CC BY
20
Ромашко Дмитрий Александрович Чернышева Надежда Юрьевна
В 2014 г. окончил Дальневосточный федеральный университет по специальности «математик-экономист». В июне 2015 г. получил диплом по специальности «переводчик английского языка в сфере экономики и бизнеса» и поступил в очную аспирантуру Школы естественных наук ДВФУ (руководители д.ф.-м.н. Е.А. Нурминский и к.м.н. М.П. Исаева). С января 2015 г. начал работу в лаборатории геномной медицины ДВФУ на должности инженер-исследователь.
Объектом исследования молодого ученого являются алгоритмы работы с геномными данными, базами данных, в том числе модификация существующих и создание новых алгоритмов, методов и подходов к обработке данных.
Дмитрий является участником двух научно-исследовательских проектов: ДВФУ «Научный фонд» и ДВО РАН.
В 2014 г. с отличием окончила Дальневосточный федеральный университет по специальности «биохимия» и поступила в очную аспирантуру ТИБОХ ДВО РАН в лабораторию морской биохимии, где работала начиная со 2-го курса под руководством к.м.н. М.П. Исаевой. Основное направление ее диссертационного исследования - поиск генов и геномов морских бактерий, перспективных для применения в биотехнологии, на основе определения полных нуклеотидных последовательностей их геномов.
За время работы в лаборатории Надежда Юрьевна освоила необходимые ей для решения научных задач методы молекулярной биологии, генной инженерии, биоинформатики, микробиологии и новый для лаборатории метод полногеномного секвенирования.
Результаты ее исследований были представлены на международных конференциях.
*ЧЕРНЫШЕВА Надежда Юрьевна - аспирант (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Еляко-ва ДВО РАН, Владивосток), РОМАШКО Дмитрий Александрович - аспирант (Дальневосточный федеральный университет, Владивосток). *Е-таП: [email protected]
Работа выполнена при частичной поддержке Президиума ДВО РАН (грант № 15-1-5-014 «Полногеномное секвенирование морских бактерий из Коллекции морских микроорганизмов - продуцентов уникальных по структуре и действию природных соединений», 2015-2017 гг.).
УДК 577.218
Н.Ю. ЧЕРНЫШЕВА, ДА. РОМАШКО
Геномный анализ гидролитического потенциала морской бактерии Vitellibacter vladivostokensis
Проведено полногеномное секвенирование и дана биоинформатическая характеристика типового штамма Vitellibacter vladivostokensis KMM 3516T. Бактерия содержит последовательности генов, кодирующих 150 про-теаз и 49 гликозид-гидролаз, из которых 31 и 4 соответственно являются экзоферментами. Благодаря этому микроорганизм может выполнять экологические функции, осуществляя разложение органических соединений в круговороте питательных веществ и процессах биоремедиации в океане. Данные свойства могут найти применение в биотехнологии и промышленности.
Ключевые слова: морские бактерии, гидролитические ферменты, геном.
Genome analysis of the marine bacterium Vitellibacter vladivostokensis hydrolytic potential.
N.Yu. CHERNYSHEVA (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok), D.A. ROMASHKO (Far Eastern Federal University, Vladivostok).
We have conducted a whole-genome sequencing and the bioinformatic characterization of the type strain Vitellibacter vladivostokensis KMM 3516T. The bacterium contains sequences of genes encoding 150 proteases and 49 glycoside hydrolases, 31 and 4 of which, respectively, are an exoenzymes. By means of it, microorganism may perform ecological functions, making organic compounds decomposition, nutrient recycling and bioremediation processes in the ocean. These features may be potentially applied in biotechnology and industry.
Key words: marine bacteria, hydrolytic enzymes, genome.
Из морских организмов, которые служат богатым источником разнообразных органических соединений с широким спектром действия и применения, особый интерес представляют морские микроорганизмы - мощные продуценты биологически активных первичных и вторичных метаболитов.
Высокий биотехнологический потенциал микроорганизмов определяется разнообразием ферментативных систем, прежде всего секретируемых гидролитических ферментов, за счет которых микроорганизм способен расти на сложных полимерных субстратах. Как правило, спектр этих систем определяется занимаемой экологической нишей и симбиоти-ческими отношениями микроорганизма [2].
Одним из активно развивающихся подходов при поиске перспективных в биотехнологии ферментов является полногеномное секвенирование. Анализ геномных данных дает возможность предсказывать метаболические сети, ранее неизвестные для изучаемого микроорганизма.
В настоящее время бактерии типа Bacteroidetes рассматриваются в качестве специфичных деструкторов биологических и синтетических макромолекул. Представители этого типа обитают в морской среде с высоким содержанием органических веществ, чаще всего ассоциированы с водорослями и морскими беспозвоночными, а также обнаруживаются в морских отложениях [1].
Типовой штамм Vitellibacter vladivostokensis KMM 3516T был изолирован из кишечника голотурии Apostichopus japónicas в 1997 г. и валидно описан как новый вид в 2003 г. [4]. На сегодняшний день род Vitellibacter включает четыре вида: V. vladivostokensis, V. aestuarii [3], V. soesokkakensis [5] и V. nionensis [6]. В настоящее время доступен только один черновой геном V. vladivostokensis KMM 3516T, полученный малазийской группой исследователей [7].
Целью данной работы являлось проведение полногеномного секвенирования и разработка биоинформатических подходов к поиску и анализу секретируемых гидролитических ферментов, кодируемых геномом V. vladivostokensis.
Генетический материал KMM 3516T был получен с использованием набора NucleoSpin (Macherey-Nagel, Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Полногеномное секвенирование проведено с использованием технологии пиросеквенирования с реактивами серии Titanium на приборе GS Júnior (Roche diagnostics, 454). Сборка генома de novo осуществлена с помощью программы Newbler v.3.0 (Roche diagnostics). Автоматизированная аннотация выполнена на сервере RAST и вручную посредством BLAST, с использованием баз данных NCBI, Swiss-Prot, COG и KEGG.
Черновой геном был собран de novo в 36 контигов (N50 = 176,552 п.н.) с 24-кратной глубиной покрытия, размер оценен в 3,257,766 п.н., ГЦ состав - 40,8 %. В процессе автоматического аннотирования были обнаружены 3195 кодирующих последовательностей, из которых 904 аннотированы и включены в функциональные подсистемы сервера RAST, 896 аннотированы, но не в составе подсистем, а 1367 последовательностей кодируют гипотетические белки.
Для биоинформатического поиска гидролитических ферментов в исследуемом геноме был разработан алгоритм автоматизации процесса. Создана локальная offline-база данных, содержащая объединенную информацию о нуклеотидных и белковых последовательностях ферментов всех классов на основе баз данных CAZy и MEROPS, позволяющая осуществлять поиск гидролитических ферментов в любой целевой последовательности или геноме. При создании индексированной базы данных в формате BLAST был использован высокоуровневый язык программирования python и совместимый с ним редактор sublime text, для работы с web подключена библиотека urllib. Анализ на предмет наличия N-концевых сигнальных последовательностей выполнен с помощью программы SignalP v.3.0 для грамотрицательных бактерий.
Геном KMM 3516T содержит последовательности генов, кодирующих 150 протеаз и 49 гликозид-гидролаз, из которых 31 и 4 соответственно являются экзоферментами. Список гидролитических ферментов, в которых были идентифицированы N-концевые сигнальные последовательности, приведен в таблице.
Гидролитические ферменты V. vladivostokensis, содержащие N-концевые сигнальные последовательности
Ген Предсказанная функция белка Размер белка (ао.) Длина сигнального пептида (а.о.) Вероятность наличия сигнального пептида
Протеолитические ферменты
222 Бета-лактамаза семейства S12 237 24 0,836
432 Карбиксипептидаза семейства S41A 465 23 0,770
643 Протеаза II семейства S09A 713 21 0,624
1016 Аминопептидаза С семейства С01В 373 18 0,682
1061 Металлоэндопептидаза семейства М16В 968 22 0,630
1073 Металлопептидаза семейства М36 1149 21 0,570
1115 Сериновая петидаза семейства S41A, процессирующая С-конец белков 740 20 0,632
Ген Предсказанная функция белка Размер белка (ао.) Длина сигнального пептида (а.о.) Вероятность наличия сигнального пептида
1196 Zn-зависимая аминопептидаза семейства М01 769 21 0,866
1302 Родоназа семейства и73 218 17 0,575
1310 Аминопептидаза семейства M28D 464 24 0,729
1670 Аминопептидаза семейства М28В 335 19 0,604
1803 Металлопептидаза семейства М01 645 21 0,664
1837 Zn-зависимая аминопептидаза семейства М01 645 23 0,901
2007 Пептидаза семейства М04 707 19 0,818
2410 Металлопептидаза МЕР2 семейства М36 867 18 0,743
2471 Цинковая металлопротеиназа семейства М04 1017 24 0,847
2639 Аминопептидаза Y семейства М28А 389 21 0,805
2674 Сериновая протеаза субтилизинового типа семейства S08A 544 19 0,836
2857 Неохарактеризованный белок семейства S46 723 17 0,869
2858 Дипептид-карбоксипептидаза семейства М03А 709 16 0,592
2877 Неохарактеризованный белок семейства С25 1286 19 0,733
2901 Zn-зависимая аминопептидаза семейства М28Е 485 20 0,844
2951 Zn-зависимая аминопептидаза семейства М20В 273 20 0,628
2969 Неохарактеризованный белок семейства М23В 564 17 0,598
3036 Дипептидилпептидаза-4 семейства S09B 727 22 0,697
3071 Дипептидилпептидаза-5 семейства S09C 633 18 0,798
3117 Неохарактеризованный белок семейства S46 714 19 0,584
942 Пептидаза семейства и73 190 19 0,878
2452 Периплазматический фактор с муреин-гидролазной активностью EnvC/YibP семейства М23В 432 21 0,855
20 Zn-зависимая аминопептидаза семейства М01 612 19 0,845
Ферменты, участвующие в гидролизе полисахаридов
78 Мультимодальная транспептидаза-трансгликозилаза семейства GT51 789 18 0,638
1421 Бета-гексозаминидаза семейства GH3 973 19 0,570
1687 Трансгликозилаза D семейства GH23 523 20 0,820
418 Трансгликозилаза D семейства GH23 307 23 0,611
Примечание: а.о. - аминокислотный остаток.
Штамм KMM 3516T осуществляет гидролиз внеклеточных белков главным образом посредством пептидазы семейства S08 (2674), являющейся сериновой протеазой -аналогом субтилизина, применяемого в производстве стиральных порошков.
Потенциально перспективными для создания новых лекарственных агентов, а также диагностических маркеров являются ферменты семейства C01 (1016) и M28 (1310, 1670, 2639, 2901). Пептидаза семейства M20 (2951) участвует в заключительных процессах превращения белков до свободных аминокислот, и, как полагают, ферменты данного семейства могут найти применение в терапии для адресной доставки лекарств.
Некоторые из секретируемых пептидаз задействованы в клеточном метаболизме бактерии. Так, сериновые пептидазы семейства S41 (432, 1115) важны в процессах деградации некорректно синтезированных белков. Известно, что пептидазы семейства S09 (643, 3036, 3071) осуществляют процессы деградации биологически активных пептидов, а семейства М04 (2007, 2471) - гидролиз внеклеточных белков и пептидов для питания бактерии, особенно перед процессами споруляции.
Все идентифицированные ферменты гидролиза полисахаридов выполняют ряд функций, включая деградацию целлюлозной биомассы, перестройку растительной и бактериальной клеточной стенки, энергетический обмен и защиту бактерии от патогенов.
Таким образом, морская флавобактерия V. vladivostokensis является потенциальным продуцентом комплекса гидролитических ферментов, разлагающих органические и неорганические полимеры. Наибольшую долю среди потенциально секретируемых гидролаз составляют протеолитические ферменты различных типов, что позволяет бактерии существовать на широком спектре субстратов. Идентифицированные ферменты перспективны для применения в биотехнологии.
Благодаря применению метода полногеномного секвенирования и биоинформатиче-ской обработки генерируемых данных в сочетании с методами классического лабораторного подхода к описанию и характеристике штамма KMM 3516T, стало возможным получить более полную информацию о метаболических путях организма, в том числе о путях биодеградации, а также изучить ключевые ферменты, задействованные в данных процессах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Bennke C.M. Distribution and function of marine Bacteroidetes: Doct. diss. / Univ. Bremen, Germany, 2014.
2. Chróst R.J., Siuda W. Ecology of microbial enzymes in lake ecosystems // Enzymes in the Environment: Activity, Ecology and Applications / eds R. Burns, R. Dick. N.Y.: Mercel Dekker, 2002. P. 35-72.
3. Kim B.S., Kim O.S., Moon E.Y., Chun J. Vitellibacter aestuarii sp. nov., isolated from tidal-flat sediment, and an emended description of the genus Vitellibacter // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010. Vol. 60. P. 1989-1992.
4. Nedashkovskaya O.I., Suzuki M., Vysotskii M.V., Mikhailov V.V. Vitellibacter vladivostokensis gen. nov., sp. nov., a new member of the phylum Cytophaga—Flavobacterium—Bacteroides // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. Vol. 53. P. 1281-1286.
5. Park S., Lee K.C., Bae K.S., Yoon J.H. Vitellibacter soesokkakensis sp. nov., isolated from the junction between the ocean and a freshwater spring and emended description of the genus Vitellibacter // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2014. Vol. 64. P. 588-593.
6. Rajasabapathy R., Mohandass C., Yoon J.-H., Dastager S.G., Liu Q., Khieu T.-N., Son C.K., Li W.-J., Colaco A. Vitellibacter nionensis sp. nov., isolated from shallow water hydrothermal vent of Espalamaca, Azores // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2014. Vol. 65. P. 692-697.
7. Thevarajoo S., Selvaratnam C., Chan K.-G., Goh K.M., Chong C.S. Draft genome sequence of Vitellibacter vladivostokensis KMM 3516T: A protease-producing bacterium // Mar. Genomics. 2015. - http://dx.doi.org/10.1016/). margen.2015.04.009.
