CC BY
31
УДК 616.94-022.7:579.841.11]-022.369-078
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ В КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ ГОСПИТАЛЬНОГО СЕПСИСА, АССОЦИИРОВАННОГО С PSEUDOMONAS AERUGINOSA, В ИНФЕКЦИОННОМ СТАЦИОНАРЕ
М. В. Кузнецова, Т. И. Карпунина, А. Ю. Максимов, В. А. Демаков, C. Б. Ляпустин
Международные и отечественные многоцентровые исследования обозначили ведущую роль P. aeruginosa в качестве возбудителя нозокомиальных инфекций, что, в основном, связывается с формированием множественной устойчивости к антибактериальным препаратам, в том числе и к антисинегнойным. Особую актуальность в случае инфекции, вызванной этими микроорганизмами, определяет тот факт, что летальность при их участии увеличивается до 75% [2, 15]. В этой связи все чаще в литературе стал обсуждаться вопрос о наличии атрибутивной (дополнительной) летальности при госпитальных инфекциях, вызванных P. aeruginosa [6, 13].
В условиях инфекционного стационара проблема усугубляется тем, что проявления внутрибольничной инфекции (ВБИ) маскируются воспалительной симптоматикой основного заболевания, послужившего поводом для госпитализации. Более того, связывая вторичный процесс с синегнойной инфекцией, нельзя не учитывать убиквитар-ность P. aeruginosa и распространенность колонизации пациентов этими микроорганизмом. У значительной части больных (до 26,9%), поступающих в стационар, данные бактерии присутствуют в составе транзитор-ной нормофлоры, обладая зачастую спектром антибиотикорезистентности, сходным с госпитальными штаммами [6]. В то же время о принадлежности к нозокомиальным инфекциям судят по устойчивости бактерий
к антибактериальным и дезинфицирующим средствам. Поэтому именно в инфекционных стационарах выявление таких возбудителей ВБИ представляет собой наиболее сложную задачу и требует нетрадиционных подходов к ее решению. Представляется, что для подтверждения госпитальной природы изолируемых бактериальных культур, их этиологической значимости, в особенности в случае летального исхода, молекулярно-генетические методы исследования могут быть приоритетными. С помощью методов генотипирования штаммов P. aeruginosa, выделенных из разных биотопов и очагов инфекции, можно определить путь колонизации/инфицирования пациентов (перекрестный перенос из экзогенных источников или эндогенных локусов), иначе говоря, установить эпидемические связи, подтвердить или исключить природу внутриболь-ничного заражения [10].
Цель данного исследования — изучение случаев госпитального сепсиса, ассоциированного с P. aeruginosa, и оценка значимости ПЦР-анализа в определении нозоко-миальной природы штаммов, изолируемых от больных в инфекционном стационаре.
Материалы и методы
Проанализированы истории болезни и данные патологоанатомической экспертизы двух человек, умерших в ОРИТ краевой ин-
фекционной больницы. Проведено микробиологическое и молекулярно-генетическое исследование культур P. aeruginosa, выделенных от пациентов с разными основными заболеваниями этого инфекционного стационара. Идентификацию бактерий проводили согласно нормативным документам, регламентирующим работу бактериологических лабораторий. Антибиоти-корезистентность определяли стандартным диско-диффузионным методом. Определена чувствительность к 7 антибиотикам, постоянно используемым в данном стационаре, в том числе к антисинегнойным.
Тотальную ДНК выделяли фенольным методом [3]. Генетическое типирование штаммов осуществляли посредством поли-меразной цепной реакции с праймером М13 (RAPD-PCR). Амплификацию ДНК проводили с применением термостабильной Taq-полимеразы производства ООО «СибЭн-зим» (г. Новосибирск) на термоциклере Т3 («Biometra», Германия). Праймер М13 был синтезирован ООО «Евроген» (г. Москва). Режим амплификации включал: начальный цикл денатурации — 1 мин при 94°С; 35 циклов по схеме: денатурация 94°С — 20 с; отжиг 50°С — 60 с; синтез 72°С — 60 с; завершающий цикл 5 мин при 72°С. Электрофоретиче-ское разделение продуктов реакции проводили в 1,2% агарозном геле в трисборатном буфере при напряженности электрического поля 6 В/см. Визуализацию полос и документирование данных осуществляли после окрашивания геля бромистым этидием с использованием системы гельдокументации «BioDocAnalyze» («Biometra», Германия).
Результаты и обсуждение
В период с 27.08.2006 г. по 10.09.2006 г. в отделении реанимации и интенсивной терапии краевой клинической инфекционной больницы было зафиксировано два леталь-
ных исхода. При анализе их причин возникал вопрос об атрибутивной летальности, поскольку при доминировании признаков тяжелых вирусных инфекций — вирусный гепатит (больной Б.) и клещевой энцефалит (больной Г.) — из материала больных (крови и кала) были выделены культуры P. aeruginosa. На секции в обоих случаях зарегистрированы признаки полиорганной недостаточности, характерной для септического состояния. Это послужило основанием считать сине-гнойную палочку наиболее вероятной причиной сепсиса, возможно, ставшего решающим фактором, обусловившим гибель пациентов. Оба пациента находились в ОРИТ в одни и те же сроки более 48 часов, что давало повод заподозрить внутрибольничное инфицирование.
Наблюдение 1: больной Г. 52 лет, находился в ОРИТ ККИБ с 11.06.2006 г. по 10.09.2006 г. с диагнозом: клещевой энцефалит, менингоэнцефалополиомиелитическая форма, тяжелое течение. С 07.08.2006 г. — состояние очень тяжелое. Сумма баллов по шкале Глазго — 3. Кома 3-й степени — вегетативное состояние. Общая мышечная гипотрофия. Нарушение трофики тканей с образованием множественных мацераций и пролежней в местах давления: на бедрах, крестце, лопатках, голове, ушах, локтях, лодыжках, без явных признаков эпителизации. Пастозность лица, дистальных отделов конечностей. Продленная ИВЛ без признаков гипоксии. Умеренные явления гнойного тра-хеобронхита.
За время наблюдения, несмотря на проводимое лечение, сохранялся стойкий неврологический дефицит в виде атонической комы 3-й степени без положительной неврологической динамики. Появились осложнения продленной ИВЛ, пролежни, нутритивная недостаточность. Неоднократно отмечались подъемы температуры тела до фебрильных цифр, лейкоцитоз периферической крови
и увеличение процента незрелых нейтро-филов. В течение всего периода пребывания в ОРИТ проводилась антибактериальная терапия, включавшая ß-лактамные антибиотики, аминогликозиды и линкомицин. 10.09.2006 г. на фоне нестабильной гемодинамики зафиксирована остановка кровообращения. Реанимационные мероприятия не проводились ввиду некурабельности больного. При исследовании кала от 08.09.2006 г. однократно была выделена культура P. aeruginosa.
При патологоанатомическом вскрытии выявлены отек-набухание ткани головного мозга, гнойно-деструктивная пневмония, множественные пролежни, септическая гиперплазия селезенки, интерстициальный миокардит, кахексия. Смерть больного Г., страдавшего тяжелой формой клещевого энцефалита, наступила от полиорганной недостаточности на фоне отека-набухания головного мозга.
Наблюдение 2: больной Б. 17 лет, находился на лечении в ОРИТ ККИБ с 10.08.2006 г. по 27.08.2006 г. с диагнозом: вирусный гепатит А (аВГА IgM+), острый, тяжелое течение. Показанием к переводу в ОРИТ был низкий протромбиновый индекс (30%).
В ОРИТ нарастала желтуха, сохранялся выраженный синдром цитолиза, отмечены ранние признаки печеночной энцефалопатии (инверсия сна, тремор, легкое нарушение координаторных проб). С 24.08.2006 г. появилась фебрильная лихорадка. 26.08.2006 г. — рентгенологическая картина правосторонней пневмонии, расширение границ сердца, нестабильность гемодинамики. С 27.08.2006 г.— нарушение сознания, судорожный синдром, был переведен на продленную ИВЛ, зафиксирована остановка кровообращения. Реанимационные мероприятия без эффекта. При исследовании крови на стерильность из двух порций выделена P. aeruginosa.
При патологоанатомическом вскрытии были выявлены признаки острого вирусного гепатита на фоне хронического гепатита с исходом в цирроз типа неполного септаль-ного фиброза, спленомегалия, гипоплазия костного мозга, ДВС-синдром, двусторонняя серозно-геморрагическая пневмония, се-розно-гнойный менингит, катарально-некро-тический энтероколит, язвенно-некротический эзофагит, отек легких, множественные кровоизлияния в мягкой мозговой оболочке, ткани легких, мозговом слое надпочечников, тяжелая степень паренхиматозной дистрофии миокарда, «шоковые» почки. Смерть больного Б., страдавшего острым вирусным гепатитом А на фоне хронического гепатита неуточненной этиологии, осложнившимся миелотоксической гипоплазией костного мозга, наступила от синегнойного сепсиса при явлении отека легких.
В период с 10.08.2006 г. по 27.08.2006 г. больные Г. и Б. находились в одном реанимационном боксе, что позволило предположить инфицирование обоих одним и тем же штаммом P. aeruginosa. В эти же сроки в ККИБ наблюдались и другие пациенты, у которых из разных материалов (отделяемое трофических язв, кровь) выделялась сине-гнойная палочка. В частности, у больной К., проходившей лечение по поводу рожистого воспаления левой голени, P. aeruginosa была выделена из отделяемого язвы и из крови. 14.09.2006 г. больная переведена в хирургическое отделение МСЧ № 1 с диагнозом: сепсис, вызванный P. aeruginosa, средней степени тяжести.
Углубленное бактериологическое изучение изолированных культур P. aeruginosa позволило установить следующее. Изоляты от умерших обладали практически идентичными культуральными свойствами, но гемокуль-туры проявляли более выраженную гемолитическую и фосфолипазную активность. Штаммы характеризовались сходством анти-
Таблица 1
Антибиотикочувствительность клинических изолятов P. aeruginosa
Антибиотики Больной Г. Больной Б. Больная К.
S I R S I R S I R
Цефтазидим + + +
Цефепим + + +
Гентамицин + + +
Амикацин + + +
Ампициллин + + +
Ципрофлоксацин + + +
Имипенем + + +
биотикограмм (табл. 1), в том числе в отношении препаратов, регулярно используемых в данном стационаре. Однако один из них сохранял чувствительность к гентамицину, что нехарактерно для большинства стационаров России, а другой проявлял резистентность к цефтазидиму и ципрофлоксацину, к которым в последние годы отмечается существенное нарастание устойчивости у штаммов P. aeruginosa [1, 5, 7]. Примечательно, что штамм, изолированный из крови больной К., характеризовался сходными свойствами с культурой, выделенной от больного вирусным гепатитом, отличаясь лишь степенью чувствительности к гентамицину и ципрофлоксацину.
Несмотря на сходство биологических характеристик штаммов P. aeruginosa, дающее повод считать их внутрибольничными, установить источник, резервуар и возможные пути передачи синегнойной инфекции в отделении не удалось. Между тем, ранее показано, что среди изолятов в лечебно-профилактических учреждениях единовременно могут присутствовать различные штаммы одного вида [11, 14, 16]. В этой связи важной клинической и эпидемиологической задачей явилось определение генотипа раз-
личных штаммов синегнойной палочки, изолированных в ограниченный период времени в одном и том же отделении. Такой подход представляется наиболее целесообразным, поскольку при фенотипическом сходстве установить биологическую вариабельность или идентичность этиопатогенов другим способом не представляется возможным. В таких случаях предпочтение отдается поли-меразной цепной реакции, которая не только широко используется для диагностики и идентификации, но и позволяет проводить субвидовое типирование и анализ генетического родства (клональности) выделенных штаммов микроорганизмов [10]. По сравнению с традиционными фенотипическими методами (био-, фаго- и серотипированием) генотипирование на основе ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем дифференциации, возможностью использования количественных методов для оценки идентичности штаммов и высокой воспроизводимостью [4].
Для подтверждения нозокомиальной природы изолированных нами бактериальных культур был применен метод RAPD-PCR. Выбор этого метода продиктован возможностью с его помощью оценить степень ге-
нетического родства исследуемых штаммов на основе сравнительного анализа, проводимого путем сопоставления количества и размера амплифицированных фрагментов индивидуальных электрофоретических профилей. Об изолятах, чьи профили типирова-ния неотличимы, дается информация о том, что они представляют собой единственный штамм. Варианты, отличающиеся от модального профиля на 3 и более полос, считаются генетически отличными [10].
Путем сопоставления электрофоретиче-ских профилей нами установлено, что три RAPD-спектра изученных образцов были идентичны (рис. 1). Штамм P. aeruginosa, выделенный от больной К., имеет другой генотип и, несмотря на фенотипическое сходство, скорее всего не является нозокомиальным.
— 1 т. п. н.
1 2 3 М
Рис. 1. Электрофоретический анализ продуктовЕАРй-РСЯ с использованием праймера М13: М — маркер молекулярной массы; изоляты, выделенные от больных: 1 — больной Г, 2 — больной Б, 3 — больная К.
Заключение
Актуальность проблемы ВБИ связана с постоянно возрастающим количеством заболеваний, включая сепсис и септический шок, вызванных внутрибольничными полирезистентными штаммами, и высоким уровнем летальности [2, 11]. В настоящее время сложилась система, по которой о госпитальном штамме судят по спектру устойчивости к антибиотикам. Это удобная и доступная в практических условиях система контроля формирования госпитального штамма возбудителями ВБИ [12]. Однако в инфекционных стационарах специфику развития госпитальной инфекции определяет ряд факторов: возникновение на фоне клинически выраженной «догоспитальной» инфекции, для лечения которой широко используются антимикробные препараты; наиболее строгий санитарно-эпидемиологический режим, требующий регулярного использования дезинфицирующих средств. В таких особых условиях формирование и циркуляция госпитальных штаммов могут отличаться от аналогичных процессов в неинфекционных отделениях. Под влиянием перечисленных, а, возможно, и иных эпидемиологически значимых факторов, с одной стороны, одни и те же штаммы могут приобретать фенотипические различия, с другой — культуры одного вида, но имеющие различное происхождение, могут проявлять сходные биологические свойства. Более того, вполне вероятны возникновение и персис-тенция некультивируемых форм бактерий [8], что не позволяет установить источник, резервуар и путь передачи инфекции. Описанные нами клинические случаи со смертельными исходами, зарегистрированными в одном и том же отделении в одни и те же сроки, хотя и не дают основание говорить о вспышке синегнойной инфекции, но заставляют поставить вопрос о существо-
вании атрибутивной летальности при ВБИ, ассоциированных с P. aeruginosa, в инфекционном стационаре.
Наши наблюдения позволяют акцентировать внимание на том, что по крайней мере в условиях инфекционного стационара должно стать обязательным использование комплексного подхода с включением как классических микробиологических, так и современных молекулярно-генотипических методов. Более того, в специализированных инфекционных отделениях при исследовании смывов также считаем целесообразным использование технологий, позволяющих обнаруживать и типировать генетические маркеры традиционных возбудителей ВБИ.
Несмотря на описанные в литературе недостатки RAPD-PCR (низкая воспроизводимость результатов, обусловленная повышенной чувствительностью к условиям реакции), данный тест, с учетом фенотипических, клинических и эпидемиологических данных, может быть использован как экспресс-метод выявления генетического полиморфизма [9]. Мы солидарны с мнением И. А. Шагинян, что простота выполнения RAPD-анализа и его невысокая стоимость делают его приоритетным для локальных эпидемиологических исследований любых штаммов микроорганизмов, в том числе рода Pseudomonas [10].
Библиографический список
1. ^ame Д. В. Чувствительность к антибиотикам Pseudomonas aeruginosa, выделенным при внутрибольничных инфекциях/ Д. В. ^ame^//Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2006.— № 5.— С. 32— 36.
2. Kapa6aK В. И. Микробиологический мониторинг за возбудителями нозокомиальных инфекций (на примере отделений реанимации и интенсивной терапии)/В. И. Ka-рaбaк//Антибиотики и химиотерапия.— 2000.— № 3.— С. 20—22.
3. Клонирование ДНК. Методы/Пер. с англ.; под ред. Д. Гловера,- М.: Мир, 1988.538 с.
4. Лопухов Л. В, Эйдельштейн М. В. По-лимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике/ Л. В. Лопухов, М. В. ЭйдельштейН///КМАХ.— 2000.— Т. 2.- № 3.- С. 96-100.
5. Решедько Г. К, Рябкова Е. Л, Фара-щук А. Н, Страчунский Л. С. Нефермен-тирующие грамотрицательные возбудители нозокомиальных инфекций в ОРИТ России: проблемы антибиотикорези-стентности/Г К. Решедько, Е. Л. Рябкова, А. Н. Фаращук, Л. С. Страчунский//КМАХ.— 2006.- Т. 8.— № 3.— С. 243—259.
6. Руднов В. А. Современное клиническое значение синегнойной инфекции и возможности ее терапии у пациентов отделений реанимации/В. А. Руднов//Инфек-ции и антимикробная терапия.— 2002.— Т. 4.- № 6.- С. 170-177.
7. Сидоренко С. В, Резван С. П., Еремина С. В. и др. Этиология тяжелых госпитальных инфекций в отделениях реанимации и антибиотикорезистентность среди их возбудителей/С. В. Сидоренко, С. П. Рез-ван, С. В. Еремина и др.//Антибиотики и химиотерапия.— 2005.— Т. 50.— № 2—3.— С. 33-41.
8. Соколенко А. В., Мухина Т. Н. Сравнительная характеристика некоторых форм выживания патогенных бактерий/А. В. Со-коленко, Т. Н. Мухина//Эпидемиология и инфекционные болезни.— 2006.— № 3. - С. 54-58.
9. Сулимова Г. Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения/ Г. Е. Сулимова//ИОГен им. Н. И. Вавилова РАН. Лаборатория сравнительной генетики животных. Электронный журнал. Вып. 1. http://lab-cga.ru/articles/Jornal01/ Statia1.htm.
10. Шагинян И. А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничной инфекции/И. А. Шагинян//КМАХ— 2000.- Т. 2.— № 3.— С. 82—95.
11. Шагинян И. А, Чернуха М. Ю. Нефермен-тирующие грамотрицательные бактерии в этиологии внутрибольничных инфекций: клинические, микробиологические и эпидемиологические особенности/ И. А. Шагинян, М. Ю. Чернуха//КМАХ— 2005.— Т. 7— № 3.— С. 271—285.
12. Эпидемиология/Под ред. Л. П. Зуевой, Р. Х Яфаева.— СПб.: ООО «Издательство «Фолиант», 2005.— 752 с.
13. Fine M. J. Prognosis and outcomes of patients with community-acquired pneumonia: a meta-analysis/M. J. Fine, M. A. Smith, С. А. Carson//JAMA.— 1996.— Vol. 275— Р. 134—141.
14. Maslow J. N, Brecher S, Durbin A. et al. Diversity among strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) from patients with long-term colonization/ J. N. Maslow, S. Brecher, A. Durbin et al.// Proceedings of Annual Meeting of American Infectious Disease Society.— 1993.— abstract 143.
15. Osmon S, Ward S, Fraser V. J, Kol-lef M. N. Hospital mortality for patients with bacteremia due to Staphylococcus aureus or Pseudomonas аeruginosa/S. Osmon, S. Ward, V. J. Fraser, M N. Kollef//Chest— 2004— Vol. 125.— P. 607—616.
16. Zаrbeit R D., Arthur M., Dunn R. D. et al. Resolution of recent evolutionary diver-
gence among Escherichia coli from related lineages: the application of pulsed field electrophoresis to molecular epidemiology/R. D. Zаrbeit, M. Arthur, R. D. Dunn et al.//J. Infect. Dis.— 1990.— Vol. 161.— P. 230—235.
M. V. Kuznetsova, T. I. Karpunina, A. Yu. Maksimov, V. A. Demakov, S. B. Lyapustin
GENETIC TYPING IN CLINICOEPIDEMIOLOGICAL ANALYSIS OF HOSPITAL SEPSIS ASSOCIATED WITH PSEUDOMONAS AERUGINOSA IN INFECTIOUS HOSPITAL
Two cases of hospital sepsis with lethal outcome at Regional Infectious Hospital were studied. Microbiological and molecular-genetic (RAPD-PCR method) analysis of P. aeruginosa strain isolated from patients with different viral diseases that caused hospitalization was performed. Significance of PCR-analysis in determination of nosocomial nature of the strains isolated from patients at infectious hospital was estimated.
Keywords: nosocomial sepsis, Pseudomonas aeruginosа, genetic typing.
Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е. А. Вагнера, Краевая клиническая инфекционная больница,
г. Пермь,
Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь Материал поступил в редакцию 05.08.2008
