельных кластеров, а отдельные образцы попадают в неразрешённую часть дерева. Delphinium arcuatum, D. bracteosum, D. caucasicum, D. crispulum, D. elisabethae, D. fedorovii, D. flexuosum, D. gelmetzicum и D. speciosum плохо разделяются по результатам секвенирования. С одной стороны, это может быть следствием гибридизации этих таксонов, с другой - недостаточным разрешением анализируемого региона ДНК. В целом результаты анализа гаплотипов соответствуют разделению исследованных таксонов методами геометрической морфометрии. Исключение со-
ставляет только D. mariae, который при анализе гаплотипов хорошо отделился от других видов, в то время как методами геометрической морфо-метрии не отделился от наиболее полиморфных D. crispulum и D. flexuosum.
Заключение
Из результатов проведённого молекулярно-генетического анализа и анализа методом геометрической морфометрии следует, что среди исследованных таксонов рода Delphinium юго-востока Европейской России в подроде Delphinastrum статусу видового ранга соответствует D. pubiflorum. Синонимичными являются D. cuneatum, D. subcuneatum, D. duhmbergii и D. litwinowii с приоритетным названием D. cu-neatum. Таксономический статус D. dictyocar-pum, D. elatum и D. uralense требует дальнейшего уточнения. По-видимому, они легко гибридизи-руют с D. cuneatum в симпатрических популяциях в зонах перекрывания ареалов, что существенно усложняет разделение этих таксонов. Полученные результаты полностью соответствуют результатам таргетного секвенирования более обширного района ITS1-5.8S-ITS2 ядерной ДНК и нумерического морфологического анализа (Kashin et al., 2021).
Из исследованных таксонов подрода Oli-gophyllon статусу видового ранга соответствуют D. puniceum, D. mariae, D. macropogon, D. flexuosum, D. caucasicum, D. arcuatum и D. samurense. Являются синонимичными D. freynii и D. ser-gii с приоритетным названием D. schmalhause-nii. Это соответствует их статусу, указанному в «World Checklist of Vascular Plants» (WCVP, 2023). По результатам исследования D. bracteosum, D. crispulum, D. elisabethae, D. fedorovii, D. gelmetzi-cum и D. speciosum не разделились ни одним из использованных методов и, вероятно, являются синонимичными с приоритетным названием D. crispulum. Не исключено, что их неразделён-ность по результатам секвенирования района ITS2 связана с недостаточным разрешением изученного региона ДНК, либо с гибридизацион-ными процессами, в частности с вовлечением в них D. crispulum и D. flexuosum.
Благодарности
Исследование было профинансировано Российским фондом фундаментальных исследований (РФФИ) (№ 16-04-00142 и № 20-34-90001).
Благодарим профессора Н. И. Фёдорова за помощь при сборе образцов видов Delphinium из Республики Башкортостан.
REFERENCES / ЛИТЕРАТУРА
Blattner F. R. 1999. Direct amplification of the entire ITS region from poorly preserved plant material using recombinant PCR. Biotechniques 27(6): 1180-1186. DOI: 10.2144/99276st04
Chen Y., Jabbour F., Novikov A., Wang W., Gerber S. 2018. A study of floral shape variation in Delphinieae (Ranunculaceae) using geometric morphometrics on herbarium specimens. Bot. Lett. 165(3-4): 368-376. DOI: 10.1080/23818107.2018.1427145
ChitwoodD. H., Otoni W. C. 2017. Morphometric analysis of Passiflora leaves: the relationship between landmarks of the vasculature and elliptical Fourier descriptors of the blade. GigaScience 6(1): 1-13. DOI: 10.1093/gigascience/ giw008
Conesa M. A., Mus M., Rosello J. A. 2012. Leaf shape variation and taxonomic boundaries in two sympatric ru-picolous species of Helichrysum (Asteraceae: Gnaphalieae), assessed by linear measurements and geometric morphometry. Biol. J. Linn. Soc. 106(3): 498-513. DOI: 10.1111/j.1095-8312.2012.01889.x
Darriba D., Taboada G., Doallo R., Posada D. 2012. jModelTest 2: more models, new heuristics and parallel computing. Nat. Methods 9: 772. DOI: 10.1038/nmeth.2109
Ebel A. L. 2006. New taxa of Delphinium (Ranunculaceae) from the Altai. Sist. Zametki Mater. Gerb. Krylova Tomsk. Gosud. Univ. [Systematic notes on the materials of P. N. Krylov Herbarium of Tomsk State University] 96: 14-21. [In Russian] (Эбель А. Л. Новые таксоны рода Delphinium (Ranunculaceae) с Алтая // Сист. зам. Герб. Томск. ун-та, 2006. T. 96. С. 14-21).
Ebel A. L. 2007. A new species of Delphinium L. (Ranunculaceae) from South Siberia. Sist. Zametki Mater. Gerb. Krylova Tomsk. Gosud. Univ. [Systematic notes on the materials of P. N. Krylov Herbarium of Tomsk State University] 98: 13-16. [In Russian] (Эбель А. Л. Новый вид рода Delphinium L. (Ranunculaceae) из Южной Сибири // Сист. зам. Герб. Томск. ун-та, 2007. T. 98. С. 13-16).
Fedorov N. I. 2003. Rod Delphinium L. na Yuzhnom Urale: ekologiya, populyatsionnaya struktura i biokhimicheskiye osobennosti [The genus Delphinium L. in the Southern Urals: ecology, population structure and biochemical characteristics]. Ufa: Gilem Publ. 149 pp. [In Russian] (Фёдоров Н. И. Род Delphinium L. на Южном Урале: экология, популя-ционная структура и биохимические особенности. Уфа: Гилем, 2003. 149 с.).
Grant V. 1981. Plant speciation. New York: Columbia Univ. Press. 563 pp.
Hall T. A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp. Ser. 41: 95-98. DOI: 10.14601/Phytopathol_Mediterr-14998u1.29
Hammer 0., Harper D. A. T., Ryan P. D. 2001. PAST: Paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontol. Electron. 4(1): 1-9.
Hodac L., Barke B. H., Horandl E. 2018. Mendelian segregation of leaf phenotypes in experimental F2 hybrids elucidates origin of morphological diversity of the apomictic Ranunculus auricomus complex. Taxon 67(6): 1082-1092. DOI: 10.12705/676.6
Jabbour F., Renner S. S. 2011. Consolida and Aconitella are an annual clade of Delphinium (Ranunculaceae) that diversified in the Mediterranean basin and the Irano-Turanian region. Taxon 60(4): 1029-1040. DOI: 10.1002/tax.604007 Jabbour F., Renner S. S. 2012. A phylogeny of Delphinieae (Ranunculaceae) shows that Aconitum is nested within Delphinium and that Late Miocene transitions to long life cycles in the Himalayas and Southwest China coincide with bursts in diversification. Mol. Phylogenet. Evol. 62(3): 928-942. DOI: 10.1016/j.ympev.2011.12.005
Kamelin R. V. 2009. The peculiarities of flowering plants speciation. Proceedings of the Zoological institute of the Russian academy of sciences 313(S1): 141-149. [In Russian] (Камелин Р. В. Особенности видообразования у цветковых растений // Труды Зоологического института РАН, 2009. Т. 313, № S1. С. 141-149).
Karbstein K., Tomasello S., Hodac L., Dunkel F. G., Daubert M., Horandl E. 2020. Phylogenomics supported by geometric morphometrics reveals delimitation of sexual species within the polyploid apomictic Ranunculus auricomus complex (Ranunculaceae). Taxon 69: 1191-1220. DOI: 10.1002/tax.12365
Kashin A. S., Kritskaya T. A., Bogoslov A. V., Shilova I. V., Parkhomenko A. S., Ishmuratova M. M., Fedorov N. I. 2021. Taxonomic revision of Delphinium (Ranunculaceae) in the South-East of European Russia. Plant Syst. Evol. 307:59. DOI: 10.1007/s00606-021-01783-y
Klingenberg C. P. 2011. MorphoJ: an integrated software package for geometric morphometrics. Mol. Ecol. Resour. 11(2): 353-357. DOI: 10.1111/j.1755-0998.2010.02924.x
Klingenberg C. P. 2022. Methods for studying allometry in geometric morphometrics: a comparison of performance. Evol. Ecol. 36: 439-470. DOI: 10.1007/s10682-022-10170-z
Koontz Ja. A., Soltis P. S., Soltis D. E. 2009. Using phylogeny reconstruction to test hypotheses of hybrid origin in Delphinium section Diedropetala (Ranunculaceae). Systematic Botany 29(2): 345-357.
Kurbatskiy V. I. 2017. New species of Delphinium L. (Ranunculaceae) from the Middle Siberia. Sist. Zametki Mater. Gerb. Krylova Tomsk. Gosud. Univ. [Systematic notes on the materials of P. N. Krylov Herbarium of Tomsk State University] 115: 23-27. [In Russian] (Курбатский В. И. Новый вид Delphinium L. (Ranunculaceae) из Средней Сибири // Сист. зам. Герб. Томск. ун-та, 2017. Т. 115. С. 23-27. DOI: 10.17223/20764103.115.4).
Luferov A. N. 2012. A new species of the genus Delphinium L. (Ranunculaceae) from Armenia. Novosti sistematiki vysshikh rasteniy [Novit. Syst. Pl. Vasc.] 43: 57-60. [In Russian] (Луферов А. Н. Новый вид рода Delphinium L. (Ranunculaceae) из Армении // Новости сист. высш. раст., 2012. Т. 43. С. 57-60).
Malyutin N. I. 1973. The phylogeny and the taxonomy of the Delphinium L. genus. Bot. Zhurn. 58(12): 1710-1722. [In Russian] (Малютин Н. И. Филогения и систематика рода Delphinium L. // Бот. журн., 1973. Т. 58, № 12. С. 1710-1722).
Malyutin N. I. 1987. The system of the genus Delphinium (Ranunculaceae) based on the morphological features of seeds. Bot. Zhurn. 72(5): 683-693. [In Russian] (Малютин Н. И. Система рода Delphinium (Ranunculaceae), основанная на морфологических признаках семян // Бот. журн., 1987. Т. 72, № 5. С. 683-693).
Malyutin N. I. 1992. Mnogoletniye delfiniumy [Perennial delphiniums]. Moscow: Agropromizdat. 56 pp. [In Russian] (Малютин Н. И. Многолетние дельфиниумы. М.: Агропромиздат, 1992. 56 с.).
Márquez F., Lozada M., Idaszkin Y. L., González-José R., Bigatti G. 2022. Cannabis varieties can be distinguished by achene shape using geometric morphometrics. Cannabis Cannabinoid Res. 7(4): 409-414. DOI: 10.1089/ can.2020.0172
Mijnsbrugge K. V., Clercq R. L., Michiels B. 2016. Dissection of leaf morphological traits from isolated and declined relict populations of Ulmus laevis reveals putative random ecotype. Plant Syst. Evol. 302(2): 219-229. DOI: 10.1007/s00606-015-1255-5
Miljkovic D., Stefanovic M., Orlovic S., Nedic M. S., Kesic L., Stojnic S. 2019. Wild cherry (Prunus avium (L.) L.) leaf shape and size variations in natural populations at different elevations. Alp. Botany 129: 163-174. DOI: 10.1007/ s00035-019-00227-1
Murtazaliev R. A., Luferov A. N. 2021. A new species of Delphinium L. (Ranunculaceae) from Dagestan (Eastern Caucasus). Turczaninowia 24, 4: 114-122. DOI: 10.14258/turczaninowia.24.4.11
Neto L. M., van den Berg C., Forzza R. C. 2019. Linear and geometric morphometrics as tools to resolve species circumscription in the Pseudolaelia vellozicola complex (Orchidaceae, Laeliinae). Plant Ecol. Evol. 152(1): 53-67. DOI: 10.5091/plecevo.2019.1531
Nevskiy S. A. 1937. Delphinium L. In: Flora SSSR [Flora of the USSR]. Vol. 7. Moscow; Leningrad: Publishers of Academy of Sciences of USSR. Pp. 101-183. [In Russian] (Невский С. А. Живокость или Шпорник - Delphinium L. // Флора СССР. Т. 7. М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1937. С. 101-183).
Plants of the World Online [2023]. Facilitated by the Royal Botanic Gardens, Kew. Published on the Internet. URL: https://powo.science.kew.org (Accessed 10 May 2023).
Ronquist F., Huelsenbeck J. P. 2003. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinfor-matics 19(12): 1572-1574. DOI: 10.1093/bioinformatics/btg180
Strelin M. M., Cosacov A., Chalcoff V. R., Maubecin C. C., Sersic A. N., Benitez-Vieyra S. M. 2021. The role of ontogenetic allometry and nonallometric flower shape variation in species-level adaptive diversification - Calceolaria polyrhiza (Calceolariaceae) as a case study. Evol. Dev. 23: 231-243. DOI: 10.1111/ede.12363
Tutin T. G., Burges N. A., Edmondson J. R., Chater A. O., Heywood V. H., Moore D. M., Akeroyd J. R., Valentine D. H., Walters S. M., Webb D. A., Newton M. E., Mill R. R. 1993. Flora Europaea. Vol. 1: Psilotaceae to Platanaceae. New York: Cambridge University Press. 629 pp.
TzvelevN. N. 1996. On some genera of the family Ranunculaceae in Eastern Europe. Bot. Zhurn. 81(12): 112-122. [In Russian] (Цвелёв Н. Н. О некоторых родах семейства Лютиковых (Ranunculaceae) в Восточной Европе // Бот. журн., 1996. Т. 81, № 12. С. 112-122).
Tzvelev N. N. 2001. Delphinium L. In: Flora Vostochnoy Yevropy [Flora of Eastern Europe]. Vol. 10. St. Petersburg: Mir i Semya Publ.; SPCPU Publ. Pp. 66-74. [In Russian] (Цвелёв Н. Н. Живокость - Delphinium L. // Флора Восточной Европы. Т. 10. СПб.: Мир и семья; Изд-во СПХФА, 2001. С. 66-74).
Vasil'ev A. G., Vasil'eva I. A., Shkurikhin A. O. 2018. Geometric morphometrks: from theory to practice. Moscow: KMK Scientific Press. 471 pp. [In Russian] (Васильев А. Г., Васильева И. А., Шкурихин А. О. Геометрическая морфометрия: от теории к практике. М.: Тов-во науч. изд. КМК, 2018. 471 с.).
von Balthazar M., Endress P. K., Qiu Y.-L. 2000. Phylogenetic relationships in Buxaceae based on nuclear internal transcribed spacers and plastid ndhF sequences. Int. J. Plant Sci. 161(5): 785-792. DOI: 10.1086/314302
WCVP [2023]. World Checklist of Vascular Plants, version 2.0. Facilitated by the Royal Botanic Gardens, Kew. Published on the Internet. URL: http://wcvp.science.kew.org (Accessed 10 May 2023).
Wen J., Zimmer E. 1996. Phylogeny and biogeography of Panax L. (the ginseng genus, Araliaceae): inferences from ITS sequences of nuclear ribosomal DNA. Mol. Phylogenet. Evol. 6(2): 167-177. DOI: 10.1006/mpev.1996.0069
White T. J., Bruns T., Lee S., Taylor J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: a guide to methods and applications. M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Shinsky, T. J. White (eds.). San Diego: Academic Press. Pp. 315-322.
Yelenevskiy A. G., Bulanyy Yu. I., Radygina V. I. 2009. Opredelitel sosudistykh rasteniy Saratovskoy oblasti [Handbook of vascular plants of the Saratov region]. Saratov: Bazhenov Publ. 248 pp. [In Russian] (Еленевский А. Г., Буланый Ю. И., Радыгина В. И. Определитель сосудистых растений Саратовской области. Саратов: ИП Баженов, 2009. 248 с.).
