ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА УСТОЙЧИВОСТИ К ПРОТИВОТУБЕРКУЛЁЗНЫМ ПРЕПАРАТАМ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ДЕТЕЙ

Хромова П.А.; Жданова С.Н.; Соловьёва Н.С.; Синьков В.В.; Машарский А.Э.; Вязовая А.А.; Мокроусов И.В.; Рычкова Л.В.; Колесникова Л.И.; Журавлев В.Ю.; Огарков О.Б.

клиническая лабораторная диагностика clinical laboratory diagnostics

генотипическая и фенотипическая характеристика устойчивости к противотуберкулёзным препаратам штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от детей

РЕЗЮМЕ

Хромова П.А. 1, Жданова С.Н. 1, Соловьёва Н.С. 2, Синьков В.В. 1, Машарский А.Э. 3, Вязовая А.А. 4, Мокроусов И.В. 4, Рычкова Л.В. 1, Колесникова Л.И. Журавлев В.Ю. 2, Огарков О.Б.1

1 ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» (664003, г. Иркутск,

ул. Тимирязева, 16, Россия)

2 ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Минздрава России (191036, г. Санкт-Петербург, Лиговский пр., 2-4, Россия)

3 Ресурсный центр «Центр Биобанк», Научный парк, ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет» (199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, Россия)

4 ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» (197101,

г. Санкт-Петербург, ул. Мира, 14, Россия)

Обоснование. По данным Всемирной организации здравоохранения, Российская Федерация остаётся в списке 30 стран с наиболее высоким бременем туберкулёза, включая его формы с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). Важнейшей частью этой проблемы является первичный туберкулёз с множественной и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ), распространяющийся среди детского населения. Цель исследования: сравнительный анализ фенотипического и генотипи-ческого профиля лекарственной устойчивости к противотуберкулёзным препаратам (ПТП) по данным полногеномного секвенирования штаммов M. tuberculosis, полученных от детей.

Материалы и методы. Было осуществлено полногеномное секвенирование (WGS) 61 изолята M. tuberculosis с поиском мутаций в генах лекарственной устойчивости, выделенного от больных туберкулёзом детей в 2006-2020гг. из разных регионов РФ, и дальнейшим сопоставлением профиля генетической и фенотипической чувствительности.

Результаты. Доминирующее число штаммов принадлежало генотипу Beijing - 82 % (50/61), в частности субтипу Central Asian Russian, B0/W148 и Asian Ancestral. Остальные штаммы были отнесены в группу non-Beijing (Ural, S, LAM) и составили 18 % (11/61) выборки. Из 61 изолята только 14,7 % (9/61) были чувствительными к ПТП, 49,2 % (30/61) - обладали МЛУ и 14,7 % (9/61) - пре-ШЛУ. При сравнении профиля устойчивости (МЛУ/пре-ШЛУ) с соответствующим генотипом было установлено, что изоляты, принадлежащие генотипу Beijing, значимо чаще несли МЛУ/пре-ШЛУ мутации. Расхождения между гено- и фенотипическими профилями лекарственной устойчивости были выявлены в 11,5 % (7/61) случаев. Заключение. Результаты анализа полученных данных свидетельствуют о доминировании эпидемически значимых субтипов Beijing (B0/W148 и Central Asian Russian) в случаях МЛУ и пре-ШЛУ-ТБ. Сделан вывод, что молекулярные механизмы адаптации M. tuberculosis к лечению ПТП не являются уникальными для детской популяции, а отражают общие процессы распространения ЛУ среди штаммов M. tuberculosis в целом по России.

Ключевые слова: Mycobacterium tuberculosis, полногеномное секвенирование, дети, множественная лекарственная устойчивость, спектр мутаций, генотип

Автор, ответственный за переписку: Хромова Полина Андреевна,

e-mail: polina.and38@gmail.com

для цитирования: Хромова П.А., Жданова С.Н., Соловьёва Н.С., Синьков В.В., Машарский А.Э., Вязовая А.А., Мокроусов И.В., Рычкова Л.В., Колесникова Л.И., Журавлев В.Ю., Статья получена: 27.06.2022 Огарков О.Б. Генотипическая и фенотипическая характеристика устойчивости

Статья принята: 16 11 2022 к противотуберкулёзным препаратам штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделен-

, ' ' ',„,,,„,, ных от детей. Actabiomedicascientifica. 2022; 7(6): 82-91. doi: 10.29413/ABS.2022-7.6.8

Статья опубликована: 29.12.2022

82

genotypic and phenotypic characteristics of Mycobacterium tuberculosis drug resistance in tb children

ABSTRACT

Khromova P.A. 1, Zhdanova S.N. 1, Solovieva N.S. 2, Sinkov V.V. 1, Masharsky A.E. 3, Vyazovaya A.A. 4, Mokrousov I.V. 4, Rychkova L.V. 1, Kolesnikova L.I. 1, Zhuravlev V.Yu. 2, Ogarkov O.B. 1

1 Scientific Centre of the Family Health and Human Reproduction Problems (Timiryazeva str. 16, Irkutsk 664003, Russian Federation)

2 Saint Petersburg Research Institute of Phthisiopulmonology (Ligovsky proezd 2-4, Saint Petersburg 191036, Russian Federation)

3 The Bio-Bank Research Center, Research Park, Saint Petersburg State University (Universitetskaya emb. 7/9,

Saint Petersburg 199034, Russian Federation)

4 Saint Petersburg Pasteur Institute (Mira str. 14, Saint Petersburg 197101, Russian Federation)

Background. Russian Federation is included in the list of 30 countries with the highest burden of tuberculosis, including MDR tuberculosis. The most important part of this problem is the primary MDR/XDR TB in children.

The aim: a comparative analysis of the phenotypic and genotypic profile of drug resistance to anti-tuberculosis drugs (ATP) according to whole genome sequencing of M. tuberculosis strains from children.

Materials and methods. Whole genome sequencing (WGS) results of61M. tuberculosis isolates from children with tuberculosis in 2006-2020 in the Russian Federation were analyzed foranti-TB drug resistance mutations, according to the WHO catalog and were compared with the results of phenotypic drug sensitivity. Results. The M. tuberculosis belonged to two genetic groups: Beijing genotype - 82 % (50/61) dominant Central Asian Russian (31/50) and B0/W148 (16/50) subtypes, and non-Beijing (Ural, S, LAM) - 18 % (11/61). Three isolates belonged to Asian Ancestral subtype (3/50). Of the 61 isolates, only 14.7 % (9/61) were sensitive to anti-TB drugs, 49.2 % (30/61) were MDR and 14.7 % (9/61) were pre-XDR. Comparison of the resistance profile (MDR/pre-XDR) with genotype revealed an upward shift for Beijing isolates, in particular Beijing B0/W148 (15/16) subline compared to other Beijing (19/34) (Chi-square with Yates correction = 5.535;p < 0.05) and nonBeijing (5/12) (Chi-square with Yates correction = 6.741;p < 0.05) subtypes. Discrepancies between genotypic and phenotypic drug resistance profiles were found in 11.5 % (7/61) of cases.

Conclusions. Based on the analysis of WGS data, the genotypic characteristics of M. tuberculosis and the most complete set of drug resistance mutations were obtained, indicating a significant prevalence in MDR and pre-XDR TB of cases caused by epidemic subtypes of Beijing (B0/W148 and Central Asian Russian). The molecular mechanisms of adaptation of M. tuberculosis to the treatment of anti-TB drugs are not unique for the child population but reflect the general processes of the spread of MDR/XDR in Russia.

Key words: Mycobacterium tuberculosis, whole genome sequencing, children, multidrug resistance, mutation spectrum, genotype

Corresponding author: Polina A. Khromova,

e-mail: polina.and38@gmail.com

For citation: Khromova P.A., Zhdanova S.N., Solovieva N.S., Sinkov V.V., Masharsky A.E., Vya-Received: 27.06.2022 zovaya A.A., Mokrousov I.V., Rychkova L.V., Kolesnikova L.I., Zhuravlev V.Yu., Ogarkov O.B.

Ac«pted: 16.11.2022 Genotypic and phenotypic characteristics of Mycobacterium tuberculosis drug resistance

PiibNsiwd29 12 2022 in TB children. Actabiomedicascientifica. 2022; 7(6): 82-91. doi: 10.29413/ABS.2022-7.6.8

обоснование

Одной из серьёзных проблем мирового здравоохранения является формирование и глобальное распространение туберкулёзной инфекции, устойчивой к противотуберкулёзным препаратам первого и второго ряда, т. е. развитие множественной и широкой лекарственной устойчивости (МЛУ и ШЛУ). По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), среди 10 млн человек, больных туберкулёзом (ТБ), около 500 тыс. имеют штаммы M. tuberculosis, устойчивые к рифампицину, из которых 78 % также устойчивы к изониазиду, т. е. являются МЛУ [1]. В 2021 г. ВОЗ изменила определение ШЛУ туберкулёза [1], а также впервые дала определение пре-ШЛУ, подчеркнув серьёзность данных форм заболевания. В соответствии с последними изменениями, пре-ШЛУ описывают как МЛУ туберкулёз с дополнительной устойчивостью к одному из фторхинолонов. ШЛУ охарактеризован как МЛУ туберкулёз, устойчивый к любому фторхинолону и как минимум к одному дополнительному препарату группы A: бедаквилину и/или линезолиду [1]. Первичным механизмом приобретения резистентности у M. tuberculosis является накопление однонуклеотид-ных замен (single nucleotide polymorphism, SNP) в генах, кодирующих белки, являющиеся мишенями противотуберкулёзных препаратов, или в ферментах, утилизирующих эти ксенобиотики.

Одной из причин развития лекарственной устойчивости (ЛУ) является селективный отбор носителей мутации при неадекватном лечении туберкулёза [2], а также передача мутировавшего штамма возбудителя туберкулёза от человека к человеку [3]. Математическая модель передачи возбудителя [3] свидетельствует о том, что передача ЛУ штаммов, от больных людей здоровым, может играть ключевую роль в процессе глобального возникновения устойчивых форм ТБ, поскольку такие случаи передачи встречаются в разных странах, и их частота колеблется от 40 до 90 %. На территории стран бывшего СССР высокая встречаемость МЛУ/ШЛУ туберкулёза [4, 5] указывает на важную роль передачи МЛУ/ШЛУ штаммов от больных к здоровым и в первую очередь от взрослых к детям. Известно, что на территории стран бывшего Советского Союза большая часть изолятов M. tuberculosis, ассоциированных с МЛУ/ШЛУ, принадлежит генотипам Beijing [6, 7] и Евро-Американскому семейству [5, 8].

Молекулярная диагностика считается наиболее многообещающим путём к быстрому универсальному тестированию лекарственной чувствительности возбудителя туберкулёза. В 2021 г. под эгидой ВОЗ был опубликован наиболее полный каталог SNP [9], ассоциированных с устойчивостью к ПТП, на основе результатов феноти-пического анализа и полногеномного секвенирования 41 137 изолятов возбудителя M. tuberculosis из 45 стран. Использование этого каталога предоставляет доступ к наиболее полной и стандартизированной генотипи-ческой характеристике ЛУ, которая и была применена в настоящем исследовании для уникальной коллекции данных полногеномного секвенирования штаммов М. tuberculosis от детей из различных регионов России.

цель исследования

Провести сравнительный анализ фенотипиче-ского и генотипического профилей лекарственной устойчивости штаммов M. tuberculosis, полученных от детей.

материалы и методы

Проведено исследование коллекции 61 клинического изолята микобактерий туберкулёза из отдела лабораторных исследований ФГБУ «СПБ НИИ Фтизиопульмоно-логии» МЗ РФ. Штаммы были получены от детей 1-15 лет, больных туберкулёзом, получивших хирургическое лечение в 2006-2020 гг.; 41 (66,1 %) из них были мальчиками; средний возраст пациентов - 5,44 ± 0,97 года. Критические концентрации противотуберкулёзных препаратов: изониазид - 0,1 и 1 мг/л; рифампицин - 1 и 40 мг/л; стрептомицин - 10 и 50 мг/л; этамбутол - 2 и 5 мг/л; эти-онамид - 5 и 30 мг/л; офлоксацин - 2 мг/л; канамицин, амикацин и капреомицин - 30 мг/л и пиразинамид -100 мг/л определяли при помощи автоматизированной системы Bactec MGIT 960.

Полногеномное секвенирование выполнено на приборе Illumina Hiseq 2500 в Санкт-Петербургском государственном университете. Полученные полногеномные последовательности были депонированы в архив коротких прочтений NCBI SRA, биопроект [10]. Короткие прочтения выравнивались относительно ре-ференсной нуклеотидной последовательности (геном Mycobacterium tuberculosis H37Rv -NC_000962.3) при помощи Burrows - Wheeler алгоритма с использованием программы BWA [11]. Поиск однонуклеотидных полиморфных локусов (SNP calling) производили с применением программы Bcftools [12]. Создание конкатент-ной последовательности, на основе 3612 вариабельных признаков, выполняли с использованием программы bsatool [13]. Филогенетическое дерево построено с использованием программы Beast 2 [14] с применением общей реверсивной модели эволюции. Оценку лог-файлов Beast проводили с помощью Tracer v. 1.7.1 [15]. Все параметры, полученные методом Монте-Карло по схеме марковских цепей, демонстрировали достаточные значения эффективного размера выборки больше 200 [16]. Тестирование нуклеотидных последовательностей на соответствие определённой модели накопления замен выполняли с помощью программы IQ-TREE [17]. Реконструкция филогенетических деревьев Байесовским методом с молекулярными часами выполнена по модели GTR с частотной коррекцией встречаемости аминокислотных остатков в последовательности и четырьмя гамма категориями (GTR+F+4G). Генотипирова-ние образцов осуществляли в соответствии с классификациями по S. Homolka и соавт. [18], E. Shitikov и соавт. [19] и G. Napier и соавт. [20]. Генетический профиль лекарственной устойчивости - набор мутаций, придающих резистентность к ПТП, проводили по каталогу мутаций ВОЗ всех категорий [9].

результаты и обсуждение

филогенетическое древо (рис. 1), которое позволило сделать вывод о том, что основная масса штаммов при-На основе массива данных, содержащих 3612 ва- надлежит к двум генетическим кладам: Beijing и non-риабельных признаков, было построено байесовское Beijing.

РИС. 1.

Филогенетическое древо 61 генома M. tuberculosis, штаммов, выделенных от детей. Верхняя часть древа представлена кластером Central Asian Russian (выделен зелёным). Нижний левый кластер Beijing B0/W148 (выделен голубым). Правее него расположены три генома, относящиеся к субтипу Asian Ancestral. Нижний правый кластер (выделен розовым) - non-Beijing (Ural, S, LAM). При обозначении геномов использованы следующие сокращения: Sens - чувствительность к противотуберкулёзным препаратам; Mono - устойчивость к одному противотуберкулёзному препарату; Poly - устойчивость к нескольким противотуберкулёзным препаратам, но не МЛУ или ШЛУ; MDR - МЛУ;preXDR - преШЛУ;XDR - ШЛУ. Вначале приведена устойчивость, определённая фенотипически, затем через косую черту - определённая геномным анализом. Например, MDR/MDR - фенотипическая и генотипическая устойчивость соответствовала определению МЛУ. Прочерки приведены в случае отсутствия фенотипических данных

FIG. 1.

Circle phylogenetic tree of 61 genomes of M. tuberculosis strains isolated from children. The upper part of the tree is represented by the Central Asian Russian cluster (green). The bottom left cluster is Beijing B0/W148 (blue). To the right of it are three genomes belonging to the Asian Ancestral subtype. The lower right cluster (pink) is non-Beijing (Ural, S, LAM). Sens - sensitivity to antituberculosis drugs; Mono - resistance to one anti-TB drug; Poly - resistance to several anti-TB drugs, but not MDR or XDR; MDR - multidrug resistance, i. e. resistance to rifampicin and isoniazid;preXDR -MDR also resistant to any fluoroquinolone (levofloxacin; moxiflox-acin); XDR - MDR also resistant to any fluoroquinolone and at least one additional drug (bedaquiline or linezolid). For example, MDR/ MDR - phenotypic and genotypic resistance fits the definition of MDR. Question marks are put in case of missing data

Генотип Beijing, преобладающий в России [6, 7, 19], представлен 50 штаммами, со значимым доминированием двух эпидемических субтипов - Central Asian Russian (31/50), B0/W148 (16/50), и Asian Ancestral (3/50) [7, 19]. В группу non-Beijing входили 11 геномов: пять штаммов - Latin-American Mediterranean (LAM), четыре штамма - Ural, и два - S.

Установлено, что из 61 изолята 14,7 % (9/61) были чувствительными к ПТП, 49,2 % (30/61) - обладали МЛУ и 14,7 % (9/61) - пре-ШЛУ. При сравнении профиля устойчивости (МЛУ/пре-ШЛУ) с соответствующим генотипом было выявлено, что изоляты, принадлежащие генотипу Beijing, значимо чаще несли мутации МЛУ/пре-ШЛУ, в частности изоляты сублинии B0/W148 (15/16) по сравнению с другими Beijing (19/34) (х2 с поправкой Йейт-са = 5,535; p < 0,05) и non-Beijing (5/12) (х2 = 6,741; p < 0,05). У семи штаммов были обнаружены различия по гено-и фенотипу. Четыре образца, по микробиологическому тесту отнесённые к МЛУ и пре-ШЛУ, не являлись таковыми при выявлены мутаций, ответственных за формирование МЛУ/пре-ШЛУ устойчивости. Три штамма представляли иные различия между моно-/полирезистентно-стью и МЛУ/пре-ШЛУ (см. рис. 1).

мутации к препаратам основного ряда

Спектр основных мутаций, полученных по WGS данным M. tuberculosis всей выборки, представлен на рисунке 2.

Из 38 штаммов с резистентностью к рифампици-ну у 35 присутствовали мутации, обнаруженные в rpoB гене. Каноническая аминокислотная замена rpoB S450L, связанная с высоким уровнем устойчивости к рифам-пицину при несущественном снижении жизнеспособности штаммов [21], была идентифицирована у 85 % изолятов. Другие клинически значимые мутации в rpoB (L430P, D435G, H445N и L452P) обнаружены в единичных случаях и только у представителей Central Asian Russian субтипа. Мутации третьей категории (по классификации ВОЗ - «Uncertain significance»), не имеющие высокой клинической значимости, были обнаружены только в сочетании со «строго ассоциированными» («Association with resistance») позициями у фенотипи-чески резистентных изолятов генотипа Beijing: субтипа Central Asian Russian- в виде четырёх вариантов замен rpoB (T399I, I480V и E761D, R827C) и B0/W148 - rpoB_ L42V. Не было обнаружено ни одной из компенсаторных мутаций в rpoC и rpoA генах, связанных с устойчивостью к рифампицину.

Каноническая одиночная аминокислотная замена katG S315T была обнаружена у 74 % изолятов. С учётом двойных замен (katG S315T + inhA c-777t_(fabG1 c-15t), katG S315T + ahpC g-48a), её встречаемость увеличивается до 90 %. В целом это совпадает с описываемыми частотами клинических изолятов от взрослых больных МЛУ-ТБ и ранее полученными данными от детей и подростков из России [22, 23]. При этом B0/W148 штаммы имели только одиночную мутацию katG S315T. Комбинация мутаций была у одного штамма группы non-Beijing и двух Central Asian Russian. Выявлен устойчивый к изо-

ниазиду мутантный ген katG и компенсаторная мутация в гене алкилгидропероксидазы ahpC. В дополнение к этому найден штамм с одиночной мутацией в гене ahpC c-52t с фенотипической устойчивостью в концентрации 1 мг/л. Из 51 устойчивых к изониазиду изолятов три не показали каких-либо мутаций в генах, связанных с резистентностью.

МЛУ штаммы имели устойчивость к этамбутолу в 69 %. Замены в кодоне 306 гена embB обнаружены у 45,8 % (11/24). Также было обнаружено семь мутант-ных генов с сохранённой чувствительностью к этамбутолу в концентрации 2 мкг/мл. Особенностью коллекции было наличие двойных и тройных мутантных генов у субтипа Central Asian Russian, несущих мутации embB и embА, и заменами в embC (c-1188t и c-1753t), отдельно не имеющих клинической значимости. Такое сочетание мутаций у субтипа Central Asian Russian может, некоторым образом, отражать связи между фенотипической устойчивостью к этамбутолу и генотипом. Наличие мутаций в ubiA, по-видимому, не имеет самостоятельного клинического значения для исследуемых нами изолятов, поскольку обнаруженные два случая с заменами в этом гене сохраняли чувствительность к этамбутолу.

В соответствии с новым каталогом мутаций [9], нами были изучены и описаны все возможные варианты ну-клеотидных замен гена pncA, ассоциированные с ЛУ. У одного из пяти штаммов, с известной фенотипической устойчивостью к пиразинамиду, присутствовала мутация T114P в pncA. В остальных изолятах обнаружен широкий спектр мутаций в каждом отдельном положении гена pncA (включая вышестоящую промоторную область) и единичные случаи в РРЕ 35 и Rv3236. Замен в редко встречающихся генах, связанных с устойчивостью к пиразинамиду (panD, clpC) [24], обнаружено не было.

мутации к препаратам второго ряда и группы С

Согласно новым рекомендациям ВОЗ, к препаратам второго ряда отнесены фторхинолоны, бедаквилин и ли-незолид, а к группе С - деламанид, амикацин, стрептомицин и этионамид [1, 9]. Резистентными к фторхинолонам были 12 изолятов. Замены в 94-м кодоне gyrA были наиболее распространены среди фенотипически устойчивых штаммов (58 %). Три устойчивых изолята содержали мутации только в гене gyrB, шесть резистентных изолятов были без мутаций в gyrA и в gyrB. Такое распределение мутаций несколько отличается от данных выборки взрослого населения, где одиночные замены в гене gyrA достигают 95 % [23, 25].

Мутаций в ключевых генах устойчивости к бедакви-лину - atpE и mmpR - не было обнаружено ни в одном геноме, как и в гене rplC (линезолид), и в ddn (деламанид) [26], что закономерно при крайне низкой вероятности применения этихантибиотиковдлялечения детей исследуемой выборки. Другие замены, описанные для этих препаратов, обнаружены в единичных штаммах: у двух пре-ШЛУ штаммов к бедаквилину (Rv1979c_D286G и mmpL5_M655T), у двух монорезистентных (ddn_R30S и fbiA_I208V) и пре-ШЛУ штаммов (fgd1_K270M и fbiC_a-32g) к деламаниду.

20

40

60

80

100

RIF: rpoB_H445N+L430P RIF: rpoB_H445N+D435G RIF: rpoB_S450L RIF: rpoB_S450L +I480V RIF: rpoB_S450L+ E761D RIF: rpoB_L452P RIF: rpoB_P101A +K357T RIF: rpoB_L487F INH:katG_S315T INH:katG_S315T+ahpC_g-48a INH:katG_S315T+Rv2752c_L487F INH:inhA_S94A+katG_A109T INH:katG_S315T+inhA_c-777t_(fabG1_c-15t) INH:ahpC_c-52t INH:Rv2752c_P101A+K357T INH:Rv2752c_c-944t_ EMB:embB_M306V EMB:embB_M306V+embA_c-12t EMB:embB_M306I EMB:embB_G406A EMB:embB_Q497K EMB:embB_Q497R EMB:embB_Q497R+embC_A931T EMB:embB_S347I EMB:embB_D354A EMB:embC_c-1753t_(aftA_60) EMB:embC_c-1188t EMB:embC_c-1753t EMB:embA_c-16t EMB:embA_ V558L EMB:ubiA_V188A FQ:gyrA_D94N FQ:gyrA_D94G FQ:gyrA_R578Q FQ:gyrB_A403S FQ:gyrB_S447F KAN/AMI:rrs_a1401g KAN/A MI:eis_g-10a KAN/AMI:eis_g-37t KAN/AMI:eis_c-14t KAN/AMI:eis_c-12a** STR:rpsL_K43R

»устойчивые STR:rrs_c517t

■ чувствительные STR:whiB6 T51P

■ ■

■ ■ ■

1 в 1 i 1

Z-

J-

■ ■ ■

II"

LL

■

0

РИС. 2.

Спектр мутаций, выраженный в процентах, ассоциированных с лекарственной устойчивостью. Столбцы представляют конкретную относительную частоту каждой мутации среди восприимчивых (зелёные) и устойчивых (красные) изо-лятов. Сокращённое название противотуберкулёзных препаратов: RIF-рифампицин, INH - изониазид, EMB -этамбу-тол, FQ - фторхинолоны, KAN - канамицин, AMI - амикацин, STR - стрептомицин

FIG. 2.

Mutation spectrum expressed as a percentage associated with drug resistance. Bars represent the specific relative frequency of each mutation among susceptible (green) and resistant (red) isolates. Abbreviated anti-tuberculosis drugs: RIF - rifampicin, INH -isoniazid, EMB - ethambutol, FQ - fluoroquinolones, KAN - kana-mycin, AMI - amikacin, STR - streptomycin

К этионамиду выявлены мутации ЛУ у 28 штаммов, однако соответствие с результатами теста лекарственной чувствительности было не полным. Это объяснимо наличием частичной перекрёстной устойчивости с изониазидом из-за мутаций гена ¡пЬА, которые влияют на активность редуктазы InhA и её связывающие свойства с токсическими аддуктами. Мутации, которые являются маркером устойчивости к этионамиду, обнаруже-

ны нами в двух штаммах с сохранённой чувствительностью с ¡пЬА^777 ((аЬв! одном устойчивом штамме с ¡пЬАg-154a ((аЬв! L203L), и одном устойчивом изоляте с ¡пЬА_:-770с_ ((аЬв! ^8^. Такие противоположные фенотипы могут быть отражением опосредованного действия мутаций в промоторе ¡пЬА, приводящих к усилению экспрессии гена, что сказывается на уменьшении токсического действия изониазида и этионамида [27].

Большинство выявленных мутантных генов имели изменения в локусе ethA, характеризующиеся потерей рамки считывания и наличием нонсенс мутаций, которые только в трети случаев (3/9) приводили к обнаружению устойчивого фенотипа.

Устойчивость к стрептомицину в любой комбинации имели 76 % (45/59) детских изолятов, а среди МЛУ штаммов все несли фенотипическую устойчивость. При этом наиболее частыми мутациями были rpsL K43R и rrsc517t, которые в сумме составили 93 % резистентных штаммов, сопоставимые с данными взрослого населения с туберкулёзной инфекцией в России [23].

Резистентные к аминогликозидам и капреомицину изоляты преимущественно имели замены в rrs a1401g. Следует отметить, что «мутанты» с rrs a1401g присутствовали и в двух чувствительных изолятах. Среди устойчивых к трём этим ПТП характерна была только единичная мутация в rrs a1401g в 7 из 9 штаммов. Этот факт подтверждает ранее полученные наблюдения выборки российских штаммов взрослого населения, что такая мутация в рибосомальном гене приводит к перекрёстной устойчивости ко всем трём вышеуказанным препаратам [24]. Строго ассоциированные мутации eis g-10a, eis c-14t, eis g-37t были также выявлены в штаммах с устойчивостью только к канамицину. Это также согласуется с ранее полученными данными о том, что мутации в промоторе гена eis, усиливающие его транскрипцию, приводят к низкоуровневой монорезистентности к канамицину [28]. Дополнительный анализ устойчивых к аминогликозидам двух изолятов без мутаций в локусах rrs и eis не выявил каких-либо мутации в гене tlyA - строго связанному с резистентностью - у двух капреомицин-устойчивых изолятов, но один имел две мутации в whiB6 - не имеющих клинической значимости. Мутации в области whiB7, которые обнаруживались при устойчивости к инъекционными ПТП в российских штаммах взрослой выборки, в нашем анализе не выявлены [23].

заключение

Таким образом, настоящее исследование даёт информацию о генотипическом разнообразии современных клинических изолятов M. tuberculosis у больных туберкулёзом российских детей, которое принципиально не отличается от структуры, полученной в выборках от взрослых пациентов. Превалирование генотипа Beijing и эпидемических для России вариантов B0/W148 и Central Asian Russian у детей свидетельствует о стабильной популяционной структуре возбудителя туберкулёза и сохранении тенденций высоких уровней распространения лекарственно-устойчивых форм инфекции на территории страны.

Объединение фенотипических и молекулярно-ге-нетических данных позволило нам дать более полную оценку ЛУ изолятам. Большая часть МЛУ была обусловлена мутациями, не оказывающими негативного влияния на жизнеспособность и трансмиссивность возбудителя (rpoB_S450L + katG_S315T) [25], что также сви-

детельствует о большом эпидемическом резервуаре штаммов M. tuberculosis с МЛУ/пре-ШЛУ, которые способны активно передаваться в популяции. Выявленные отличия в наборе мутаций, связанных с устойчивостью, в большей степени проявлены к препаратам первого ряда, в первую очередь к рифампицину и изониазиду. Высоко трансмиссивные штаммы Beijing B0/W148 несут наиболее часто одиночные некомбинированные мутации к рифампицину и изониазиду, связанные с высоким уровнем резистентности. Это качественно отличает данные эпидемически успешные клоны от других представителей Beijing и non-Beijing, несущих более широкий спектр как клинически значимых мутаций, так и мало связанных с ЛУ. Удивительно, но накопление известных компенсаторных мутаций в МЛУ штаммах, предполагаемых при таких высоких уровнях МЛУ-ТБ в России, не имели широкого проявления. Это может свидетельствовать о глубоко зашедших эволюционных процессах, вызванных неадекватной химиотерапией, вероятно, сформировавших неизвестные компенсаторные механизмы в российской популяции штаммов возбудителя туберкулёза. Вполне очевидно, что описанные молекулярные механизмы адаптации M. tuberculosis к лечению ПТП не уникальны для детской популяции, а отражают общие процессы распространения туберкулёза с ЛУ среди жителей России.

Финансирование

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (19-515-55009 Китай_а).

конфликт интересов

Авторы данной статьи заявляют об отсутствии конфликта интересов.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

литература

1. WHO. Meeting report of the WHO expert consultation on the definition of extensively drug-resistant tuberculosis, 27-29 October 2020. URL: https://apps.who.int/iris/handle/10665/338776 [date of access: 20.06.2022].

2. Zhang Y, Yew WW. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis: Update 2015. Int J Tuberc Lung Dis. 2015; 19(11): 1276-1289. doi: 10.5588/ijtld.15.0389

3. Kendall EA, Fofana MO, Dowdy DW. Burden of transmitted multidrug resistance in epidemics of tuberculosis: A transmission modelling analysis. Lancet RespirMed. 2015; 3(12): 963-972. doi: 10.1016/S2213-2600(15)00458-0

4. Zhdanova S, Heysell SK, Ogarkov O, Boyarinova G, Alexeeva G, Pholwat S, et al. Primary multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis in 2 regions, Eastern Siberia, Russian Federation. Emerg Infect Dis. 2013; 19(10): 1649-1652. doi: 10.3201/eid1910.121108

5. Sinkov V, Ogarkov O, Mokrousov I, Bukin Y, Zhdanova S, Heysell SK. New epidemic cluster of pre-extensively drug resistant isolates of Mycobacterium tuberculosis Ural family emerging in Eastern Europe. BMC Genomics. 2018; 19(1): 1-9. doi: 10.1186/ s12864-018-5162-3

6. Синьков В.В., Савилов Е.Д., Огарков О.Б. Реконструкция эпидемической истории «Пекинского» генотипа Mycobacterium tuberculosis в России и странах бывшего СССР по результатам сполиготипирования. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011; 26(3): 25-29. doi: 10.3103/ S0891416811030050

7. Mokrousov I, Narvskaya O, Vyazovaya A, Millet J, Otten T, Vishnevsky B, et al. Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in Russia: In search of informative variable-number tandem-repeat loci. J Clin Microbiol. 2008; 46(11): 3576-3584. doi: 10.1128/ jcm.00414-08

8. Mokrousov I, Vyazovaya A, Iwamoto T, Skiba Y, Pole I, Zhdanova S, et al. Latin-American-Mediterranean lineage of Mycobacterium tuberculosis: Human traces across pathogen's phylo-geography. MolPhylogenet Evol. 2016; 99: 133-143. doi: 10.1016/ j.ympev.2016.03.020

9. WHO. Catalogue of mutations in Mycobacterium tuberculosis complex and their association with drug resistance: supplementary document. URL: https://apps.who.int/iris/handle/10665/341906 [date of access: 20.06.2022].

10. PRJNA786957. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ bioproject/?term=PRJNA786957 [date of access: 23.06.2022].

11. Li H, Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows - Wheeler transform. Bioinformatics. 2009; 25(14): 1754-1760. doi: 10.1093/bioinformatics/btp324

12. Danecek P, Bonfield JK, Liddle J, Marshall J, Ohan V, Pollard MO, et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 2021; 16; 10(2): giab008. doi: 10.1093/gigascience/giab008

13. Sinkov V. Vsink/bsatool: First beta pre-release (Version 0.1). Zenodo. 2019. doi: 10.5281/zenodo.3352204

14. Bouckaert R, Heled J, Kühnert D, Vaughan T, Wu CH, Xie D, et al. BEAST 2: A software platform for Bayesian evolutionary analysis. PLoS Comput Biol. 2014; 10(4): e1003537. doi: 10.1371/ journal.pcbi.1003537

15. Rambaut A, Drummond AJ, Xie D, Baele G, Suchard MA. Posterior summarization in Bayesian phylogenetics using tracer 1.7. Syst Biol. 2018; 67(5): 901-904. doi: 10.1093/sysbio/syy032

16. Drummond AJ, Bouckaert RR. Bayesian evolutionary analysis with BEAST. Cambridge University Press; 2015.

17. Nguyen LT, Schmidt HA, von Haeseler A, Minh BQ. IQ-TREE: A fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum-likelihood phylogenies. Mol Biol Evol. 2015; 32(1): 268274. doi: 10.1093/molbev/msu300

18. Homolka S, Projahn M, Feuerriegel S, Ubben T, Diel R, Nübel U, et al. High resolution discrimination of clinical Mycobacterium tuberculosis complex strains based on single nucleotide polymorphisms. PLoS One. 2012; 7(7): e39855. doi: 10.1371/journal. pone.0039855

19. Shitikov E, Kolchenko S, Mokrousov I, Bespyatykh J, Is-chenko D, Ilina E, et al. Evolutionary pathway analysis and unified classification of East Asian lineage of Mycobacterium tuberculosis. Sci Rep. 2017; 7(1): 9227. doi: 10.1038/s41598-017-10018-5

20. Napier G, Campino S, Merid Y, Abebe M, Woldeama-nuel Y, Aseffa A, et al. Robust barcoding and identification of Mycobacterium tuberculosis lineages for epidemiological and clinical studies. Genome Med. 2020; 12(1): 114. doi: 10.1186/ s13073-020-00817-3

21. Fenner L, Egger M, Bodmer T, Altpeter E, Zwahlen M, Jaton K, et al. Effect of mutation and genetic background on drug

resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 2012; 56(6): 3047-3053. doi: 10.1128/AAC.06460-11

22. Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Андриевская И.Ю., Киселева Е.А., Ларионова Е.Е., Севастьянова Э.В. и др. Сравнительный анализ фенотипической и генотипической лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis, выделенных от детей и подростков из стационара. Вестник Центрального научно-исследовательского института туберкулёза. 2018; 3: 30-41. doi: 10.7868/S2587667818030056

23. Jou R, Lee WT, Kulagina EV, Weng JY, Isakova AI, Lin WH, et al. Redefining MDR-TB: Comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Russia and Taiwan. Infect Genet Evol. 2019; 72: 141-146. doi: 10.1016/j.meegid.2018.12.031

24. Gopal P, Sarathy JP, Yee M, Ragunathan P, Shin J, Bhushan S, et al. Pyrazinamide triggers degradation of its target aspartate decarboxylase. Nat Commun. 2020; 11(1): 1661. doi: 10.1038/ s41467-020-15516-1

25. Эргешов А.Э., Андреевская С.Н., Ларионова Е.Е., Смирнова Т.Г., Черноусова Л.Н. Спектр мутаций в генах, ассоциированных с устойчивостью к рифампицину изониазиду и фторхинолонам, у клинических штаммов M. tuberculosis отражает трансмиссивность мутантных клонов. Молекулярная биология. 2017; 51(4): 595-602. doi: 10.1134/S0026893317030049

26. Gómez-González PJ, Perdigao J, Gomes P, Puyen ZM, Santos-Lazaro D, Napier G, et al. Genetic diversity of candidate loci linked to Mycobacterium tuberculosis resistance to bedaquiline, de-lamanid and pretomanid. Sci Rep. 2021; 11(1): 19431. doi: 10.1038/ s41598-021-98862-4

27. Ushtanit A, Kulagina E, Mikhailova Y, Makarova M, Safono-va S, Zimenkov D. Molecular determinants of ethionamide resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Antibiotics. 2022; 11(2): 133. doi: 10.3390/antibiotics11020133

28. Zaunbrecher MA, Sikes RD Jr, Metchock B, Shinnick TM, Posey JE. Overexpression of the chromosomally encoded aminoglycoside acetyltransferase eis confers kanamycin resistance in Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 106(47): 20004-20009. doi: 10.1073/pnas.0907925106

REFERENCES

1. WHO. Meeting report of the WHO expert consultation on the definition of extensively drug-resistant tuberculosis, 27-29 October 2020. URL: https://apps.who.int/iris/handle/10665/338776 [date of access: 20.06.2022].

2. Zhang Y, Yew WW. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis: Update 2015. IntJTubercLung Dis. 2015; 19(11): 1276-1289. doi: 10.5588/ijtld.15.0389

3. Kendall EA, Fofana MO, Dowdy DW. Burden of transmitted multidrug resistance in epidemics of tuberculosis: A transmission modelling analysis. LancetRespir Med. 2015; 3(12): 963-972. doi: 10.1016/S2213-2600(15)00458-0

4. Zhdanova S, Heysell SK, Ogarkov O, Boyarinova G, Alexeeva G, Pholwat S, et al. Primary multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis in 2 regions, Eastern Siberia, Russian Federation. Emerg Infect Dis. 2013; 19(10): 1649-1652. doi: 10.3201/eid1910.121108

5. Sinkov V, Ogarkov O, Mokrousov I, Bukin Y, Zhdanova S, Heysell SK. New epidemic cluster of pre-extensively drug resistant isolates of Mycobacterium tuberculosis Ural family emerging

in Eastern Europe. BMC Genomics. 2018; 19(1): 1-9. doi: 10.1186/ s12864-018-5162-3

6. Sinkov VV, Savilov ED, Ogarkov OB. Reconstruction of the epidemic history of the Beijing genotype of Mycobacterium tuberculosis in Russia and former Soviet countries using spoligotyping. Molecular Genetics Microbiology and Virology. 2011; 26(3): 25-29. (In Russ.). doi: 10.3103/S0891416811030050

7. Mokrousov I, Narvskaya O, Vyazovaya A, Millet J, Otten T, Vishnevsky B, et al. Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in Russia: In search of informative variable-number tandem-repeat loci. J Clin Microbiol. 2008; 46(11): 3576-3584. doi: 10.1128/jcm.00414-08