CC BY
69
Том 148, кн. 2
Естественные науки
2006
УДК 579.23+579.22+579.083.13+575.224.4
ГЕНОТОКСИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ МИКРОБНОГО СИГНАЛЬНОГО АГЕНТА - ГОМОСЕРИНЛАКТОНА
А.Б. Маргулис, О.В. Бушманова, И.В. Ожиганова, А.И. Колпаков, О.Н. Ильинская
Аннотация
Показано, что микробный сигнальный агент гомосеринлактон не проявляет токсических и генотоксических эффектов в диапазоне концентраций от 1 до 1000 мкг/мл по отношению как к про-, так и к эукариотам.
Введение
Изучение микробного антагонизма, синтеза и секреции антибиотических веществ, регуляторной роли микробных метаболитов имеет большое практическое значение. Микроорганизмы способны адаптироваться к стрессовым условиям окружающей среды, таким, как недостаток питательных веществ, источников энергии, пространственных возможностей, температурные перепады. Это проявляется не только в спорообразовании или формировании цист, но и в образовании новых морфотипов, утрате токсигенных свойств, образовании так называемых некультивируемых форм, причем как у неспорообразующих, так и у спорообразующих бактерий при репрессии спорообразования [1]. Регулирование процесса перехода микроорганизмов в состояние анабиоза особенно важно для медицины и биотехнологии. Снижение интенсивности обмена веществ вегетативных клеток может быть усилено индукторами гипометаболиче-ского состояния. Подтверждено участие в этом процессе ряда химических факторов эндогенного происхождения, например алкилрезорцинов [2]. В пищевой и медицинской промышленностях может быть организовано производство ферментов, стабилизированных химическими шаперонами микробного происхождения, каталитически активных в широком диапазоне температур, рН и др. для создания биокапсулированных ферментных лекарственных препаратов, для переработки сельскохозяйственной продукции и создания моющих средств [3]. В химической коммуникации у микроорганизмов принимают участие различные соединения, в частности, ацилированные лактоны гомосерина участвуют в «эффектах кворума» у грамотрицательных бактерий. Многие из плотностно-зависимых систем важны для регуляции поведения симбиотической (паразитической) микрофлоры в ее взаимоотношениях с макроорганизмом [4]. Более того, коммуникация посредством гомосеринлактонов может иметь межвидовой характер [5]. Нами было установлено участие гомосеринлактона в переходе некоторых грамположительных бактерий в гипометаболическое состояние [6].
Механизм действия гомосеринлактона заключается в индукции кворум-эффектов на уровне транскрипции у ряда грамотрицательных бактерий по типу системы luxI-luxR [4, 5], однако участие гомосеринлактона в регуляции экспрессии генов не исключает возможности его геном-повреждающего действия. Поскольку для ряда представителей группы алкилрезорцинов, являющихся непосредственными участниками процесса перехода ряда микроорганизмов в ги-пометаболическое состояние, установлены мутагенные и ДНК-повреждающие эффекты [7-9], представлялось важным выяснить, насколько возможно повреждение генома при действии гомосеринлактона. Поскольку исследование возможности регуляции гомосеринлактоном физиологических процессов у микроорганизмов, особенно патогенных, представляет несомненный интерес, важно выяснить, что является причиной подобного эффекта. Возможно, что изменение физиологического состояния бактерий и их переход в стадию гипометабо-лизма под действием гомосеринлактона являются следствием генотоксического действия последнего. В связи с этим, целью настоящей работы явилось исследование возможности индукции бактериальным индуктором кворум-эффекта -гомосеринлактоном, повреждений генетического материала клеток про- и эу-кариот.
1. Постановка задачи
В работе использовались следующие штаммы микроорганизмов (табл. 1).
Исследовали бактериальный индуктор кворум-эффекта - гомосеринлактон. Разведения готовили в стерильной дистиллированной воде. Работали с концентрациями от 1 до 1000 мкг/мл.
Токсический эффект определяли по выживанию тестерного штамма в опытных вариантах по сравнению с контрольным [10]. Способность веществ вызывать генные мутации оценивали в тесте Эймса с использованием Salmonella typhimurium TA 100 [11]. Сущность теста заключается в том, что тес-терные штаммы бактерий S. typhimurium культивируют на специальной среде, на которой могут расти лишь мутанты этих штаммов, у которых произошла мутация от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Без внешних воздействий такие мутации происходят с низкой частотой. Если в среду культивирования ввести химический мутаген, то частота мутаций значительно увеличивается, что регистрируется по числу колоний микроорганизмов, выросших на данной селективной среде.
ДНК-повреждающую активность оценивали по избирательному ингибиро-ванию роста мутантных штаммов Escherichia coli, дефектных по репарации, в сравнении с ростом «дикого» штамма [11]. Многие повреждения ДНК, которые вызываются веществами, могут быть исправлены защитными механизмами клетки - системами репарации повреждений. Если же клетка дефектна по какому-либо пути репарации, то она чувствительнее к ДНК-повреждающему действию различных веществ, чем клетка с неповрежденной системой репарации. На этом и основан так называемый Rec-тест.
SOS-индуцирующий эффект гомосеринлактона изучали в SOS-хромотесте [11]. SOS-хромотест является дешевым высокоэффективным средством для определения мутагенной и канцерогенной активности практически любых ве-
Табл. 1
Штаммы микроорганизмов, используемые в работе
Штамм Генотип Источник
Salmonella typhimurium TA 100 His G46, rfa, uvr-, pkm 101, bio- НИИ по БИХС г. Купавна
Escherichia. coli WP Trp E- Институт общей генетики, г. Москва
E. colipolÄ- Trp 65, sul, mal B, pol A1 Институт общей генетики, г. Москва
E. coli uvrA- Trp 65, sul, uvr A 155 Институт общей генетики, г. Москва
E. coli recA- Trp-65, rec A Институт общей генетики, г. Москва
E. coli PQ 37 Sfi A::mud (Ap lac) cts, lac A U169, mat, uvr A, gal Y, pho C, rfa Институт им. Л. Пастера г. Париж
ществ и соединений как органической, так и неорганической природы. Он позволяет оценить как ДНК-повреждающую активность вещества, так и вклад ошибочной репарации в общий мутагенез.
Генотоксический эффект по отношению к эукариотам оценивали в микроядерном тесте на эритроцитах периферической крови мышей in vivo. Суть микроядерного теста заключается в выявлении и количественной оценке потенциальной цитогенетической активности исследуемого соединения в полихрома-тофильных эритроцитах периферической крови млекопитающих. Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами. Спонтанная частота таких клеток составляет 0.2-0.3% [12]. Животным внутрибрюшинно делали инъекции тестируемого соединения в различных концентрациях из расчета 0.05 мл водного раствора вещества на 1 г веса животного. В качестве негативного контроля вводили растворитель. Через 24, 48, 72 ч после введения брали образцы крови из хвостовой вены животного, мазки на предметном стекле фиксировали метанолом (3-5 мин.) и выдерживали в красителе Романовского -Гимза 30-40 мин. В каждом препарате анализировали 1000-2000 нормохром-ных эритроцитов [12]. Для необработанных животных характерно наличие 1-2 микроядра-содержащих клеток на 1000 нормохромных эритроцитов. Достоверное превышение этого показателя служило индикатором цитогенетической активности исследуемого вещества.
Математическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы "Microsoft Excel".
2. Результаты и обсуждение
В ходе работы было показано, что гомосеринлактон не обладает токсическими эффектами ни в одной из исследуемых концентраций (табл. 2).
Установлено, что превышение числа индуцируемых гомосеринлактоном ревертантов по сравнению с контролем в концентрациях 1, 10, 100, 1000 мкг/мл составляет, соответственно, 0.85; 1.38; 1.82; 0.97. Так как число колоний-ревер-
Табл. 2
Токсические эффекты гомосеринлактона
Концентрация гомосеринлактона, мкг/мл Контроль 10 100 500 1000
Число колоний на чашку Петри 48±3 54±6 46±5 57±6 60±6
о н о S
90
J 60
о
£ й н
Ос О Я о
Ос
30
10
100
1000
0
1
К
Рис. 1. Число ревертантов S. typhimurium TA 100, индуцированных гомосеринлактоном. К - негативный контроль без вещества. Величина разброса в среднем составляет ±7%
тантов в опыте и контроле различаются менее чем в 2.5 раза, то можно считать, что мутагенной активности не выявлено (рис. 1).
В тесте на повреждение ДНК гомосеринлактон не проявил ни токсического, ни генотоксического (прямого ДНК-повреждающего) действия, что было показано по полному отсутствию зоны лизиса как на диком, так и на мутант-ных штаммах E. coli. Фактор индукции SOS-ответа для гомосеринлактона в концентрациях от 10 до 100 мкг/мл был значительно ниже порогового значения, что также указывает на отсутствие генотоксических свойств этого препарата (рис. 2).
Генотоксический эффект гомосеринлактона по отношению к клеткам эука-риот оценивали по превышению числа микроядер в опытном варианте по отношению к контролю в микроядерном тесте на эритроцитах периферической крови мышей in vivo. Гомосеринлактон не индуцировал микроядра в эритроцитах периферической крови мышей ни в одной из исследуемых концентраций в течение 72 ч. Можно заключить, что гомосеринлактон, являющийся микробным сигнальным агентом системы «кворум-эффект», не вызывает повреждения ДНК прокариот и не проявляет мутагенных эффектов.
Ранее было показано, что ауторегуляторные факторы микроорганизмов группы алкилрезорцинов по-разному проявляли себя по отношению к микроорганизмам. Так, по данным, полученным нами ранее, пара-2-гидроксиэтилфе-нол - ауторегуляторный фактор дрожжей и метилрезорцин не обладали токсической и мутагенной активностью по отношению к ряду бактерий [7, 8], в то время как аналог бактериального аутоиндуктора гипометаболического состоя-
2.5 2
ч 1 5
<u
У=" 1 0.5 0
о
5
0 0
Концентрация, мкг/мл
_0 ш
о г
о р
о
Рис. 2. Величина фактора индукции SOS-ответа гомосеринлактоном. Величина разброса в среднем составляет ±6%
ния гексилрезорцин проявил себя как истинный генотоксикант, вызывающий мутагенный эффект даже в нетоксичных концентрациях [7-9]. Однако из описанных ауторегуляторов только гексилрезорцин обладал способностью ускорять переход ряда бактерий в состояние гипометаболизма [13, 14], что, вероятно, непосредственно связано с воздействием молекулы ауторегулятора на геном микробной клетки [7, 8].
Гомосеринлактон также индуцировал ранний переход в гипометаболиче-ское состояние некоторых бактерий, в частности, дефектного по спорообразованию мутантного штамма Bacillus subtilis spo0E [6]. Тем не менее, учитывая полученные данные о том, что микробный сигнальный агент гомосеринлактон в исследованном спектре концентраций токсических, мутагенных и прямых ДНК-повреждающих эффектов в тестах на про- и эукариотах не проявил, можно заключить, что регуляция метаболического статуса исследуемым соединением обусловлена взаимодействием с белками, в частности, с активаторами (LuxR, AinR, Nod, OccR) и ингибиторами (LuxO) транскрипции, характерными для плотностно-зависимых генетических систем микроорганизмов [15], а не с нуклеиновыми кислотами. Особенно важно, что регуляторные свойства гомо-серинлактона не связаны с геном-повреждающим действием, а реализуются в ходе каскада опосредованных реакций. Таким образом, гомосеринлактон не является прямым индуктором генотипической изменчивости популяции микроорганизмов, но может опосредованно участвовать в этом процессе.
Работа выполнена в рамках программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (РНП 2.1.1.1005).
Summary
A.B. Margulis, O.V. Bushmanova, I.V. Ozhiganova, A.I. Kolpakov, O.N. Ilinskaya. Geno-toxic effects of microbial signal agent - homoserine lactone.
It was shown, that microbial signal agent homoserine lactone doesn't have toxic and genotoxic effects to pro- and eucariotic organisms at concentrations from 1 to 1000 mkg/ml.
Литература
1. Мулюкин А.Л. Образование покоящихся форм у неспорообразующих микроорганизмов: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 1998. - 26 с.
2. Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.И., Светличный В.А., Козлова А.Н., Дуда В.И., Ка-прельянц А.С., Помазанов В.В. О химической природе ауторегуляторного фактора d Pseudomonas carboxydoflava // Микробиология. - 1985. - Т. 54, Вып. 2. - С. 186190.
3. Гальченко В.Ф. Микробный анабиоз: Индукция и механизм образования покоящихся форм у неспоровых метанотрофных бактерий. - М.: Ин-т микробиологии РАН, 1997.
4. Salmond G.P.C. Bycroft B.W., Stewart C.S.A.B., Williams P. The bacterial "enigma": cracking the code of cell-cell communication // Mol. Microbiol. - 1995. - V. 16, No 4. -P. 615-624.
5. Gray K.M. Intercellular communication and group behavior in bacteria // Trends Microbiol. - 1997. - V. 5, No 5. - P. 184-188.
6. Маргулис А.Б., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Муфер К. Индукция гипометаболи-ческих форм у неспорообразующих грамположительных бактерий // Уч. зап. Казан. ун-та. Сер. Естественные науки. - 2005. - Т. 147, Кн. 2. - С. 108-114.
7. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Зеленихин П.В., Круглова З.Ф., Чойдаш Б., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л., Эль-Регистан Г.И. Влияние аутоиндукторов анабиоза бактерий на геном микробной клетки // Микробиология. - 2002. - Т. 71, № 2. -С. 164-168.
8. Маргулис А.Б., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Эль-Регистан Г.И. Индукция SOS-ответа клетки под действием ауторегуляторных факторов микроорганизмов // Генетика. - 2003. - Т. 39, № 9. - С. 1180-1184.
9. , Ожиганова И.В., Бушманова О.В., Колпаков А.И., Ильинская О.Н. Гексилрезор-цин как индуктор микроядер в полихроматофильных эритроцитах периферической крови мышей // Генетика. - 2005. - Т. 41, № 8. - С. 1045-1048.
10. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Бобринев Е.В. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем. Метод. указания. - М., 1985. - 34 с.
11. Ильинская О.Н., Маргулис А.Б. Краткосрочные тест-системы для определения ге-нотоксичности. Метод. рук. - Казань: Изд-во Казан. ун-та, 2005. -31 с.
12. Heddle J.A., Cimino M.C., Hayashi M. Micronucli as an index of citogenetic damage: past, present and future // Environ. Mol. Mutagen. - 1991. - V. 18. - P. 277-291.
13. Маргулис А.Б., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Эль-Регистан Г.И. Гексилрезорцин ускоряет образование гипометаболических форм бактерий в условиях голодания // Тр. Объединенной междунар. научн. конф. «Новая геометрия природы», Казань, 25 авг. - 5 сент. 2003 г. - Казань, 2003. - Т. 2. Биология. Медицина. - С. 219-225.
14. Маргулис А.Б. Бушманова О.В., Ожиганова И.В., Колпаков А.И., Ильинская О.Н. Адаптивный ответ стафилококков на действие микробных факторов индукции анабиоза // Вестник ТО РЭА. - Казань, 2004. - № 1. - С. 41-44.
15. Rosemeyer V., Michiels J., Verreth C., Vanderleyden J. Lux I- and luxR-homologous genes of Rhizobium etli CNPAF512 contribute to synthesis of autoinducer molecules and nodulation of Phaseolus vulgaris // J. Bacteriol. - 1998. - V. 180, No 4. - P. 815-821.
Поступила в редакцию 13.12.05
Маргулис Анна Борисовна - младший научный сотрудник НИЛ ББФ Казанского государственного университета.
E-mail: Anna.Margulis@ksu.ru
Бушманова Ольга Владимировна - студент кафедры микробиологии Казанского государственного университета.
E-mail: olechka@kzn.ru
Ожиганова Ирина Владимировна - студент кафедры микробиологии Казанского государственного университета.
E-mail: OIrina@yandex.ru
Колпаков Алексей Иванович - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, заведующий НИЛ ББФ
E-mail: Alexei.Kolpakov@ksu.ru
Ильинская Ольга Николаевна - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии Казанского государственного университета.
E-mail: Olga.Ilinskaya@ksu.ru
