CC BY
54
УДК 591.69-9
Ключевые слова: альвеолярный эхинококкоз, метацестода, штамм, Echinococcus multilocularis, генотип
Key words: alveolar echinococcosis, metacestoda, strain, Echinococcus multilocularis, genotype
Коняев С. В., Янагида Т., Кривопалов А. В., Дупал Т. А., Абрамов С. А.,
Накао М., Сако Я., Гуляев В. Д. , Ито А.
ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ АЛЬВЕОЛЯРНОГО ЭХИНОКОККОЗА (ECHINOCOCCUS MULTILOCULARIS) В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ
GENOTYPIC CHARACTERIZATION OF THE CAUSATIVE AGENT OF ALVEOLAR ECHINOCOCCOSIS (ECHINOCOCCUS MULTILOCULARIS) IN WESTERN SIBERIA
'Институт систематики и экологии животных СО РАН
Адрес: 630091, г. Новосибирск, ул. Фрунзе, 11 1Institute of Systematics and Ecology of Animals SB RAS Address: 630091, Russia, Novosibirsk, Frunze street, 11 2Асакихавский медицинский университет, каф. паразитологии Адрес: 078-8510, Япония, Хоккайдо, Асахикава, Мидоригаока Хигаши 2-1-1-1 2Asahikawa Medical University, Dept. of Parasitology Address: 078-8510, Japan, Hokkaido, Asahikawa, Midorigaoka Higashi 2-1-1-1
Коняев Сергей Владимирович, к. б. н., научн. сотрудник1 /Konyaev Sergey V., Ph.D., Research Scientist1 Янагида Тетсуя, Ph.D., ассистент профессора2 / Yanagida Tetsuya, Ph.D., Assistant Professor2 Кривопалов Антон Викторович, к. б. н., научн. сотрудник1 / Krivopalov Anton V., Ph.D., Research Scientist1 Дупал Тамара Александровна, к. б. н., ст. научн. сотрудник1 / Dupal Tamara A., Ph.D., Senior Research Scientist1 Абрамов Сергей Александрович, к. б. н., ст. научн. сотрудник1 Abramov Sergey A, Ph.D., Senior Research Scientist1 Накао Минору, Ph.D., мл. проф.2 / Nakao Minoru, Ph.D., Associate Professor2 Сако Ясушито, Ph.D., преподаватель2 / Sako Yasushito, Ph.D., Lecturer2 Гуляев Владимир Дмитриевич, д. б. н., проф., вед. научн. сотрудник1 Gulyaev Vladimir D., Doctor of Biology Science, Professor, Leading Research Scientist1 Ито Акира, Ph.D., проф., зав. кафедрой2 / Ito Akira, Ph.D., Professor, Head of department2
Аннотация. Изучены последовательности гена coxl изолятов Echinococcus multilocularis с территории Кемеровской и Новосибирской областей. Показана принадлежность изолятов к азиатскому генотипу E. multilocularis.
Summary. The coxl gene sequences of isolate Echinococcus multilocularis from Western Siberia were studied. It is shown that isolates belonging to the Asian genotype of E. multilocularis.
Введение
Ленточные черви Echinococcus multilocularis Leuckart, 1863 являются паразитами млекопитающих с двуххозяинным циклом развития. На личиночной стадии они паразитируют у грызунов, зайцеобразных, реже у других животных и человека. Заражение промежуточных хозяев происходит при проглатывании инвазионных яиц, выделяемых вместе с фекалиями окончательными хозяевами. Половозрелые формы, продуцирующие яйца, развиваются в кишечнике представителей семейств псовых (Canidae), реже кошачьих (Felidae) после поедания ими промежуточных хозяев. Цестоды E. multilocularis являются одними из самых опасных паразитических червей, поражающих человека.
Вызываемая ими болезнь - альвеолярный эхинококкоз является природно-очаговой и распространена на территории Евразии и Северной Америки [17, 2].
Б. И. Альперович выделял пять очагов альвеолярного эхинококкоза на территории СССР. По заболеваемости человека им выделены два крупнейших очага - якутский и сибирский [1]. Н. М. Лукашенко выделял по тому же принципу 9 эндемичных районов, при этом якутский и сибирский очаг, предложенные Альперовичем, были объединены в один [7]. Часть этого эндемичного района располагается на территории Западной Сибири. За прошедшие 56 лет на этой территории зарегистрировано более 750 случаев альвеолярного эхинококкоза у человека.
Большинство случаев заболевания связано с южной частью региона - Алтайским краем и Республикой Алтай. Умеренно высокая заболеваемость наблюдалась в Новосибирской, Омской, Томской и Кемеровской областях. В Новосибирской и Омской областях изучению локальных очагов было уделено достаточное внимание [3, 5, 6, 7, 8]. В других регионах Западной Сибири характеристики локальных природных очагов не были изучены.
Особое внимание исследователей привлекали значительные различия в показателях заболеваемости людей в разных регионах. На основании изучения структуры очагов и биологических особенностей E. multilocularis в разных частях ареала было высказано предположение о существовании двух внутривидовых форм - патогенной (штамм от лисицы) и непатогенной (штамм от песца) для человека [11]. Однако исследование всех биологических свойств метацестод, полученных от людей из разных регионов, проблематично.
Альтернативой данному методу могут послужить молекулярно-генетические методы, когда каждый изученный в лабораторных условиях образец E. multilocularis маркируется путем анализа последовательности гена, после чего осуществляется поиск этих маркеров во всех доступных образцах или изоля-тах и сравниваются их свойства. В качестве таких генетических маркеров для цестод семейства Taeniidae используются последовательности митохондриальной ДНК (мтДНК) трех генов: первой субъединицы цитохром-с-оксидазы (coxl), цитохрома b (cob), второй субъединицы NADH дегидрогеназы (nd2), наиболее часто используемые для геноти-пирования ленточных червей. На основании анализа этих генов у цестод E. multilocularis были установлены четыре генотипа:
а) европейский генотип, основанный на гаплотипах, выявленных у изолятов с территории центральной Европы [16];
б) азиатский генотип, представленный множеством близкими друг к другу гапло-типов, распространенных на территории Китая, Казахстана, части Монголии, Японии и острове Святого Лаврентия (США) [16];
в) монгольский генотип, описан с территории Внутренней Монголии в Китае [20, 21];
г) североамериканский генотип, обнаруженный в штате Индиана (США) и на острове Святого Лаврентия, где он распространен совместно с азиатским генотипом [16].
У людей, зараженных альвеолярным эхи-нококкозом, чаще обнаруживается азиатский или европейский генотипы. Известны также четыре случая обнаружения монгольского генотипа у человека. Предполагается, что его способность к инвазированию людей невысока [14]. Подтвержденных молекулярно-ге-нетическими методами находок североамериканского генотипа у человека нет.
Несмотря на то, что на территории Российской Федерации располагаются крупнейшие по масштабам и интенсивности эпидемиологического процесса природные очаги альвеолярного эхинококкоза, в литературе имеется только одно сообщение о генетической принадлежности изолята E. multilocularis с территории России к азиатскому генотипу [10]. В связи с этим очевидна необходимость изучения генотипического разнообразия возбудителя альвеолярного эхинококкоза на территории всей Западной Сибири. В данной работе представлены первые результаты такого исследования.
Материалы и методы исследований
Исследовано 844 грызуна, отловленных в 2007-2010 гг. в Алтайском и Красноярском краях, в Новосибирской, Кемеровской, Томской, Тюменской, Омской областях и Республике Алтай. Отловы проводились в различных природных биотопах по стандартной методике с помощью линий живоловок и ловчих канавок. Обследованная территория охватывает различные ландшафтно-геогра-фические зоны Сибири, включая степь и лесостепь (Карасук, Шушенское), подтаежные леса (Тюмень, Усть-Ишим, Бакса, Сухоре-чье), предгорья (Парная, Балахнино, Солтон, Хмелевка) и горную тайгу (Артыбаш, Средняя Шушь, Кузедеево).
Определение видов грызунов проводили на основе анализа рисунка жевательной поверхности зубов, краниальных, экстерьер-ных признаков и окраски шкурки [4].
Таблица 1.
Анализируемые изоляты Echinococcus multilocularis
Изолят Территория Генотип Номер доступа в GenBank
Asian KZ Казахстан Азиатский AB461415
Asian CN Сычуань, Китай Азиатский AB461417
NA SL о. Святого Лаврентия Североамериканский AB461418
NA US Штат Индиана, США Североамериканский AB461419
Europe AU Австрия Европейский AB461412.1
Europe SL Словения Европейский AB461414.1
Europe FR Франция Европейский AB461413
Mongolian Внутренняя Монголия, Китай Монгольский AB461420
Исследование млекопитающих производили методом полных гельминтологических вскрытий. Для морфологических исследований извлеченных паразитов фиксировали в 70%-м спирте, а отдельные фрагменты ме-тацестод для молекулярно-генетических исследований помещали в 96%-й этанол.
ДНК паразита экстрагировали с использованием набора "DNeasy blood and tissue Kit" (Qiagen) и использовали для полиме-разной цепной реакции (ПЦР). Фрагменты мтДНК cox1, cob, nd2 амплифицировали в ПЦР с использованием пар праймеров, представленных ранее [13]. Очистка продуктов ПЦР проводилась с помощью ExoSAP-IT (GE Healthcare). Секвенирование проводили с BigDyeTM Terminator v3.1 в 3500 DNA sequencer (Applied Biosystems). Анализ полученных данных проводили с помощью программы "MEGA5" [19]. Полученные данные сравнивали с европейским, североамериканским и азиатским генотипами E. multilocularis, используя последовательности, представленные в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) (табл. 1).
Построение сети гаплотипов осуществляли с помощью программы TSL v.1.21 [12]. Текстом обозначали соответствующие изо-ляты, пустой кружок обозначает отсутствующий (гипотетический) гаплотип.
Результаты
Из всех обследованных животных личиночные формы эхинококка были обнаружены только у 3 особей из 86 животных 10 видов, пойманных на территории Ново-
сибирской и Кемеровской областей (табл. 2.) У грызунов в Тюменской и Омской областях, в Алтайском и Красноярском краях, в Республике Алтай данный паразит нами не был зарегистрирован.
Личиночные формы E. multilocularis были выявлены у перезимовавших самок красно-серой полевки и полевки-экономки в окрестностях с. Балахнино (Кемеровская обл.), отловленных в начале июня 2009 г., а также у половозрелой самки узкочерепной полевки, пойманной во второй половине августа 2010 г. в окрестностях города Карасук (Новосибирская область). Все самки принимали участие в размножении. Половозрелые формы цестод были обнаружены в кишечнике рыжей лисицы, добытой в окрестностях деревни Широкая Курья (табл. 3).
Анализ последовательностей гена cox1 показал, что все исследуемые изоляты относятся к азиатскому генотипу E. multilocularis. Оба гаплотипа из Кемеровской области, гаплотип Rus-Nsk1 из Новосибирской области не отличались друг от друга. Гапло-типы Rus-Nsk1 и Rus-Nsk2 отличались друг от друга единичной заменой в 31-й позиции (T > C). Полные данные с координатами замен представлены в таблице 4. В качестве главного гаплотипа указан китайский изолят (Asian CN).
Последовательности нуклеотидов исследуемых изолятов отличались от казахстанского и китайского гаплотипов по одной замене. Отличия от европейского гаплотипа (изолят из Австрии) - 8 замен нуклеотидов. От североамериканского гаплотипа (изоля-ты с о. Святого Лаврентия и штата Индиана)
Таблица 2.
Количество млекопитающих, исследованных в Новосибирской и Кемеровской областях, и выделенные изоляты E. multilocularis
Вид Новосибирская обл. Кемеровская обл.
Восточноазиатская мышь, Apodemus peninsulae Thom. 1907 - 6
Малая лесная мышь, Apodemus uralensis Pall. 1811 4 -
Мышь-малютка, Micromys minutus Pall. 1771 2 -
Джунгарский хомячок, Phodopus sungorus Pall. 1773 4 -
Барабинский хомячок, Cricetulus barabensis Pall. 1773 1 -
Рыжая полевка, Myodes glareolus Schreb. 1780 - 1
Красная полевка, My. rutilus Pall. 1779 1 5
Красно-серая полевка, My. rufocanus Sundev. 1846 - 6
Узкочерепная полевка, Microtus gregalis Pall. 1779 21 13
Полевка-экономка, M. oeconomus Pall. 1776 1 21
Рыжая лисица, Vulpes vulpes L., 1758 1 -
Всего 35 52
Таблица 3.
Оригинальные изоляты Echinococcus multilocularis
Изолят Территория Координаты Вид хозяина
Rus-Kem1 Яшкинский район, Кемеровская область 55° 53' N, 85° 13' Е Myodes rufocanus
Rus-Kem2 Яшкинский район, Кемеровская область 55° 53' N, 85° 13' Е Microtus oeconomus
Rus-Nsk1 Карасукский район, Новосибирская обл. 53° 43' N, 77° 52' E Microtus gregalis
Rus-Nsk2 Здвинский район, Новосибирская область 54° 34' N, 78° 08' E Vulpes vulpes
изучаемые последовательности отличаются по 10-11 позициям. От гаплотипа из Внутренней Монголии (Китай) изучаемые последовательности отличны по 25-26 заменам.
Обсуждение
Исследования внутривидовых вариаций возбудителя альвеолярного эхинококкоза показали неоднородность его морфологических, биологических и генетических признаков. В составе E. multilocularis помимо типо-
вого подвида E. multilocularis multilocularis, описанного с территории Западной Европы, выделяют E. multilocularis sibiricensis Rausch, Schiller, 1954, описанный ранее как самостоятельный вид [18] от человека, грызунов, песцов и собак с острова Святого Лаврентия. Основываясь на данных (вероятно, ошибочных) о возможности заражения казахстанским изолятом овец, был выделен еще один подвид E. multilocularis kazakhensis Schulz, 1962. Позднее, изучая морфологические
phc. 1. CeTb rannoTHnoB Echinococcus multilocularis.
Таблица 4.
Различия последовательностей coxl гаплотипов Echinococcus multilocularis
Позиция
3 1 7 9 1 6 5 1 9 9 2 3 7 2 7 6 2 8 9 3 3 3 3 3 6 3 4 6 3 6 4 4 8 6 5 0 7 5 8 5 6 7 5 6 8 8 6 9 0 7 3 5 7 4 2 7 6 0
Нуклеотид
Asian CN T A T A T G T A A T G T G G T C A T C A
Rus-Kem1
Rus-Kem2
Rus-Nskl
Rus-Nsk2 C
Asian KZ
Europe AU C C C T G T
NA SL C G T G
NA US C A T G G
Mongolian G C G A C T G A T G G T
Позиция
7 9 5 00 о о 8 2 2 9 2 6 1 0 1 5 1 1 0 7 1 1 5 2 1 2 1 5 1 2 4 9 1 2 9 3 1 3 1 4 1 3 2 9 1 3 5 1 1 3 8 9 1 3 9 8 1 4 3 4 1 4 8 8 1 5 0 9 1 5 4 8 1 5 7 3
Нуклеотид
Asian CN T C G C T C A G A T T A G G G A A T T A
Rus-Kem1 G
Rus-Kem2 G
Rus-Nskl G
Rus-Nsk2 G
Asian KZ G G
Europe AU A
NA SL T C G A G
NA US T G A G
Mongolian G C T G A G G A T G C C
Примечание: «.» - совпадающие нуклеотиды, G, Т, А, С - замены в соответствующих позициях.
и биологические особенности E. multi-locularis с разных территорий, китайские исследователи [20, 21] описали новый вид Echinococcus russicensis Tang et al., 2006 c территории Внутренней Монголии (Китай). Название «русский» было дано на основе предположения, что основной его ареал находится на территории российского Забайкалья и Дальнего Востока. Несмотря на спорность некоторых таксономических действий, наличие внутривидовых различий, затрагивающих эпидемиологически важные свойства возбудителя альвеолярного эхинокок-коза человека, не подвергается сомнению.
Исследования мтДНК представителей рода Echinococcus показали, что последовательности генов cox1, nd2, cob могут быть использованы для маркирования видовых и внутривидовых категорий [15]. Внутривидовая характеристика E. multilocularis была наиболее подробно изучена Накао с соавторами [16]. В составе вида различают четыре генотипа, по всей видимости, сохраняющих свою генетическую изолированность, благодаря приуроченности к разным окончательным хозяевам (песец, лисица, корсак) либо территориальной обособленности (центрально-европейский очаг). Каждый генотип представлен различными гаплотипами, выделяемыми на основании последовательностей мтДНК. Наибольшее разнообразие гаплотипов на данный момент известно для азиатского генотипа E. Multilocularis, имеющего самый большой ареал. Европейский генотип близок к азиатскому, что, возможно, связано с относительно недавней его изоляцией. Североамериканский и монгольский генотипы генетически дистанцированы от европейского и азиатского (рис. 1), что соответствует и их биологическим и морфологическим различиям.
Наши данные показали, что генетическая близость изолятов, выделенных на основе последовательностей мтДНК из Кемеровской, Новосибирской областей и Казахстана, позволяет предположить, что на данной территории имеется единый природный очаг альвеолярного эхинококкоза. Его разделение на отдельные очаги по административному или географическому призна-
кам искусственно. Само выделение очагов производилось по количеству случаев заболевания человека, что не совсем обосновано для природно-очагового заболевания. Эта территория является практически непрерывным ареалом азиатского генотипа цестоды E. multilocularis. Численность паразита в пределах ареала неоднородна и может зависеть от плотности промежуточных и окончательных хозяев.
При этом особи, имеющие разные гапло-типы, выделяемые на основании одной-двух замен пар нуклеотидов в последовательности гена cox1, по всей видимости, являются членами единой популяции. Для понимания общности или изолированности «якутского», «сибирского» и других выделяемых очагов или эндемичных районов, необходимо проведение крупномасштабных исследований генотипического разнообразия возбудителя альвеолярного эхинококкоза в Сибири.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты: 11-04-00870-а, 12-04-10171-к), а также Japan Society for the Promotion of Science (1256003, 24256002 to A. Ito).
Список литературы
1. Альперович, Б. И. Альвеококкоз и его лечение / Б. И. Альперович. - 2-е изд., перераб. и доп. - М. : Медицина, 1972. - 271 с.
2. Бессонов, А. С. Альвеолярный эхинококкоз и ги-датидоз / РАСХН. - М., 2003. - 334 с.
3. Быкова А. М. Гельминты хищных млекопитающих (Canidae, Felidae, Mustelidae) в Омской области и их эколого-фаунистический анализ // Автореферат на соиск. уч. степ. канд. биол. наук. Омск, 2007. - 26 с.
4. Громов, И. М. Млекопитающие фауны России и сопредельных территорий. Зайцеобразные и грызуны / И. М. Громов, М. А. Ербаева. - СПб., 1995.
5. Каденации, А. Н. К изучению эхинококкоза у лисиц и волков в Омской области / А. Н. Каденации. // Работы по гельминтологии: сб. работ по гельминтологии к 80-летию К. И. Скрябина. - М., 1959. - С. 72-75.
6. Лейкина, Е. С. К вопросу о природных очагах многокамерного эхинококкоза в Новосибирской области / Е. С. Лейкина, Н. П. Лукашенко, В. И. Зори-хина, Б. К. Лавренов, М. М. Мамедов // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - М., 1959. -№ 2. - С. 206-213.
7. Лукашенко, Н. М. К познанию природных очагов альвеококкоза (альвеолярного эхинококкоза) в Ба-рабинской лесостепи / Н. М. Лукашенко // Тезисы докладов научной конференции всесоюзного общества гельминтологов. - М., 1960. - С. 76-77.
8. Лукашенко, Н. М. Эпидемиология альвеокок-коза (альвеолярного эхинококкоза) в центральных
районах Барабинской лесостепи / Н. П. Лукашенко,
B. И. Зорихина // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - М., 1961. - № 2. - С. 159-168.
9. Лукашенко, Н. П. Альвеококкоз / Н. П. Лукашенко. - М. : Медицина, 1975. - 328 с.
10. Никулина, Н. А. Генотипирование изолятов Echinococcus granulosus и E. multilocularis из разных регионов России / Н. А. Никулина, М. М. Гараев, И. М. Одоевская и др. // Материалы конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными заболеваниями», под. ред. Успенский А.В. - М. : Россельхозака-демия, 2003. - Вып. 4. - С. 285-287.
11. Шахматова, В. И. О природных очагах альве-ококкоза в Сибири / В. И. Шахматова // Биологические проблемы природной очаговости болезней; под ред. Максимова А. А. - Новосибирск : Наука, 1981. -
C. 123-134.
12. Clement, M. TCS: a computer program to estimate gene genealogies / M. Clement , D. Posada , K. A. Crandall // Molecular Ecology, 2000. - V. 9 (10). - P. 1657-1660.
13. Hüuttner, M. Genetic characterization and phylogenetic position of Echinococcus felidis Ortelepp, 1937 (Cestoda: Taeniidae) from the African lion / M. Hüuttner, M. Nakao, T. Wassermann, L. Siefert, J. D. F. Boomker, A. Dinkel et al. // International Journal of Parasitology, 2008. - Vol. 38. - P. 861-868.
14. Ito,A. Histopathological, serological, and molecular confirmation of indigenous alveolar echinococcosis cases in Mongolia / A. Ito, G. Agvaandaram, O. E. Bat-Ochir, B. Chuluunbaatar, N. Gonchigsenghe, T. Yanagida, Y. Sako, N. Myadagsuren, T. Doijsuren, K. Nakaya, M. Nakao, Y. Ishikawa, A. Davaajav, N. Dulmaa // American Journal Tropical Medicine and Hygiene, 2010. - Vol. 82 (2). - P. 266-269.
15. Nakao, M. State-of-the-art Echinococcus and Taenia: Phylogenetic taxonomy of human-pathogenic
tapeworms and its application to molecular diagnosis / M. Nakao, T. Yanagida, M. Okamoto, J. Knapp, A. Nkouawa, Y. Sako, et al. // Infection, Genetic and Evolution, 2010. - Vol. 10. - P. 444-452.
16. Nakao, M. Geographic pattern of genetic variation in the fox tapeworm Echinococcus multilocularis / M. Nakao, N. Xiao, M. Okamoto, T. Yanagida, Y. Sako and A. Ito // Parasitology International, 2009. -Vol. 58 (4). - P. 384-389.
17. Rausch, R. On the ecology and distribution of Echinococcus spp. (Cestoda: Taeniidae), and characteristics of their development in the intermediate host / R. Rausch // Annales de Parasitologie Humaine et compare, 1967. - V 42. - № 1. - P. 19-63.
18. Rausch, R. Studies on the helminth fauna of Alaska. XXIV. Echinococcus sibiricensis n. sp., from St. Lawrence Island / R. Rausch, E. L. Schiller // Journal Parasitology, 1954. - Vol. 40. - № 6. - P. 659-662.
19. Tamura, K. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods / K. Tamura, D. Peterson, N. Peterson, G. Stecher, M. Nei, S. Kumar // Mol. Biol. Evol., 2011. -28 (10). - P. 2731-2739.
20. Tang, C. T. Comparison observation on the mature alveolar of Echinococcus sibiricensis and Echinococcus multilocularis in the experimentally infected white mice / C. T. Tang, J. A. Chen, L. Tang, G. W. Cui, Y. C. Qian, Y. M. Kang, H. C. Lu // Shi Yan Sheng Wu Xue Bao, 2001. - Vol. 34 (4). - P. 261-268. [Article in Chinese].
21. Tang, C. T. Alveolar Echinococcus species from Vulpes corsac in Hulunbeier, Inner Mongolia, China, and differential development of the metacestodes in experimental rodents / C. T. Tang, Y. H. Wang, W. F. Peng, L. Tang, D. Chen // Journal of Parasitology, 2006. - Vol. 92 (4). - P. 719-724.
