CC BY
36
Генотипический анализ нозокомиальных штаммов Acinetobacter baumannii
А.П. Соломенный1, Н.А. Зубарева2, А.Е. Гончаров3
1ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Пермь, Россия 2ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера» Минздрава России, Пермь, Россия
3ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия
В статье обсуждается проблема генотипи-ческого разнообразия бактерий Acinetobacter baumannii, выделенных от пациентов с различными инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи (ИСМП). Показано, что доминирующие в исследуемом регионе кар-бапенемоустойчивые штаммы возбудителя относятся к эпидемической клональной линии II и несут в своем геноме интегроны 1-го класса. Доля интегрон-позитивных изолятов при
ИСМП может быть весьма информативным показателем, характеризующим госпитальную популяцию A. baumannii. Установлено, что гены (генные кассеты) в составе интегронов определяют резистентность к аминогликозидам, но не карбапенемам.
Ключевые слова: инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи, Acinetobacter baumannii, резистентность, интегрон, карбапе-немы, аминогликозиды.
Genotyping Analysis of Nosocomial Acinetobacter baumannii Strains
A.P. Solomenniy1, N.A. Zubareva2, A.E. Goncharov3
1 Institute of Microorganisms Ecology and Genetics, Perm, Russia
2 Perm State Medical University named after E.A. Vagner, Perm, Russia
3 North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov, Saint-Petersburg, Russia
The problem of genotypic variety of Acinetobacter baumannii isolated from patients with healthcare associated infections (HCAIs) are discussed. Carbapenem-resistant strains, which are predominant in the study region, were shown to belong to the epidemic clonal line II and carry 1st class integron in their genome. Fraction of integron-positive isolates in HCAIs may be an indicator of
nosocomial population of A. baumannii. The genes (gene cassettes) of integrons determine resistance to aminogly-cosides, but not carbapenems.
Key words: healthcare associated infections, Acinetobacter baumannii, resistance, integron, car-bapenems, aminoglycosides.
Контактный адрес:
Александр Петрович Соломенный
Эл. почта: solomen@iegm.ru
Вхождение Acinetobacter baumannii в верхнюю часть списка возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), во многом объясняется формированием и географическим распространением генетически четко дифференцируемых эпидемических типов — клональных линий. Было показано, что эпидемические штаммы отличаются друг от друга характерным набором мобилизуемых элементов генома [1]. В России и за рубежом описан лекарственно-устойчивый (но кар-бапенемочувствительный) эпидемический штамм A. baumannii с интегроном 1-го класса, где ассоциированные генные кассеты определяют высокий уровень резистентности к аминогликозидам [2]. Известно, что карбапенемоустойчивость также может определяться наличием в геноме интегро-нов [3].
В 2004 г. в медицинских учреждениях г. Перми нами были обнаружены экстремально резистентные штаммы Acinetobacter baumannii (в том числе устойчивые к карбапенемам). При последующем мониторинговом исследовании, проведенном в 2010-2012 гг., выявлено превалирование интег-рон-позитивных штаммов. Доминировавший в регионе исследования штамм A. baumannii 60регт был изучен молекулярно-генетическими методами, наличие интегрона подтверждено данными полногеномного секвенирования ^епВапк асс. по AUZL00000000.1.) [4].
С точки зрения практического инфекционного контроля и сдерживания распространения антиби-отикорезистентности представляет интерес оценка возможности укоренения и длительной циркуляции в стационарах географического региона отдельных эпидемических генотипов ацинетобактеров. В связи с этим мы посчитали необходимым провести в 2014 году очередное мониторинговое исследование распространенности интегрон-позитивных штаммов A. baumannii, сопоставить полученные результаты с данными предыдущих исследований и сравнить выделенные интегрон-позитивные культуры со штаммами известных международных эпидемических клональных линий, используя методы молекулярно-генетического типирования.
Материал и методы
С целью идентификации интегронов 1-го класса были изучены 42 последовательные, неповторяющиеся, лекарственно-устойчивые изоляты A. baumannii, которые были выделены из крови, раневого отделяемого и бронхоальвеолярного лава-жа пациентов, лечившихся в отделениях реанимации четырех многопрофильных стационаров г. Перми в январе-мае 2014 года.
Хемотаксономическая идентификация проведена с использованием общепринятых тестов, а также теста на способность поддерживать рост при температуре 44 °C [5]. Лекарственная устойчивость определялась диско-диффузионным методом на агаре Мюллера-Хинтон с использованием дисков Becton Dickinson (США) в соответствии с методическими указаниями МУК 4.2.1890-04 [6].
Бактериальную ДНК получали методом «горячего лизиса» клеточной суспензии при 95°С с последующей очисткой высокоскоростным центрифугированием. При генетическом типирова-нии использовали метод многолокусного анализа вариабельных тандемных повторов, известный как MLVA-типирование. MLVA-анализ по восьми хромосомным локусам выполнен в соответствии с методикой, разработанной C. Pourcel и соавт. [7], причем локусы Abaum_0826, Abaum_3002, Abaum_3406, Abaum_3468 и Abaum_3530 были выбраны вследствие наличия высококонсервативных генов синтеза клеточной стенки. Гармонизация данных и кластерный анализ (Dice, UPGMA) были выполнены с построением дендрограммы при помощи программного обеспечения, размещенного по URL-адресу http://insilico.ehu.es/dice_upgma. Данные MLVA-типирования штамма A. baumannii 60perm были использованы для сопоставления.
Реакции амплификации (ПЦР) для определения интегрон-ассоциированных генов выполнялись согласно опубликованной ранее схеме [8]. Генные кассеты микробной устойчивости были ампли-фицированы с помощью праймеров и в условиях, описанных P.A. White и соавт. [9], с авторскими модификациями. Реагенты для проведения ПЦР получены от компании «СибЭнзим» (Россия).
Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК (на прямой и обратной цепях) проведено с помощью автоматического генетического анализатора Genetic analyzer 3500XL (Applied Biosystems) с использованием реагентов и в условиях, рекомендованных производителем.
Результаты и обсуждение
Среди 42 выделенных изолятов A. baumannii 40 (95,2%) были резистентны к карбапенемам.
Единственный интегрон-позитивный штамм A. baumannii 1609, устойчивый к карбапенемам, был выделен 17.01.2014 г. из раневого отделяемого пациента с тяжелой сочетанной травмой, осложненной развитием двусторонней пневмонии, инфекцией области хирургического вмешательства и тяжелого сепсиса.
Анализ филогенетического дерева, построенного на основе MLVA-типирования, позволил
отнести штамм 1609perm к эпидемической кло-нальной линии II с его кластеризацией в единой группе с карбапенеморезистентными штаммами 60perm и ACICU, который был выделен в 2005 году в ОРИТ госпиталя «Сан Джованни-Аддолората» (Рим, Италия, www.hsangiovanni.roma.it/home. aspx) (см. рисунок).
RUH875 -
RUH134 -
1609perm ---
ACICU - -
60perm RUH5875
I I I
0,1 0,2 0,3
Дендрограмма генетического сходства изученных штаммов A. baumannii, выполненная по методу UPGMA. Штаммы RUH875, RUH134 и RUH5875 являются корневыми для I, II и III эпидемических типов соответственно.
У штамма A. baumannii ACICU устойчивость к карбапенемам определяется двумя копиями гена b/aOXA-58 на трансмиссивной плазмиде. Устойчивость к карбапенемам штамма A. baumannii 60perm лишь в малой степени может быть обусловлена присутствием гена, кодирующего бета-лак-тамазу расширенного спектра b/aOXA-66. Однако карбапенеморезистентный фенотип штаммов 60perm и 1609perm, скорее всего, определяется множественными факторами, в том числе связанными с проницаемостью клеточной стенки, а также молекулярными механизмами, обеспечивающими эффлюкс. В геноме штаммов ACICU и 60perm в составе «островов резистентности» с интегрона-ми 1-го класса присутствуют гены, кодирующие аминогликозид-Ы-ацетилтрансферазы: aac-6' -lb у ACICU и aac(6')-I/ и aac(3)-I у 60perm. У штамма 1609perm в составе интегрона 1-го класса выявляются: генная кассета aac(3)-I и две открытые рамки считывания orfX и orfY в сопровождении кассеты aadAla, детерминирующей фенотип устойчивости лишь к стрептомицину и спектиномицину.
Доля интегрон-позитивных изолятов среди всех A. baumannii, выделенных в 2010-2012 гг., была достаточно высокой и составила 74,2%. По-видимому, это можно объяснить доминированием в указанный период определенного генотипа. Однако в 2014 году нами обнаружен единственный интегрон-позитивный изолят, что составило лишь 2,4% (95% ДИ=0,6-12,4) всей исследованной популяции.
Карбапенеморезистентные грамотрицательные бактерии являются в настоящее время наиболее проблемными возбудителями ИСМП с высоким уровнем летальности. Увеличение назначения кар-бапенемов и расширение применения их генериков достоверно коррелируют с ростом устойчивости к ним А. baumannii [10].
На наш взгляд, важно, что устойчивость к кар-бапенемам в локальной популяции A. baumannii сегодня не определяется наличием интегрона(ов) и других мобилизуемых структур. Вместе с тем, именно интегрон-позитивные штаммы особенно опасны в качестве возбудителей инфекции. В первую очередь, они способны акцептировать новые генные кассеты с образованием структур множественной лекарственной устойчивости. Кроме того, aac(3)-I-включающие интегроны находятся у A. baumannii на геномном острове AbaR5 [11]. Подобные участки генома с определенной видовой специфичностью известны и среди Salmonella enterica subsp. enterica, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa (данные полногеномного секвенирования согласно GenBank). Вставка в интегроны детерминант устойчивости к карбапенемам лишь ускорит мобилизацию и распространение таких генов.
Работа выполнена при поддержке Программы Президиума УрО РАН «Молекулярная и клеточная биология» (проект № 12-П-4-1046). Авторы выражают благодарность Н.С. Авдеевой, М.И. Еремеевой, М.Н. Муц, И.П. Новоселовой и С.В. Проворовой за выполнение бактериологических исследований, а также сотрудникам лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии ИЭГМ УрО РАН за автоматическое секвенирова-ние фрагментов ДНК.
Литература
1. Turton J.F., Baddal B., Perry C. Use of accessory genome for characterization and typing of Acinetobacter baumannii. J Clin Microbiol 2011; 49(4):1260-66.
2. Соломенный А.П., Максимов А.Ю., Саралов А.И., Яфаев Р.Х., Гончаров А.Е., Керопиан Е.А., Мултых И.Г. Появление интегрон-позитивного полирезистентного штамма Acinetobacter baumannii в российских стаци-
онарах. Журн микробиол эпидемиол иммунобиол 2008; 4:89-91.
3. Эйдельштейн М.В., Склеенова Е.Ю., Шевченко О.В. и соавт. Распространенность и молекулярная эпидемиология грамотрицательных бактерий, продуцирующих металло-/3-лактамазы (МБЛ), в России, Беларуси и Казахстане. Клин микробиол антимикроб химиотер 2012; 14(2):132-52.
4. Гончаров А.Е., Еремеева М.И., Зубарева Н.А., Соломенный А.П. Генотипический анализ карбапе-нем-устойчивого штамма Acinetobacter baumannii. Пермский медицинский журнал 2011; 6:95-9.
5. Towner K. The genus Acinetobacter. Prokariotes 2006; 6:746-58.
6. Методические указания МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». 2004.
7. Pourcel C., Minandri F., Hauck Y., et al. Identification of variable-number tandem-repeat (VNTR) sequences in Acinetobacter baumannii and interlaboratory validation
of an optimized multiple-locus VNTR analysis typing scheme. J Clin Microbiol 2011; 49(2):539-48.
8. Соломенный А.П., Зубарева Н.А., Гончаров А.Е., Сатосова Н.В., Крылов К.М. Мультиплексная ПЦР-диагностика интегронов резистентности возбудителей нозокомиальной инфекции. Инфекции в хирургии 2011; 3:26-27.
9. White P.A., McIver C.J., Deng Y.M., Rawlinson W.D. Characterisation of two new gene cassettes, aadA5 and dfrA17. S Microbiol Lett 2000; 182(2):265-69.
10. Ортенберг Э.А., Шафеева Ю.Э., Кирушок Г.И., Хохлявин Р.Л., Шень Н.П. Карбапенемы в многопрофильном стационаре: некоторые клинические и экономические аспекты. Клин микробиол антимикроб химиотер 2014; 16(1):33-8.
11. Post V., Hall R.M. AbaR, a large multiple-antibiotic resistance region found in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53(6):2667-71.
