Геномный «Портрет» некоторых видов псовых, полученный с помощью ISSR-PCR и IRAP-PCR маркеров Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ГЕНОМИКА

УДК: 575.17:575.858:575.2 DOI: 10.24411/0023-4885-2020-10104

ГЕНОМНЫЙ «ПОРТРЕТ» НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ПСОВЫХ, ПОЛУЧЕННЫЙ С ПОМОЩЬЮ ISSR-PCR И IRAP-PCR МАРКЕРОВ

В.И. Глазко1,2, Г.Ю. Косовский1, Т.В. Блохина2, А.Г. Есин2, Т.Т. Глазко1,2

1ФГБНУ НИИПЗК

2ФГБОУ ВПО МСХА ИМ. К.А. ТИМИРЯЗЕВА

Межвидовая гибридизация широко распространена, в частности, у ряда видов млекопитающих. Этим мог бы объясняться высокий уровень генетической изменчивости у доместицированных видов по сравнению с близкородственными дикими, однако до сих пор этот вопрос остается недостаточно изученным. В настоящей работе выполнен анализ популяционно-генетических структур трех видов псовых - собаки (Canis familiaris L.), волка (Canis lupus L.), шакала (Canis aureus L.) на основании оценок полиморфизма геномной ДНК (259 фрагментов), фланкированных инвертированными повторами 12-ти микросателлитов (ISSR-PCR маркеры) и длинных концевых повторов 5-ти эндогенных ретровирусов (IRAP-PCR маркеры). Выделены геномные элементы, спектры продуктов амплифкации которых являются видоспецифичными, что позволяет сформировать геномный «портрет» каждого из исследованных видов. Наименьшие значения генетических расстояний по результатам геномного сканирования обнаружены между волками и шакалами, наибольшие - между шакалами и собаками. Полученные данные соответствуют литературным оценкам взаимоотношений между исследованными видами псовых и сохранения видоспецифичности популяционно-генетических структур, несмотря на наличие известных фактов гибридизации между ними. Можно ожидать, что такая видоспецифичность геномного «портрета» по высоко полиморфным геномным элементам поддерживается за счет того, что изменчивость каждого из них определяется контролем различных факторов естественного и искусственного отборов.

Ключевые слова: геномное сканирование, геномный «портрет», ДНК-маркеры, ISSR-PCR, IRAP-PCR, собаки, волки, шакалы

Псовые (Canidae) являются одним из самых распространенных семейств хищников, чей ареал занимает всю территорию России и которое находится в коэволюции с человеком. Известно, что популяционно-генетические взаимоотношения между разными видами семейства псовых (Canidae) во многом остаются дискуссионными. В этой дискуссии важными являются следующие вопросы: 1. о гибридизации между шакалами, волками и собаками [1-3], 2. о времени и количестве очагов одомашнивания собак, 3.о предковой форме домашней собаки [4, 5]; 4 о внутривидовом разнообразии данных видов [6]; 5. о размахе внутривидовой изменчивости исследованных видов по разным генномным элементам.

По фенотипическим характеристикам изменчивость видов псовых очень велика, так, на сегодняшний день описано около 38 подви-

дов волка и 13 подвидов золотистого шакала [5]. Тем не менее, домашняя собака от диких псовых отличается еще большим размахом фенотипиче-ской изменчивости. Например, по данным Международной кинологической федерации количество пород собак составляет около 360 [7]. Такое высокое фенотипическое разнообразие домашней собаки позволяет предполагать и повышенную генетическую изменчивость. В ряде работ выполнены исследования полиморфизма микро-сателлитных локусов, участков митохондриаль-ной ДНК. Они свидетельствовали о том, что у собак изменчивость генома по этим участкам ниже, чем у волков [2, 3, 8]. Предполагалось, что такой пониженный уровень полиморфизма обусловлен у домашней собаки снижением эффективной численности в процессе доместикации. В то же время, остается неясным, чем же обусловлено высокое фенотипическое разнообразие

пород собак.

Другие исследования, проведенные с использованием оценки изменчивости по копийно-сти коротких геномных участков (Copy Number Variability - CNV) свидетельствуют о том, что действительно, предполагаемая предковая популяция собак прошла через снижение эффективной численности в процессе одомашнивания [9]. Более детальный анализ CNV у собак и волков позволил обнаружить, что по частоте встречаемости CNV в геномах эти виды похожи, зато существенно различаются по генам, в которых локализованы CNV [10]. Результаты полногеномного секвенирования также свидетельствовали об относительно повышенном полиморфизме геномных участков локализации генов, продукты которых вовлечены в изменчивость размеров тела у собак, по сравнению с волками [9]. Из этого следует, что результаты сравнительного анализа популяционно-генетических структур принципиально зависят от выбора геномных элементов, по которым они оцениваются.

Полногеномное секвенирование многих видов млекопитающих, в том числе и человека, позволило получить данные о том, что около половины генома исследованных видов представлено мобильными генетическими элементами, они являются наиболее полиморфными и тесно связаны с такими внутригеномными процессами, как CNV [11]. Высокий уровень их полиморфзма, широкая геномная распространенность делают мобильные геномные элементы, так же как микросателлиты, удобными для оценки популяционно-генетического разнообразия [12]. В этой связи, в настоящей работе для сравнительного анализа генетических структур трех видов оценивался полиморфизм фрагментов геномной ДНК, фланкированных инвертированными участками микросателлитов (InterSimple Sequence Repeat - ISSR-PCR маркеры) и фрагментов геномной ДНК, фланкированных длинными концевыми повторами эндогенных ретровирусов (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism - IRAP-PCR маркеры).

Целью выполненной работы по геномному сканированию (полилокусному генотипи-рованию) было получение популяционно-гене-тического «портрета» представителей разных видов псовых по высоко полиморфным геномным элементам - микросателлитам и фрагмен-

там длинных концевых повторов (Long Terminal Repeats - LTR) эндогенных ретровирусов и выделение для каждого вида наиболее полиморфных вариантов. В задачи исследования входили сравнительные оценки полиморфизма по спектрам продуктов амплификации (по доле полиморфных локусов и полиморфному информационному содержанию), выявленных с использованием ISSR-PCR и IRAP-PCR маркеров, поиск фрагментов ДНК, уровень полиморфизма которых специфичен для каждого из рассмотренных видов и может позволить в дальнейшем использовать наиболее полиморфные варианты для выявления особенностей популяционно-ге-нетических структур внутри видов в разных ло-калитетах. На основании оценок полиморфизма 259 локусов рассчитывались генетические расстояния между исследованными группами животных разных видов псовых для сравнения с опубликованными результатами полногеномного секвенирования представителей этих видов.

Объектом исследования являлись волки из разных регионов России, шакалы, отловленные в Краснодарском крае и собаки 10 разных пород (золотистый ретривер, немецкая овчарка, той-терьер, хаски, спаниель, такса, восточноевропейская овчарка, фокстерьер, леонбергер, вельш-корги кардиган), а также беспородные особи.

Материал и методы

В работу включено 20 собак различных пород, 20 волков из разных районов республики Коми, а также особи из Томской, Архангельской, Ростовской областей и республики Карелия, 22 шакала из Успенского и Тбилисского районов Краснодарского края. Для геномного сканирования - праймеров были использованы фрагменты длинных концевых повторов (Long Terminal Repeats - LTR) эндогенного ретровируса Sabrina (5'- AAA-CAA-GAA-CTG-ACA-CTT-GGC-ACT

- 3') [13], LTR-SIRE-1 (5' - GCA-GTT-ATG-CAA-GTG-GGA-TCA-GCA- 3') [14], LTR ретровируса Sukkula (5' - GCA-GCC-TGG-GAT-AGC-AAG-GAT-GG- 3') [15], LTR ESRS (Endogenous Sheep Retroviral Sequences - 5' - GGT-GCA-GGG-GAG-AAG-TGG-AGG-3') [16], LTR BARE-1 (5'

- GAC-ATA-ACC-CCA-CCG-TGT-CCT-C - 3') [17], а также участки микросателлитных локусов: (CAC)7T, (CTC)6C, (ACC)6T, (AGC)6G, (ACC)6C, (AGG)6G, (ACC)6G, (CTC)6G,

(TGC)6G, (GA)9C, (GAG)6C, (AGC)6C. Поли-меразную цепную реакцию (PCR) проводили на амплификаторе «Терцик» со следующими параметрами: первичная денатурация (t= 94 °C, 2 мин), денатурация (t= 94 °C, 30 сек), отжиг (t=58 °С, 30 сек), элонгация (t=72 °С, 2 мин) - 40 циклов, финальная элонгация (t=72 °С, 10 мин). Продукты амплификации разделяли в 1,5% ага-розном геле в ТАЕ-буфере. Визуализацию выполняли при помощи УФ трансиллюминатора. Размеры фрагментов ДНК определяли при помощи маркера молекулярных масс 100 bp+1.5 Kb+3 Kb (12 фрагментов от 100 до 3000 пар оснований - п.о.) М27 (СибЭнзим, Россия). Математическая обработка полученных результатов была осуществлена с помощью компьютерных программ MSExcel и TFPGA.

В качестве популяционно-генетических характеристик использовали долю полиморфных локусов (% полиморфных фрагментов ДНК по отношению к общему количеству амплико-нов, выявленных в спектре каждого праймера) и полиморфное информационное содержание спектра - Polymorphic Information Content (PIC). Расчет PIC выполнялся по формуле для диал-лельных локусов, для которых PIC = 2f (1-f), где f - частота одного из двух аллелей. Поскольку ISSR-PCR и IRAP-PCR маркеры имеют доминантный характер проявления по присутствию продукта амплификации, f рассчитывается по формуле: f=VR, где R - частота встречаемости животных среди исследованных, у которых в спектрах продуктов амплификации отсутствовал фрагмент ДНК данной длины. Значение R рассматривалось как доля гомозигот по рецессивному аллелю (отсутствию фрагмента ДНК определенной длины). Для расчета генетических дистанций применялась методика М.Нея [18].

Результаты и обсуждение

Выполнен анализ полиморфизма фрагментов геномной) ДНК, полученных при использовании в качестве праймеров в полимераз-ной цепной реакции (PCR) участков длинных концевых повторов (LTR) эндогенных ретрови-русов (IRAP-PCR маркеры) и микросателлит-ных локусов (ISSR-PCR маркеры) у трех групп представителей рода волки (Canis). Всего у всех трех видов при данном исследовании суммарно выявлено 259 фрагментов ДНК разной длины.

Сравнительный анализ полиморфизма спектров продуктов амплификации (амплико-нов), получаемых у разных видов с использованием в качестве праймеров фрагментов LTR пяти эндогенных ретровирусов (IRAP-PCR маркеры) свидетельствует о выраженной видоспецифич-ности полиморфизма спектров продуктов амплификации в зависимости от праймера (табл.1).

При анализе количества фрагментов геномной ДНК, фланкированных LTR, отмечено, что наибольшее количество фрагментов у всех трех видов псовых обнаруживается в спектре ампликонов праймера Sabrina, максимальное у собак (18 фрагментов) из которых консервативен внутри вида всего один ампликон. Максимальное количество консервативных внутри вида фрагментов ДНК в спектрах этого праймера выявлено у шакалов (2 консервативных фрагмента из 13-ти). Минимальное количество фрагментов ДНК отмечается в спектрах ампликонов прай-мера BARE-1 у собак (6 фрагментов, из которых консервативны 3, полиморфны 3).

В общем, в спектрах ампликонов, полученных при использовании фрагментов LTR пяти эндогенных ретровирусов в качестве праймеров (IRAP-PCR маркеры), наибольшее количество ампликонов выявлено у собак, затем у волков, минимальное отмечено у шакалов (табл.1). В то же время, наибольший процент полиморфных локусов обнаружен у волков по сравнению с собаками и шакалами (табл.1).

Полиморфизм некоторых IRAP-PCR маркеров в зависимости от праймера, оцененный по полиморфному информационному содержанию (PIC), существенно отличается у разных видов. Так, PIC по LTR-SIRE-1 максимален у волков (0,32), но в два раза меньше у шакалов (0,15) и собак (0,14). PIC спектров праймера Sabrina оказался наибольшим у собак по сравнению с шакалами и волками (табл.2). По LTR Sukkula наивысшие значения выявлены у волков и шакалов, минимальные - у собак.

У собак полиморфизм выше, чем у волков, по двум LTR праймерам - фрагментам эндогенных ретровирусов (Sabrina и ESRS) из пяти использованных (табл.2). Волки отличаются повышенным полиморфизмом спектров прай-меров LTR-SIRE -1, LTR Sukkula и BARE-1 по

сравнению с собаками и шакалами.

В общем, для всех трех видов среди спектров продуктов амплификации, полученных при использовании в качестве праймеров фрагментов длинных концевых повторов пяти эндогенных ретровирусов, наиболее полиморфными по PIC были спектры праймеров Sabrina и LTR-SIRE-1

(табл.2). Для собак повышенный полиморфизм наблюдается по спектру ампликонов праймера ESRS по сравнению с шакалами и волками. Для двух диких видов псовых отмечается несколько повышенный полиморфизм спектров праймеров LTR Sukkula и BARE-1 по сравнению с собаками (табл.2).

Таблица 1. Количество фрагментов ДНК в спектрах продуктов амплификации, полученных при использовании в полимеразной цепной реакции в качестве праймеров фрагментов длинных концевых повторов пяти эндогенных ретровирусов (IRAP-PCR маркеры)

Table 1. The number of DNA fragments in the spectra of amplification products obtained when used in the polymerase chain reaction as primers of fragments of long terminal repeats of five endogenous retroviruses IRAP-PCR markers)

Виды/Species Собаки/Dogs Волки/Wolves Шакалы/Jackals

Праймер/Primer N P C N P C N P C

Sabrina 18 17 1 14 13 1 13 11 2

ESRS 13 9 4 10 5 5 11 5 6

LTR Sukkula 10 4 6 11 11 0 7 5 2

LTR-SIRE1 13 10 3 11 8 3 6 5 1

BARE-1 6 3 3 13 11 2 12 9 3

Суммарное количество/ Total 60 43 (72%) 17 59 48 (81%) 11 49 35 (71%) 14

Примечание:

N - количество выявленных фрагментов геномной ДНК в спектре праймера P - полиморфные фрагменты С - консервативные фрагменты Notice:

N- Number of DNA fragment revealed in the spectrum of a primer P - Polymorphous fragments C - Conservative fragments

Таблица 2. Полиморфное информационное содержание (PIC) спектров продуктов амплификации фрагментов геномной ДНК, полученных при использовании в полимеразной цепной реакции в качестве праймеров фрагментов длинных концевых повторов пяти эндогенных ретровирусов (IRAP-PCR маркеры) у волков, собак и шакалов

Table 2. Polymorphic information content (PIC) of the amplification product spectra of genomic DNA fragments obtained by using in polymerase chain reaction as primers the fragments of long terminal repeats of five endogenous retroviruses (IRAP-PCR markers) in wolves, dogs and jackals

Виды/Species Собаки/Dogs Волки/Wolves Шакалы/Jackals

Праймер/Primer PIC

LTR-SIRE-1 0,14 0,32 0,15

Sabrina 0,25 0,17 0,19

ESRS 0,25 0,22 0,16

LTR Sukkula 0,16 0,36 0,24

BARE-1 0,24 0,30 0,27

Среднее значение/ Mean 0,20 0,27 0,20

Полученные данные свидетельствуют

0 том, что при внутривидовых исследованиях популяционно-генетических структур для собак наиболее информативными (по количеству выявляемых фрагментов и их полиморфизму) будут спектры праймеров Sabrina и ESRS, для волков и шакалов - LTR-SIRE-1, LTR Sukkula и BARE-1.

При оценке полиморфизма спектров ам-пликонов фрагментов 12-ти микросателлитных локусов (ISSR-PCR маркеры) получены следующие данные (табл.3, табл.4).

Наибольшее количество фрагментов геномной ДНК у собак выявлено в спектрах праймеров (CTC)gC и (ACC)gT, наименьшее в спектрах праймеров (TGC)gG (6 фрагментов,

1 полиморфный, 5 консервативных) и (GA)^C

Таблица 3. Количество фрагментов ДНК в спектрах продуктов амплификации, полученных в полимеразной цепной реакции с использованием в качестве праймеров участков 12-ти микросателлитных локусов (ISSR-PCR маркеры)

Table 3. Number of DNA fragments in amplification product spectra obtained in polymerase chain reaction using 12 microsatellite loci (ISSR-PCR markers) as primers

(6 фрагментов: 1 полиморфный, 5 консервативных) (табл.3). Волки более полиморфны по сравнению с собаками и шакалами по ISSR-PCR маркерам (83% полиморфных фрагментов по сравнению с 63% у собак и 66% у шакалов, табл.3). Для волков наибольшее количество зон выявлено с использованием праймера (GAG)6C (21 фрагмент, 19 полиморфных, 2 - консервативных). Самым консервативным у волков является спектр праймера (СТС)^ (7 фрагментов, 2 полиморфных, 5 консервативных). У шакалов максимальное количество ампликонов выявлено с использованием праймера (АСС)^Т (20 фрагментов, 15 полиморфны, 5 - консервативны), а минимальное количество отмечено в спектрах праймера ^А^С (5 фрагментов, 2 полиморфных, 3 - консервативных) (табл.3).

Вид/Species Собаки/Dogs Волки/Wolves Шакалы/Jackals

Праймер/Primer N P C N P C N P C

(CAC)7T 10 7 3 11 6 5 9 5 4

(CTC)6C 19 19 0 18 18 0 14 12 2

(ACC)6T 19 14 5 19 14 5 20 15 5

(AGC)6C 17 15 2 20 18 2 19 11 8

(AGC)6G 13 9 4 12 10 2 10 10 0

(ACC)6C 9 1 8 10 8 2 9 4 5

(AGG)6G 8 2 6 6 4 2 7 2 5

(ACC)6G 16 6 10 18 18 0 11 6 5

(CTC)6G 7 3 4 7 2 5 8 4 4

(TGC)6G 6 1 5 10 10 0 8 5 3

(GA)9C 6 1 5 10 8 2 5 2 3

(GAG)6C 18 15 3 21 19 2 14 12 2

Суммарное количество/ Total 148 93 (63%) 55 162 135 (83%) 27 134 (66%) 88 46

N - количество выявленных фрагментов геномной ДНК в спектре праймера P - полиморфные фрагменты С - консервативные фрагменты Notice:

N- Number of DNA fragment revealed in the spectrum of a primer P - Polymorphous fragments C - Conservative fragments

ГЕномикА

Полиморфизм по праймерам (ACC^C, (TGC)6G и (GA)9C, оцениваемый по полиморфному информационному содержанию (PIC), существенно снижен у собак по сравнению с близкородственными дикими видами (табл.4). В то же время, по спектрам праймеров (CAQ7T и (GAG)6C собаки имеют наивысший показатель PIC среди представителей рода Canis.

Волки характеризовались пониженным полиморфизмом по спектрам прайме-ров (CTC)6G и (ACC)6T. У шакалов отмечено два наиболее полиморфных показателя PIC в сравнении с волками и собаками по спектрам праймеров (ACC^T и (AGC^G. Для праймера (TGC)6G отмечено пониженное значение PIC его спектров у собак; наибольшее значение PIC по спектру данного праймера выявлено у волков. По спектрам праймеров с микросателлитны-ми мотивами ACC и AGC показатели PIC были выше у диких видов псовых. В спектрах прай-мера (AGG)6G пониженные значения отмечены у шакалов. Полиморфизм по фрагментам ДНК, фланкированным динуклеотидным микросателлитом (GA)9C снижен у собак по сравнению с дикими видами псовых, значения PIC по спектру тринуклеотидого праймера (GAG^C у собак выше, чем у волков и шакалов.

Среди микросателлитов, используемых в качестве праймеров, присутствуют такие, как (AGG)6G, (GA)9C, (GAG)6C, (CTC)6G, (CTC)6C, предрасположенные к формированию пурин/пуриновых треков, вовлекаемых, по литературным данным, в регуляторные системы генной экспрессии [19, 20]. Тем не менее, все они существенно отличаются по спектрам ам-пликонов, полученных при использовании их в качестве праймеров. Так, например, спектры ампликонов инвертированных повторов таких пурин-пиримидиновых треков как (GA^C и (GAG)6C существенно отличаются друг от друга: спектр (GA)9C у собак по сравнению с другими видами отличался пониженным полиморфизмом, а (GAG)6C - повышенным у собак по сравнению с волками и шакалами.

Праймеры с одинаковым коровым (элементарной единицы тандемного повтора) мотивом ACC, но с различными якорными ну-клеотидами (нуклеотид на 3' конце праймера), дают разную картину полиморфизма: спектры (ACC)6T по PIC максимально полиморфны у

шакалов, вариабельность по (ACC)gC понижена для собак, но повышена у волков. Суммарно полиморфизм по праймерам с мотивом AGC выше у диких псовых, чем у собак, показатели PIC по (AGC)gG больше всего у шакалов, а (AGC)gC - у волков. Спектры праймера с мотивом СТС также отличаются в зависимости от якорного нуклеотида: для спектров (CTC)gC характерен высокий полиморфизм, сопоставимый у волков, собак и шакалов, для (CTC)gG - полиморфизм снижен у всех трех видов и также сопоставим по значениям. Полученные данные об отличиях количества выявляемых фрагментов (табл.3), значений PIC для спектров ампликонов праймеров с одинаковым коровым мотивом, но с отличиями по якорному нуклеотиду на 3' конце (табл.4), свидетельствуют о высокой точности отжига в полимеразной цепной реакции (PCR), позволяющей амплифицировать разные участки геномной ДНК, несмотря на сходство нуклеотидной последовательности (корового мотива) самого микросателлита.

На основании частот встречаемости фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами LTR эндогенных ретровирусов и участков микросателлитных локусов, рассчитаны генетические дистанции (М.Ней, 1972 [18]). Полученные данные представлены в табл.5.

Представленные значения генетических расстояний свидетельствуют о том, что отличия между видами по этой характеристике существенно варьируют в зависимости от праймера (табл.5). Наиболее генетически близкими видами суммарно по спектрам разных праймеров оказались шакалы и волки, наименее - собака и шакал. Полученные данные хорошо согласуются с результатами полногеномного секвенирвания [19] этих видов, что свидетельствует о преимущественной нейтральности в сумме (259 локусов) геномных участков (ISSR-PCR и IRAP-PCR маркеров), по полиморфизму которых проводились расчеты генетических расстояний.

Минимальные значения генетических дистанций для всех трех видов псовых отмечены по спектрам праймеров LTR-SIRE1 и Sabrina. Наибольшие значения генетических дистанций между собаками и волками выявлены по спектрам праймеров BARE-1, (AGG)6G и (ACC)6G.

Таблица 4. PIC спектров продуктов амплификации фрагментов геномной ДНК, полученных при использовании участков 11-ти тринуклеотидных и 1-го динуклеотидного микросателлитов (ISSR-PCR маркеры) в качестве праймеров для ПЦР у волков, собак и шакалов

Table 4. PIC of amplification spectra of products of genomic DNA fragments in wolves, dogs and jackals obtained at use of 11 - trinucleotide and 1-dinucleotide microsatellites (ISSR-PCR markers) as PCR primers

Вид/Species Собаки /Dogs Волки/Wolves Шакалы/Jackals

Праймер/Primer PIC

(ACC)6T 0,26 0,21 0,29

(ACC)6C 0,02 0,36 0,25

(ACC)6G 0,17 0,39 0,15

(AGC)6C 0,28 0,32 0,17

(AGC)6G 0,23 0,33 0,38

(AGG)6G 0,12 0,26 0,05

(CAC)7T 0,21 0,19 0,18

(CTC)6G 0,16 0,14 0,15

(CTC)6C 0,37 0,39 0,34

(TGC)6G 0,03 0,40 0,25

(GA)9C 0,07 0,28 0,18

(GAG)6C 0,38 0,33 0,30

Среднее значение/Mean 0,19 0,30 0,22

Таблица 5. Генетические дистанции между тремя видами рода Волки (Canis), рассчитанные по ISSR-PCR и IRAP-PCR маркерам

Table 5. Genetic distances between three species of the genus Wolves (Canis) calculated on the ISSR-PCR and IRAP-PCR markers

Межвидовые сравнения/ Interspecies comparisons Волки/Собаки Wolves/Dogs Волки/Шакалы Wolves/Jackals Собаки/ Шакалы Dogs/Jackals Шакалы Тбилисский р-н/ Шакалы Успенский р-н Jackals Tbilisskiy/ Uspenskiy Districts

Праймер/Prmer Величины генетических дистанций между разными видами псовых Genetic distances between canine species

LTR-SIRE-1 0,02 0,03 0,05 0,01

Sabrina 0,02 0,03 0,04 0,02

ESRS 0,10 0,03 0,07 -

LTR Sukkula 0,34 0,04 0,38 -

BARE-1 0,42 0,16 0,14 0,42

(CAC)7T 0,25 0,17 0,07 0,28

(CTC)6C 0,16 0,11 0,16 0,11

(ACC)6T 0,11 0,10 0,15 0,22

(AGC)6G 0,10 0,09 0,23 -

(ACC)6C 0,14 0,21 0,48 -

(AGC)6C 0,20 0,17 0,21 0,05

(AGG)6G 0,33 0,08 0,17 -

(ACC)6G 0,33 0,10 0,53 0,02

(CTC)6G 0,2 0,11 0,23 0,03

(TGC)6G 0,15 0,04 0,20 0,32

(GA)9C 0,15 0,19 0,7 0,02

(GAG)6C 0,13 0,09 0,30 0,03

Среднее значение/Mean 0,18 0,11 0,24 0,12

В общем, по спектрам IRAP-PCR и ISSR-PCR маркеров наименьшие генетические дистанции выявлены между волками и шакалами; шакалы и собаки генетически более удалены друг от друга, по генетическим дистанциям собаки ближе к волкам (табл.5).

Выполнен также анализ присутствия сходных по длине фрагментов ДНК, выявляе-

мых в спектрах продуктов амплификации одновременно у всех трех исследованных видов в спектрах отдельных праймеров (табл.6). Таких фрагментов по IRAP-PCR маркерам (LTR-SIRE-1, Sabrina, ESRS) выявлено 4 локуса (от 725 до 300 п.о.), по ISSR-PCR макерам - 15 локусов (от 1050 до 275 п.о.).

Таблица 6. Сходные по длине фрагменты геномной ДНК, встречающиеся в спектрах ампликонов ряда праймеров собак, волков и шакалов

Table 6. Similar fragments of genomic DNA found in amplicon spectra of a number of primers of dogs, wolves and jackals

№ Праймер/Primer Длина фрагмента ДНК в количестве пар оснований ^^^/Length of a DNA fragment (number of base pairs)

1 LTR-SIRE-1 300

2 Sabrina 400-380

3 ESRS 725-700, 325-300

6 (CAC)7T 810-800, 710-700, 570-500

8 (ACC)6T 700, 475-450

10 (ACC)6C 425-400

11 (AGC)6C 300-275

12 (AGG)6G 1250-1200, 1050-1000

14 (CTC)6G 1050-1000, 675-650, 610-600

16 (GA)9C 980, 900

17 (GAG)6C 550

Всего: /Total: 19 фрагментов/19 fragments

Для всех трех видов чаще всего среди IRAP-PCR маркеров сходные фрагменты по своей длине относятся к «легким», длиной до 725 п.о. Только по ISSR-PCR общие зоны встречаются длиной более 725 п.о. Более короткие фрагменты у трех видов псовых в спектрах IRAP-PCR маркеров свидетельствуют о том, что фланги их инвертированных повторов расположены на более близких расстояниях друг от друга, чем в спектрах ISSR-PCR маркеров.

Сходных по длинам зон, общих для волков и собак меньше, чем таких зон для шакалов и волков, что, в общем, согласуется с результатами оценок межвидовых генетических дистанций (табл. 5).

У каждого вида обнаруживаются фрагменты разной длины геномной ДНК, присут-

ствующие у исследованных представителей определенного вида и не встречавшиеся у животных двух других видов (табл. 7).

Наибольшее количество видоспецифич-ных фрагментов («видовой геномный портрет») отмечено у собак (30 локусов, табл.7). Сниженным количеством видоспецифичных фрагментов среди всех трех видов обладали волки (8 локусов, табл.7). У шакалов выявлено 19 видоспецифичных фрагментов (табл.7). Интересно отметить, что относительно повышенное количество таких зон у гетерогенной группы исследованных собак совпадает с литературными данными о повышенной гомозиготности представителей этого вида по таким ДНК маркерам, как митохондри-альная ДНК [14], некоторые микросателлитные локусы [3]. Накопленные данные подчеркива-

ют св°е°бразие консерватизма и полиморфизма маркеров геномных участков со сходной струк-различных геномных участков даже тогда, когда турной органи3ацией. они принадлежат к одному и тому же типу ДНК

Таблица 7. Фрагменты геномной ДНК, выявленные в пределах особей только отдельного вида, встречающиеся в спектрах ампликонов ряда праймеров у собак, волков и шакалов. Table 7. Fragments of the genomic DNA revealed within animals of a single species found in the spectra of the amplicons of some primers in dogs, wolves and jackals

№ Виды/ Species Собаки/Dogs Волки/Wolves Шакалы/Jackals

Праймер/ Primer Длина фрагмента ДНК в количестве пар оснований (n^yLength of the DNA fragment (number of base pairs)

2 Sabrina - 1500-1480

3 ESRS 600-590 575-550, 450-425

4 L T R Sukkula 970-950, 750-725, 650-625, 450-425 - -

5 BARE-1 2750-2700 275-250, 175-150 625-600

6 (CAC)7T 1200-1150 -

7 (CTC)6C - 975-950, 725-700

8 (ACC)6T 525-500 950-900, 575-550 1300, 1200

9 (AGC)6G 1270-1250, 910-900 - -

10 (ACC)6C 1650-1600, 1525-1500, 13001275,1150-1100 - 525-500

11 (AGC)6C 975-950 - 775-750, 675-650, 425450, 250-225, 200-190

12 (AG%G 610-600 - -

13 (ACC)6G 1450-1400, 1250-1200, 900-875, 850-800, 710-700, 225-200 - 1150-1100

14 (CTC)6G 1275-1250 500-475 -

15 (TGC)6G 975-950, 825-800, 550-520 - 670-650

16 (GA)9C 700, 680, 490 - 600, 450

17 (GAG)6C 800, 700 1000-1100 850

Всего: /Total 30 8 19

На основании полученных данных можно сделать следующее заключение.

Судя по генетическим дистанциям, рассчитанным по 259 локусам, домашняя собака по этим ДНК маркерам ближе к волку, а волк, в свою очередь, ближе к шакалу, чем к собаке; собаки и шакалы наиболее удалены друг от друга. Соответствие литературным данным получен-

ных оценок межвидовых взаимоотношений на основании сравнений полиморфизмов участков геномной ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов и фрагментов эндогенных ретровирусов, свидетельствует о том, что полиморфизм большинства из них вовлекаются в процессы межвидовой дифференциации, несмотря на известные факты межвидовой

ГЕномикА

гибридизации у псовых [3, 5, 19, 22 - 24].

Наиболее консервативными для всех трех видов по длинам оказались фрагменты геномной ДНК, выявляемые в спектрах двух праймеров -(CAC)yT (три «средних» по длинам фрагментов ДНК, длиной в 800-810, 700-710, 500-570 п.о.) и (CTC)6G (три фрагмента, из которых один «тяжелый» длиной в 1000-1050 п.о. и два длиной в 650-675 и 600-610 п.о.).

Суммарно в спектрах всех 17-ти праймеров выявлено 259 фрагментов ДНК. Консервативные по длинам фрагменты для всех трех видов отсутствуют в спектрах 7-ми праймеров: LTR-SIRE1, LTR Sukkula, BARE-1, (CTC)6C, (AGC)6G, (ACC)6G, (TGC)6C.

Величины генетических дистанций были наименьшими между тремя видами псовых по спектрам праймеров LTR-SIRE-1 и Sabrina, а максимальными - по спектрам праймеров (AGG^G, (ACC)6G, (GA)9C, (ACC)6C. По IRAP-PCR и ISSR-PCR маркерам волки более полиморфны, чем собаки и шакалы. У собак повышенный полиморфизм наблюдается по спектрам прайме-ра Sabrina, у шакалов - по спектрам праймера BARE-1. Наибольшее количество внутривидовых консервативных по длинам фрагментов геномной ДНК выявлено у собак, а наименьшее - у волков.

Для собак разных пород характерен сни-

женный полиморфизм по спектрам динуклео-тидного праймера (GA^C по сравнению с волками и шакалами, и высокий полиморфизм по спектрам тринуклеотидного праймера (GAG^C, причем оба микросателлитных локуса относятся к пурин/пиримидиновым трекам, которые, по литературным данным, предрасположены к образованию вторичных структур ДНК, таких как триплексы, и потенциально могут участвовать в сетях регуляции генной экспрессии [20, 21].

Полученные результаты свидетельствуют о том, что видовой геномный «портрет», несмотря на плодовитых межвидовых гибридов, разные регионы доместикации собак, ограниченности предковой популяции домашней собаки, исследованные виды сохраняют видоспецифи-ческие особенности своих популяционно-ге-нетических структур (геномного «портрета»), выявляемые при использовании таких высоко полиморфных ДНК маркеров, как IRAP-PCR и ISSR-PCR. По-видимому, их сохранение обусловлено тем, что изменчивость каждого из исследованных геномных элементов определяется контролем различных факторов естественного и искусственного отборов. Выделение сетей таких элементов, которые являются мишенями их давления, могло бы способствовать увеличению эффективности работы с генофондами исследованных видов.

Список литературы/References

1. Wiener P., Wilkinson S. Deciphering the genetic basis of animal domestication. Proc Biol Sci. 2011; 278 (1722):3161-3170. doi: 10.1098/ rspb.2011.1376

2. Galov, A., Fabbri E., Caniglia R. et al., First evidence of hybridization between golden jackal (Canis aureus) and domestic dog (Canis famil-iaris) as revealed by genetic markers. Royal society open science, 2015; 2(12). http://dx.doi. org/10.1098/rsos.150450

3. Hindrikson, M., Mannil P., Ozolins J. et al., Bucking the Trend in Wolf-Dog Hybridization: First Evidence from Europe of Hybridization between Female Dogs and Male Wolves. PLoS One, 2012. - Vol.7(10). doi: 10.1371/journal. pone.0046465

4. Irving-Pease, E. K., Ryan, H., Jamieson, A. et al., Paleogenomics of Animal Domestication. In book: Population Genomics., Publisher:

Springer, Cham. 2018. Chapter 16, P. 225-272 doi:10.1007/13836_2018_55

5. Fan, Z., Silva P., Gronau I., et al., Worldwide patterns of genomic variation and admixture in gray wolves. Genome Res, 2016. - Vol.26(2). -P.163-173. DOI: 10.1101/gr.197517.115

6. Negi T., Jhala Y.V. Population Genetic Structure of Golden Jackal, Canis aureus in Gujarat, India. Octa Journal of Biosciences, 2015. - Vol. 3(1). - P. 13-17. http://www.sciencebeingjour-nal.com/

7. .The Fédération Cynologique Internationale -http://www.fci.be/en/Nomenclature/

8. Îbi§ O., Aksöyek E., Özcan S. et al., A preliminary phylogenetic analysis of golden jackals (Canis aureus) (Canidae: Carnivora: Mammalia) from Turkey based on mitochondrial D-loop sequences. Vertebrate zoology, 2015. -Vol. 65(3). - P. 391-397

lassais J., Kim J., Davis B.W. et al., Whole genome sequencing of canids reveals genomic regions under selection and variants influencing morphology. Nature Communications, 2019, -Vol. 10:1489 | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09373-w

10. Serres-Armero A., Povolotskaya I.S., Quilez J. et al., Similar genomic proportions of copy number variation within gray wolves and modern dog breeds inferred from whole genome sequencing. BMC Genomics. 2017;18(1):977. doi: 10.1186/s12864-017-4318-x

11. Lanciano S, Mirouze M. Transposable elements: all mobile, all different, some stress responsive, some adaptive? Curr Opin Genet Dev. 2018;49:106-114. doi: 10.1016/j. gde.2018.04.002

12. Календарь Р.Н., Глазко В.И. Типы молекулярногенетических маркеров и их применение // Физиология и биохимия культурных растений. - 2002. - Т. 34. - № 4. - С. 279-296 [Kalendar R.N., Glazko V.I. Types of molecular-genetic markers and their application. Physiology and biochemistry of cultivated plants, 2002, V.34, № 4, P. 279-296]

13. Shirasu K., Schulman A.H., Lahaye T. et al., A Contiguous 66-kb Barley DNA Sequence Provides Evidence for Reversible Genome Expansion. Genome Research, 2000. - Vol. 10(7). - P. 908-915. doi:10.1101/gr.10.7.908

14. Laten H.M., Havecker E.R., Farmer L.M., et al., SIRE1, an Endogenous Retrovirus Family from Glycine max, Is Highly Homogeneous and Evo-lutionarily Young. Mol. Biol. Evol, 2003. - Vol, 20(8). - P. 1222-1230. DOI: 10.1093/molbev/ msg142

15. Kalendar,R., Vicient,C.M., Peleg,O., et al., Large retrotransposon derivatives: abundant, conserved but nonautonomous retroelements of barley and related genomes. Genetics, 2004, 166 (3), 1437-1450

16. Bai J, Bishop JV, Carlson JO et al., Sequence comparison of JSRV with endogenous provirus-es: envelope genotypes and a novel ORF with similarity to a G-protein-coupled receptor. Virology. 1999;258(2):333-43

17. Manninen, I. Schulman, A.H. BARE-1, a co-pia-like retroelement in barley (Hordeum vulgare L.). Plant Mol. Biol., 1993, 22 (5), 829-846

18. Nei M. Genetic distance between populations. The American Naturalist, 1972, V. 106, № 949, P. 283-292

19. Ostrander EA, Wang GD, Larson G et al., Dog10K Consortium. Dog10K: an international sequencing effort to advance studies of canine domestication, phenotypes and health. Natl Sci Rev. 2019 Jul;6(4):810-824. doi: 10.1093/nsr/ nwz049

20. Antonov I, Medvedeva YA. Purine-rich low complexity regions are potential RNA binding hubs in the human genome. F1000Res., 2019, 7:76. doi: 10.12688/f1000research.13522.2

21. Sentürk Cetin N, Kuo CC, Ribarska T et al. Isolation and genome-wide characterization of cellular DNA:RNA triplex structures. Nucleic Acids Res. 2019; 47(5):2306-2321. doi: 10.1093/nar/gky1305

22. Pilot M, Greco C, vonHoldt BM, Randi E et al., Widespread, long-term admixture between grey wolves and domestic dogs across Eurasia and its implications for the conservation status of hybrids. Evol Appl. 2018; 11(5):662-680. doi: 10.1111/eva.12595. eCollection 2018

23. Gopalakrishnan S, Sinding MS, Ramos-Madrigal J et al., Interspecific Gene Flow Shaped the Evolution of the Genus Canis. Curr Biol. 2018; 28(21):3441-3449.e5. doi: 10.1016/j. cub.2018.08.041

24. Chavez DE, Gronau I, Hains T et al., Comparative genomics provides new insights into the remarkable adaptations of the African wild dog (Lycaon pictus). Sci Rep. 2019;9(1):8329. doi: 10.1038/s41598-019-44772-5

GENOMIC "PORTRAIT" OF SOME CANINE SPECIES OBTAINED USING ISSR-PCR AND IRAP-PCR MARKERS

V. I. Glazko1,2, G.Yu. KosovsKY1, T.V. Blokhina2, A.G. Esin2, T.T. Glazko1,2

1 FSBSI NIIPZK

2 MOSCOW AGRARIAN ACADEMY

e-mail: niipzk@mail.ru

Background: Interspecies hybridization is widespread among some species of mammals. The high level of genetic variability in domesticated species compared to closely related wild species a number of researchers explain by interspecies hybridization, but it is still insufficiently studied.

Materials and methods: The comparative analysis of population-genetic structures of three species - dog (Canis familiaris L.), wolf (Canis lupus L.), jackal (Canis aureus L.) on the basis of estimates the polymorphism of genomic DNA fragments (259 fragments) flanked by inverted repeats of 12 microsatellites (ISSR-PCR markers) and long terminal repeats of 5 endogenous retroviruses (fragments of IRAP-PCR markers) was carried out. Results: Primers, according to which the spectra of genomic DNA amplification products are the most polymorphic in all three studied species, as well as only in individual species, were identified. According to genetic distances the smallest values were found between wolves and jackals, the largest - between jackals and dogs.

Conclusion: The data obtained indicate the species specificity of the population-genetic structures of the studied animals, despite the presence of fertile offspring between them. It can be expected that such species-specificity on highly polymorphic markers is maintained due to the fact that the variability of each of the studied genomic elements is determined by the control of various factors of natural and artificial selection.

Key words: genomic scanning, DNA markers, ISSR-PCR, IRAP-PCR, dogs, wolves, jackals

"ФЕНОМЕН ДОМЕСТИКАЦИИ КАК ФАКТОР ЭВОЛЮЦИИ"

www.niiipzk-nauka@mail.ru;www.niipzk@mail.ru и в адрес редакции журнала krolikovodstvo@mail.ru.

«PHENOMENON OF DOMESTICATION AS A FACTOR OF EVOLUTION»

before April 30, 2020 with the Organizing Committee of the www.niiipzk-nauka@mail.ru;www.niipzk@mail.ru

krolikovodstvo@mail.ru

"Krolikovodstvo i Zverovodstvo" http://kipz.su/en/.