CC BY
0ГЕНЫ ТЕРПЕНСИНТАЗ (TPS) PINUS SYLVESTRIS L.: ИДЕНТИФИКАЦИЯ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АННОТАЦИЯ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ТРАНСКРИПТОМНЫХ
ДАННЫХ
'Государственное научное учреждение «Институт леса Национальной академии наук Беларуси»
Республика Беларусь, 246001, г. Гомель, ул. Пролетарская, 71 e-mail: milamozh@yandex.ru 2Отделение биологических наук НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, пр. Независимости, 66
По результатам анализа транскриптомных данных сосны обыкновенной (Pirns sylvestris L.) идентифицировано 55 контигов терпенсинтаз (TPS), представленных 1 261 EST-последовательностью. Для четырех ранее не описанных транскриптов генов TPS проведена аннотация и структурно-функциональный анализ. На основе гомологии транслируемых аминокислотных последовательностей с ранее охарактеризованными терпенсинтазами родов Pinus и Picea предсказана их потенциальная функция: участие в метаболизме монотерпенов — (-)-а-пи-нена и (+)-3-карена, и сесквитерпена — а-фарнезена. Для анализируемых последовательностей терпенсинтаз показано наличие консервативных мотивов: N-концевого RR(X8)W и Асп-насыщенного, характерного для терпенситаз I класса, мотива DDxxD. Проведено депонирование нуклеотидных и аминокислотных последовательностей идентифицированных терпенсинтаз P sylvestris в международной базе данных NCBI GenBank.
Ключевые слова: сосна обыкновенная, Pinus sylvestris L., высокопроизводительное секвенирование, терпены, гены терпенсинтаз.
Введение
Терпены растений представлены широким классом природных химических веществ, включающим более 40 тыс. различных соединений. Структура соединений представлена пятиуглеродными (C5) изопреноидными единицами изопентенилдифосфата и его изомера — диметилаллилдифосфата. В зависимости от количества содержания (С5)-единиц выделяют: гемитерпены (C5), монотерпены (C10), сесквитерпены (C15), дитерпены (C20), тритерпены (C), тетратерпены (C) или политерпены (C5n) [1, 2]. Широкое комбинаторное разнообразие терпенов ассоциированно с активностью терпенсинтаз (TPS) — основных ферментов биосинтеза терпенов. TPS катализируют сложные реакции циклизации, перегруппировки и элиминации, вызванные карбо-катионами, действуют на один или несколько универсальных предшественников (включая диметилаллилдифосфат), создавая комбинаторное разнообразие терпенов [3]. Таким
образом, одна TPS может давать множество продуктов из-за стохастичности перегруппировки химических связей после образования необычных промежуточных карбокатионов. В зависимости от физиологического статуса и развития растений также отмечается присутствие мультисубстратных терпенов. Кроме того, предполагается, что предпочтение субстрата и профилей терпеновых продуктов может меняться в ответ на изменения окружающей среды [4].
Терпены для хвойных растений выступают в качестве первичного уровня устойчивости, участвуя в конститутивных и индуцированных защитных реакциях при проникновении насе-комых-вредителей, а также патогенов [2, 5, 6]. Летучие терпены, в основном моно- и сескви-терпены, играют значительную роль во взаимодействиях растений с окружающей средой, выступая в качестве сигнальных молекул для стимуляции защитных реакций в здоровых тканях того же растения, а также в соседних
растениях, кроме того, могут выполнять функцию привлечения естественных врагов патогенов и вредителей [3-5]. Помимо химической и физической защиты, конститутивные и индуцированные терпены хвойных растений, в основном геми- и монотерпены, могут выполнять физиологическую и экологическую роль в защите от абиотических стрессов, таких как засуха, засоление, высокие и низкие температуры [6]. Ряд исследований показал, что некоторые терпены проявляют значительную антиоксидантную активность, что позволяет предположить, что они могут играть роль в предотвращении окислительного стресса, вызванного абиотическими факторами [3, 7, 8].
Широко используются терпены и их производные в химической промышленности: при производстве парфюмерии и косметических средств, ароматизаторов и пищевых добавок [9-10]. Монотерпены хвойных растений используют и в фармакологии за счет проявления антимикробной, противовирусной и противоопухолевой активности [11-12].
К настоящему времени представлены немногочисленные работы по изучению TPS отдельных видов семейства Pinaceae, при этом данные об общем полном количестве генов TPS ограничены. Особенно затрудняет идентификацию TPS отсутствие прочитанных и/или аннотированных геномных данных хвойных видов. Так, наиболее охарактеризованы TPS в исследованиях Д. Э. Холла с соавторами [13], где представлено 16 различных генов Pinus contorta и 15 генов Pinus banksiana, в работе Д. М. Мартин с соавторами [14] описано девять различных TPS Picea abies. Для P sylvestris в общедоступных данных представлена ограниченная информация о нуклеотидных или аминокислотных структурах терпенсинтаз. В международной базе нуклеотидных данных NCBI GenBank содержится информация о четырех сесквитерпенсинтазах (STPS) P. sylvestris, охарактеризованных в работах Д. Кепке с соавторами [15].
Исходя из этого, для более детального понимания механизмов биосинтеза терпенов необходимо проводить исследования, направленные на скрининг новых генов семейства TPS P. sylvestris, изучение их разнообразия и структурно-функциональной организации.
Целью нашего исследования являлся по-
иск транскриптов генов терпенсинтаз (TPS) в транскриптомах сосны обыкновенной, с их последующей структурно-функциональной аннотацией.
Материалы и методы
В исследовании использовались транс-криптомы сосны обыкновенной базы данных ГНУ «Институт леса НАН Беларуси». Материалом для RNA-seq являлись ювенильные (проростки) растения и средневозрастные генеративные (40-45 лет) деревья сосны обыкновенной. Для проростков тотальную РНК выделяли из корня и гипокотиля индивидуальных растений, объединенных в пул (всего проанализировано три транскриптома, общее число растений — 49 шт.), для средневозрастных деревьев использовались ткани камбиальных зон вегетирующих побегов (проанализировано два транскриптома, число деревьев — 2 шт.), с применением набора GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Fisher Scientific, США) по методике фирмы-производителя. Очистку РНК от примесей геномной ДНК выполняли с помощью DNase I, RNase-free (Thermo Fisher Scientific, США), а для ингибирования рибонуклеаз использовали RNase Inhibitor (Thermo Fisher Scientific, США). Для реакции обратной транскрипции матричной РНК с получением двухцепочечной кДНК использовали набор Maxima H Minus DoubleStranded cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, США).
Создание фрагментированных библиотек кДНК для секвенирования (размер фрагмента ~200 п. н.) проводили с использованием набора Ion Plus Fragment Library Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Эмульсионную ПЦР выполняли с применением набора Ion PGM Template OT2 200 Kit (Thermo Fisher Scientific, США) согласно инструкции компании-производителя в планшетном амплификаторе Ion One Touch 2 System (Thermo Fisher Scientific, США). Этап обогащения микросфер производился с использованием автоматической пробоподготовки Ion One Touch ES с применением наборов Ion PGM Template OT2 Solutions 200 Kit и Ion PGM Enrichment Beads (Thermo Fisher Scientific, США). Реакцию секвенирования выполняли на базе геномного анализатора Ion PGM System (Thermo Fisher
Scientific, США) с применением набора Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 и полупроводникового микрочипа Ion 314 Chip v2 (Thermo Fisher Scientific, США). Первоначальную обработку данных, поступающих от геномного анализатора, осуществляли в автоматическом режиме при помощи программного обеспечения IonTorrent Suite v. 4.0 (Thermo Fisher Scientific, США). Окончательную обработку информации и сборку транскриптов генов проводили с использованием программного обеспечения UGENE (UniPro, Россия).
Структурно-функциональная аннотация транскриптомов проводилась согласно анализу структурного сходства последовательностей (ISS-подход) в базе данных нуклеотидных последовательностей и консервативных доменов NCBI CDD. Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей транс-криптов проводили в программе MEGA 11. Трансляцию нуклеотидных последовательностей с последующим множественным выравниванием проводили с использованием программного пакета CLC Sequence Viewer 6.3 (Qiagen, США) и онлайн ресурса NCBI ORF finder. Филогенетический анализ проводился в программе MEGA11 [16]. Статистическая поддержка кластеризации оценивалась с помощью бутстреп-анализа с использованием 1 000 итераций.
Результаты и обсуждение
Поиск транскриптов TPS-локусов осуществлялся на основании наличия консервативных доменов: PF01397, PF03936 и cd00684. Всего для исследуемых транскриптомов P. sylvestris идентифицировано 55 контигов TPS, представленных 1 261 EST-последовательностью. На основе функциональной характеристики и анализа сходства нуклеотидных последовательностей в GenBank NCBI нами были идентифицированы TPS-локусы кодирующие монотерпенсинтазы [(+)-3-карен-синтаза, (-)-а-пинен-синтаза, (+)-а-пинен-синтаза], сесквитерпенсинтазы (а-фарнезен-синтаза, гермакрадиен-4-ол-синтаза) и дитерпенсинтазу (левопимарадиен/абиетадиен-синтаза). Из общего спектра TPS контигов идентифицировано четыре транскрипта, содержащих полную открытую рамку считывания (ORF): № 708, 1 282, 2 355 и 2 458.
Сравнительное изучение нуклеотидных последовательностей транскриптов сосны обыкновенной в базе данных NCBI позволило идентифицировать наиболее схожие им по нуклеотидной структуре транскрипты. Для контига № 708 наиболее близкой была нуклеотидная последовательность мРНК гена (-)-а-пинен-синтазы TPS-(-)apin1 P. contorta (учетная запись NCBI GenBank JQ240303.1, уровень сходства 95%); для контигов № 1 282 и 2 458 — мРНК гена (+)-3-карен-синтазы TPS-(+)3car1 P. banksiana (учетная запись NCBI GenBank JQ240305.1, уровень сходства 96 и 98%, соответственно); контиг № 2 355 был наиболее схож с мРНК гена (E,E)-а-фар-незен-синтазы/(В)-Р-оцимен-синтазы гибрида рода елей Picea — P. engelmannii х P. glauca (учетная запись NCBI GenBank HQ426157.1, уровень сходства 90%), а среди рода Pinus наиболее близким транскриптом для контига № 2 355 явилась мРНК гена а-фарнезен-синта-зы Pirns taeda (учетная запись NCBI GenBank AF543528.1, уровень сходства 79%).
На основе анализа в онлайн ресурсе NCBI ORF finder установлены открытые рамки считывания (ORF) для анализируемых транс-криптов генов TPS. Их длина для № 708 составила 1 884 п. о, кодирующих 627 аминокислот; для № 1 282 — 1 773 п. о, кодирующих 590 аминокислот; для № 2 355 — 1 716 п. о, кодирующих 571 аминокислоту; и для № 2458 — 1 881 п. о, кодирующих 626 аминокислот. С использованием программы Protein BLAST был проведен поиск гомологов транслируемых аминокислотных последовательностей идентифицированных терпенсинтаз в базе данных GenBank NCBI, с последующей оценкой степени их сходства. Для контига № 708 сходство аминокислотной последовательности транслируемого региона составило 90% c наиболее близкой аминокислотной последовательностью (-)-а-пинен-синтазы P. contorta (учетная запись NCBI GenBank: AFU73855.1 — транслируемая последовательность JQ240303.1; UniProtKB/Swiss-Prot: R9QMR3.1). Аминокислотным последовательностям транслируемых участков контигов № 1 282 и 2 458 наиболее близкими по структуре явились последовательности (+)-3-карен-синтазы: P. contorta (учетная запись nCbI GenBank: AFU73859.1 — транс-
лируемая последовательность JQ240307.1; UniProtKB/Swiss-Prot: R9QMW8.1, сходство 96%) и P. banksiana (учетная запись NCBI GenBank: AFU73857.1 — транслируемая последовательность JQ240305.1; UniProtKB/ Swiss-Prot: R9QMW4.1, сходство 98%), соответственно. Транслируемая аминокислотная последовательность контига № 2 355 наибольшую схожесть имела c (Е,Е)-а-фарнезен-син-тазой/(Е)-Р-оцимен-синтазой гибрида рода Picea — P. engelmannii х P. glauca (учетная запись NCBI GenBank: ADZ45514.1 — транслируемая последовательность HQ426157.1; UniProtKB/Swiss-Prot: F2XF99.1, уровень сходства 87%).
Для четырех идентифицированных аминокислотных последовательностей терпенсинтаз P. sylvestris (контиги № 708, 1 282, 2 355 и 2 458) проводился кластерный анализ с использованием 45 ранее известных аминокислотных последовательностей для видов родов Pinus и Picea из базы данных NCBI GenBank со следующими учетными номерами: P. banksiana (AFU73842.1-AFU73844.1, AFU73 848.1-AFU73 850.1, AFU73854.1, AFU73856.1-AFU73858.1, AFU73860.1); P. contorta (AFU73 845.1-AFU73 847.1, AFU73 851.1-AFU73 853.1, AFU73855.1, AFU73859.1, AFU73861.1); Pinus greggii (AFJ73549.1); Pinus kesiya var. langbianensis (AIY22674.1, AQZ36562.1); Pinus massoniana (AGW25369.1, AIL88641.1, QDZ38469.1, QLH02025.1, QMU23999.1); Pinus nigra subsp. laricio putative (UMW72395.1); Pinus pseudostrobus (AFJ73572.1); Pinus pseudostrobus var. estevezii (AFJ73569.1); Pinus sabiniana (AEB53064.1); P sylvestris (ABV44452.1-ABV44454.1, ADH29869.1); Pinus tabuliformis (ABY65904.1); Pinus taeda (AAO61225.1, AAO61227.1, AAO61228.1, Q84KL5.1); Pinus teocote (AFJ73576.1); P abies (AAS47697.1); P. engelmannii x P. glauca (ADZ45514.1); Picea sitchensis (ADU85928.1). В качестве внешней группы использовалась аминокислотная последовательность энт-кау-рен синтазы представителя мохообразных растений — Physcomitrium patens (учетная запись NCBI GenBank: BAF61135.1 гена PpCPS/KS). Кластерный анализ проводился с использованием метода ближайшего соседа (neighborjoining, NJ) и бутстреп-теста на основе 1 000
итераций. Всего в анализ были включены 924 аминокислотных сайта 50 аминокислотных последовательностей. На рисунке 1 представлены результаты кластерного анализа.
Как видно из структуры дендрограммы (рис. 1) исследуемые контиги P. sylvestris относятся к трем кладам при максимальном уровне бутстреп-поддержки в 100%. Так, клада, обазначенная нами как TPS-(-)apin, включает восемь аминокислотных последовательностей, функционально охарактеризованных как (-)-а-пинен-синтазы рода Pinus (QDZ38469.1, QLH02025.1, QMU23999.1, AQZ36562.1, AFU73855.1, AFU73856.1, AAO61225.1, ABY65904.1) и идентифицированного нами контига № 708. Транслируемая аминокислотная последовательность контига № 2 355 кластеризуется вместе с представителями родов Pinus и Picea, отнесенных авторами к а-фарне-зен-синтазам (P taeda, Q84KL5.1), (Е,Е)-а-фар-незен-синтазам (P. abies, AAS47697.1) или (Е,Е)-а-фарнезен-синтаза/(Е)-Р-оцимен-син-таза (P engelmannii x P. glauca, ADZ45514.1), и формируют общую кладу, отмеченную как TPS-afarn. Две аминокислотные последовательности контигов № 1 282 и 2 458, относятся к различным ветвям одной общей клады, обозначенной нами как TPS-(+)car, совместно с пятью (+)-3-карен-синтазами родов Pinus (AFU73857.1-AFU73859.1, UMW72395.1) и Picea (ADU85928.1).
Полученные результаты кластеризации позволяют разделить идентифицированные нами транскрипты генов терпенсинтаз P. sylvestris согласно гомологии их структур с ранее известными терпенсинтазами. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности новых терпенсинтаз P. sylvestris депонированы нами в международную базу NCBI GenBank под следующими учетными записями: контиг № 708, (-)-а-пинен-синтаза — PP210211.1 и WVH32569.1; № 1 282, (+)-3-карен-син-таза — PP210213.1 и WVH32571.1; № 2 355, а-фарнезен-синтаза — PP210210.1 и WVH32568.1; № 2 458, (+)-3-карен-синта-за — PP210212.1 и WVH32570.1.
Проведен анализ множественного выравнивания аминокислотных последовательностей терпенсинтаз, составляющие клады дендрограммы: TPS-(-)apin, TPS-afarn и TPS-(+)car. Количество аминокислот в исследуемых пепти-
QLH02025.1 Pinus massoniana alpha-pinene synthase o97i' QMU23999.1 Pinus massoniana TPS (-)-alpha-pinene Jf AGW25369.1 Pinus massoniana (-)-alpha pinene synthase AQZ36562.1 Pinus kesiya var. langbianensis terpene synthase AFU73855.1 Pinus contorta (-)-alpha pinene synthase (TPS-(-)apinl)
AFU73856.1 Pinus banksiana (-)-alpha pinene synthase (TPS-(-)apinl) г AA061225.1 Pinus taeda (-)-alpha-pinene synthase } — ABY65904.1 Pinus tabuliformis alpha-pinene synthase —|Contic|70^|
r AFU73842.1 Pinus banksiana (-)-alpha/beta-pinene synthase (TPS-(-)a/Bpin1)
9б|1_ ДА061227.1 Pinus taeda alpha-terpineol synthase AIL88641.1 Pinus massoniana alpha-terpineol synthase AFU73844.1 Pinus banksiana (-)-beta-pinene synthase (TPS-(-)Bpin2)
AFU73843.1 Pinus banksiana (-)-beta-pinene synthase (TPS-(-)Bpinl)
8 [r AFU73845.1 Pinus contorta (-)-beta-pinene synthase (TPS-(-)betapinl)
65 *- AFU73846.1 Pinus contorta monoterpene synthase like (TPS-mono1) г AFU73854.1 Pinus banksiana (-)-beta-phellandrene synthase (TPS-(-)BphelH)
JZf AFU73852.1 Pinus contorta (-)-beta-phellandrene synthase (TPS-(-)Bphell2)
- AFU73853.1 Pinus contorta (-)-beta-phellandrene synthase (TPS-(-)BphelH)
AFU73851.1 Pinus contorta (-)-camphene / (+)-alpha-pinene synthase (TPS-(-)camp/(+)apin1)
____г AFU73849.1 Pinus banksiana monoterpene synthase like (TPS-mono2)
m*- AFU73848.1 Pinus banksiana monoterpene synthase like (TPS-mono1) г AIY22674.1 Pinus kesiya var. langbianensis alpha-pinene synthase (L QDZ38469.1 Pinus massoniana isolate 20181227 (+)-alpha-pinenesynthase (APS) г AA061228.1 Pinus taeda (+)-alpha-pinene synthase П- AFU73850.1 Pinus banksiana (+)-alpha pinene synthase (TPS-(+)apin1)
82*- AFU73847.1 Pinus contorta (+)-alpha pinene synthase (TPS-(+)apin1)__________________________
TPS-(-)apin
AAS47697.1 Picea abies EE-alpha-farnesene synthase Q84KL5.1 Pinus taeda alpha-farnesene synthase jcontig2355 j
ADZ45514.1 Picea engelmannii x Picea glauca clone (EE)-alpha-farnesene synthase/(E)-beta-ocimene synthase
I— AFU73860.1 Pinus banksiana alpha terpineol synthase (TPS-aterp)
'— AFU73861.1 Pinus contorta alpha terpineol /18-cineole synthase (TPS-aterp/18cin)
I AFJ73576.1 Pinus teocote 2-methyl-3-buten-2-ol synthase (Tps-ISH1)
Г* AFJ73549.1 Pinus greggii 2-methyl-3-buten-2-ol synthase p AFJ73572.1 Pinus pseudostrobus 2-methyl-3-buten-2-ol synthase (Tps-ISH1)
Ц- AEB53064.1 Pinus sabiniana 2-methyl-3-buten-2-ol synthase (Tps-MB01)
100 L AFJ73569.1 Pinus pseudostrobus var. estevezii 2-methvl-3-buten-2-ol synthase (Tps-MBQ2)
TPS-afarn
ADU85928.1 Picea sitchensis genotype Q903 (+)-3-carene synthase (TPS-3car3) IContig 12821 IContiq2458l
AFU73857.1 Pinus banksiana (+)-3-carene synthase (TPS-(+)3car1)
UMW72395.1 Pinus nigra subsp. laricio putative (+)-3-carene synthase (MTPS3) AFU73858.1 Pinus banksiana (+)-3-carene synthase (TPS-(+)3car2)
AFU73859.1 Pinus contorta (+)-3-carene synthase (TPS-(+)3car1___________________
TPS-(+)car
ABV44454.1 Pinus sylvestris longifolene synthase
ABV44453.1 1 Pinus sylvestris(10)5-germacradien-4-ol synthase ABV44452.1 Pinus sylvestris caryophyllene/humulene synthase ADH29869.1 Pinus sylvestris e-beta farnesene synthase
BAF61135.1 Physcomitrella patens ent-kaurene synthase
Рис. 1. Дендрограмма сходства исследуемых аминокислотных последовательностей TPS
дах варьировало, как и присутствие консервативных сайтов: последовательности клады TPS-(-)apin характеризуюся длиной от 624 до 629 а. о. и содержат 383 консервативные аминокислоты; TPS-afarn — 574-587 а. о., из них 395 являются консервативными; TPS-(+)car клада включает (+)-3-карен-синтазы длиной от 589 (контиг № 1 282, WVH32571.1, содержащий делецию в 37 а. о. на N-конце) до 627 а. о., включающих 444 консервативные аминокислоты. Характерной особенностью анализируемых пептидов являлось наличие консервативных мотивов: N-концевого RR(X8)W (рис. 2), преположительно необходимого для катализа циклизации монотерпенов, и Асп-на-сыщенного мотива DDxxD, консервативного для терпенситаз I класса (рис. 3), участвую-
щего в координации связывания субстрата посредством образования солевых мостиков двухвалентных катионов [3, 17].
Исходя из полученных данных, для аминокислотных последовательностей идентифицированных транскриптов генов терпенсинтаз (TPS) P sylvestris на основе гомологии с ранее функционально охарактеризованными ортологичными терпенсинтазами родов Pinus и Piceae предсказана их потенциальная функция. Уровень сходства транслируемых аминокислотных последовательностей TPS P sylvestris с наиболее близкими ортологами хвойных видов варьировал от 87 до 98%.
Заключение
Исследования, направленные на изучение
Рис. 2. Фрагмент множественного выравнивания аминокислотных последовательностей терпенсинтаз, составляющих клады дендрограммы: TPS-(—)apin, TPS-afarn, TPS-(+)car. Рамкой отмечен N-концевой мотив RR(X8)W
TPS-(-)apin
Contig708 AFU73855.1 АА061225.1 AG W2 5369.1 AFU73856.1 QMU23999.1 ABY65904.1 AIY22674.1 Consensus
1004
Conservation
QKRELEYLVR
QimikLVR
QKRELEYLVR
QKRELEYLVR
QKRELEYLVR
QllHIkLVR
vkr|lqs|sr
QKRELEYLVR
WWKGSGSPHM WWKGSGSPQM WWKGSGSPQM WWKGSGSPQM WWKGSGSPQM WWKGSGSPQM WWKGTSSPQM WWK||G|PEI WWKGSGSPQM
TFCRHRHVEV T FCRHRHVEY TFCRHRHlII T|C|H|H||| T FCRHRHVEY TFCRHRHVEV TFCRHRHlII T|s|H|H||| T FCRHRHVEY
111 in
|t|asc IAFE
|t|asc IAFE
YTLASC IAFE
YTLASC IAFE
YTLASC IAFE
|t|asc IAFE
YTLASC IAFE
|TLAAC 1 AND
YTLASC IAFE
a|ach||t||
AKACH I ITVL АКАСН||Т|| AKACH I ITVL AKACHlITVL AKACHI ITVL AKACHI ITVL GKICHM|T|| AKACHI ITVL
■ IM|TSA| 397 DEL EL F TS A I 399 DELELFTSAl 399 DELELlTAAl 399 DELELlTSAl 399 LEL|TAA| 399 LEL|TSA| 399 LELLTAAi 393 DELEL FTSAI
TPS-afarn
i
IDDxxD
QB4KL5.1 M|P|HSA||| G|A||C||G| |||||||
AAS47697.1 |l EPKHSAFRL gIaKVCVLGI vOdDIYD
Conlig2355 tep|hsa|r| gfaktc|lg| |i|dD||| Consensus XEPKHSAFRL GFAKXCYLGI VlIdDIYD
Conservation „
ж. □
r|G |m||||||ta All KRWDTSTT |c|p||m|g| |ma|||c|n| marqaektqg звз TFG KMKELELFTA AIKRWDPSTT ECLPEYMKGV YMAFY NCVN| LALQAEKTQG 38B
r|G tm||||||ta aikrw|psa| |clpeymkgi |m||||c|nq mareaeksqg 395
TFG KMEELELFTA AIKRWDPSTT ECLPEYMKGV YMAFYDCVNE MARQAEKTQG
nl inn 111
и щи m и in him
TPS-(+)car
Contig2458
Contig1282
AFU73857.1
AFU73858.1
AFU73859.1
UMW72395.1
ADU85928.1
LQClWRWWK _ Q C LWRWWK _QC LWRWWK .QC LWRWWK - Q C ifWRWWK _QC LWRWWK .KSVSI
EWGC
EWGC
EWGC
EWGC
EWGC
IWGC
ESGF
340
ltM IhIIHIIt
LTFI RHRYVEFYT LTFI RHRYVEFYT LTFI RHRYVE||T LTFI RHRYVEllT LTF| RHRYVKFYT LN|| RHRHVEfYT
Consensus E L Q C LWRWWK EWGCPELTF
100%
VSG1Imvpeh vsg||mvpeh
VSG||MVPEH
VSG||MVPEH
VSGI DMVPEH VSGIDMVPEH VSG||)MEPKH
VSGIDMVPEH
ATlIISlIlT
ATFRLSCVKT
AT|||S|||T
ATlRLSCVKT
ATFRLSCVKT
ATlIISlIlT
ST|||S|||M
ATFRLSXVKT
IDDxxD
■■m ■■
D DM
DDM || D DM DDM
ddk Id
DDM YD
DDM YD
1 uni 11 11П111ПНП |n| 1 in ni 1 l Inn l г In
ITIGTIHH
TFGTIDEL
TFGTIDEL
TFGTIDEL
tIgtIIII
TFGTIDEI
TlGTlIH
TFGTIDEL
rIItaaIBrw 399
■llTAAlllW 363 RL|TAAVKRW 399 RLFTAAVK|l# 399 RLFTAAVKH 399
■IsTAaIIIw 399 ■llTAAllll 400
RLFTAAVKRW
Рис. 3. Фрагмент множественного выравнивания аминокислотных последовательностей терпенсинтаз, составляющих клады дендрограммы: TPS-(—)apin, TPS-afarn, TPS-(+)car. Рамкой отмечен мотив DDxxD
молекулярных механизмов, регулирующих синтез терпенов хвойных пород, являются актуальными в связи с широким спектром вы-
полняемых ими защитных функций, а также их применения в биотехнологической отрасли и химической промышленности. В результате
анализа транскриптомных данных P. sylvestris нами идентифицированы транскрипты четырех ранее не описанных генов терпенсинтаз. На основе структурно-функциональной аннотации, а также гомологии с ранее охарактеризованными терпенсинтазами родов Pinus и Picea, предсказана их потенциальная функция. Идентифицированные гены TPS P. sylvestris, предположительно, участвуют в метаболизме монотерпенов — (-)-а-пинена и (+)-3-карена, и сесквитерпена — а-фарнезе-на. Их нуклеотидные и аминокислотные последовательности депонированы в NCBI GenBank под номерами: PP210210.1-PP210213.1, WVH32568.1-WVH32571.1.
Список использованных источников
1. Tholl, D. Biosynthesis and biological functions of terpenoids in plants / D. Tholl // Biotechnology of isoprenoids. - 2015. - P. 63-106.
2. Terpenes and terpenoids in plants: Interactions with environment and insects / D. A. T. Bon-can [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. - 2020. - Vol. 21, № 19. - P. 7 382.
3. Monoterpene Synthase Genes and Monoterpene Profiles in Pinus nigra subsp. laricio / E. Alicandri [et al.] // Plants. - 2022. - Vol. 11, № 3. - P. 449.
4. Zulak K. G., Bohlmann J. Terpenoid biosynthesis and specialized vascular cells of conifer defense / K. G. Zulak, J. Bohlmann // Journal of Integrative Plant Biology. - 2010. -Vol. 52, № 1. - P. 86-97.
5. Celedon, J. M., Bohlmann, J. Oleoresin defenses in conifers: Chemical diversity, terpene synthases and limitations of oleoresin defense under climate change / J. M. Celedon, J. Bohlmann // New Phytologist. - 2019. - Vol. 224. - P. 1 444-1 463.
6. Kopaczyk, J. M. The variability of terpenes in conifers under developmental and environmental stimuli / J. M. Kopaczyk, J. Wargula, T. Jelonek // Environmental and Experimental Botany. - 2020. - P. 104 197.
7. The anticancer, antioxidant and antimicrobial properties of the sesquiterpene P-caryophyllene from the essential oil of Aquilaria crassna //
S. S. Dahham [et al.] // Molecules. - 2015. -Vol. 20. - P. 11 808-11 829.
8. In vitro neuroprotective potential of the monoterpenes а-pinene and 1, 8-cineole against H2O2-induced oxidative stress in PC12 cells / M. Porres-Martmez [et al.] // Zeitschrift fur Naturforschung C. - 2016. - Vol. 71. - P. 191-199.
9. Volatile terpenoids: Multiple functions, biosynthesis, modulation and manipulation by genetic engineering / F. Abbas [et al.] // Planta. -2017. - Vol. 246. - P. 803-816.
10. Isoprenoid drugs, biofuels, and chemi-
cals — Artemisinin, farnesene, and beyond / K. W. George [et al.] sopre-
noids - 2015. - P. 355-390.
11. Antitumor activity of monoterpenes found in essential oils / M. V. Sobral [et al.] // The Scientific World Journal. - 2014. - P. 953 451.
12. Растительные терпеноиды, как основа создания новых противовирусных препаратов / А. С. Турмагамбетова [и др.] // Новости науки Казахстана. - 2018. - № 3. - С. 57-65.
13. Transcriptome resources and functional characterization of monoterpene synthases for two host species of the mountain pine beetle, lodgepole pine (Pinus contorta) and jack pine (Pinus banksiana) / D. E. Hall [et al.] // BMC Plant Biology. - 2013. - Vol. 13. - P. 1-14.
14. Martin, D. M. Functional characterization of nine Norway spruce TPS genes and evolution of gymnosperm terpene synthases of the TPS-d subfamily / D. M. Martin, J. Faldt, J. Bohlmann // Plant physiology. - 2004. - Vol. 135, № 4. -P. 1 908-1 927.
15. Species-specific responses of pine sesquiterpene synthases to sawfly oviposition / D. Kop-ke [et al.] // Phytochemistry. - 2010. - Vol. 71, № 8-9. - P. 909-917.
16. Tamura, K. MEGA 11: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 11 / K. Tamu-ra, G. Stecher, S. Kumar // Molecular Biology and Evolution. - Vol. 38, № 7. - P. 3 022-3 027.
17. On the evolution and functional diversity of terpene synthases in the Pinus species: A Review / E. Alicandri [et al.] // Journal of Molecular Evolution. - 2020. - Vol. 88. - P. 253-283.
L. V. Mozharovskaya1, S. V. Panteleev1, O. Yu. Baranov1, 2
PINUS SYLVESTRIS L. TERPENE SYNTHASE (TPS) GENES: IDENTIFICATION, STRUCTURAL AND FUNCTIONAL ANNOTATION BASED ON THE TRANSCRIPTOMIC DATA ANALYSIS
'State Scientific Institution
“Forest Institute of the National Academy of Sciences of Belarus”
71 Proletarskaya St., 246001 Gomel, the Republic of Belarus e-mail: milamozh@yandex.ru
^Department of Biological Sciences of the National Academy of Sciences of Belarus 66 Nezavisimosti Ave., 220072 Minsk, the Republic of Belarus
As a result of the transcriptomic data analysis of Pinus sylvestris, 55 terpene synthase contigs (TPS) represented by 1261 EST sequences were identified. Annotation and structural-functional analysis were carried out for four previously undescribed TPS gene transcripts. Based on the homology of the translated amino acid sequences with previously characterized terpene synthases of the genera Pinus and Picea, their potential function was predicted: participation in the metabolism of monoterpenes — (-)-a-pinene and (+)-3-carene, and sesquiterpene — a-farnesene. The analyzed terpene synthase sequences show the presence of conserved motifs: the N-terminal RR(X8)W and the Asp-saturated DDxxD motif, characteristic of class I terpene synthases. The nucleotide and amino acid sequences of the identified P sylvestris terpene synthases were deposited with the International Database NCBI GenBank.
Keywords: Scotch pine, Pinus sylvestris L., next-generation sequencing, terpenesterpene synthase genes.
Дата поступления в редакцию: 06 февраля 2024 г.
