CC BY
41
ГЕНОМНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Павел Морозик,
завлабораторией генетики человека Института генетики и цитологии НАН Беларуси, кандидат биологических наук, доцент
Надежда Рябоконь,
ученый секретарь Института генетики и цитологии НАН Беларуси, кандидат биологических наук
Елена Михаленко,
ведущий научный сотрудник
Института генетики и цитологии НАН Беларуси,
кандидат биологических наук
Лариса Сивицкая,
ведущий научный сотрудник
Института генетики и цитологии НАН Беларуси,
кандидат биологических наук
Аннотация. В рамках научно-технической программы Союзного государства «ДНК-идентификация» (2017-2021 гг.) разрабатываются эффективные и конкурентоспособные геномные технологии определения генетических механизмов и рисков развития сердечно-сосудистых, эндокринных, аутоиммунных, костно-мышечных, онкологических и некоронарогенныхзаболеваний сердца. Ключевые слова: геномные технологии, генетические маркеры, оценка генетического риска, персонализированная медицина.
Улучшение качества жизни населения - одна из важнейших задач, входящая в приоритеты общей согласованной социальной политики Союзного государства [1]. Решение этой проблемы, предлагаемое в рамках научно-технической программы Союзного государства «ДНК-идентификация» (2017-2021 гг.), основано на разработке принципиально новых ДНК-технологий для профилактики и лечения широко распространенных заболеваний. Геномные технологии уже показали высокую эффективность в различных сферах по сравнению с ранее применявшимися методами и алгоритмами, а их использование в целях персонализированной медицины находятся на передовом крае науки [2].
Одно из мероприятий программы направлено на разработку геномных технологий определения риска развития широко распространенных заболеваний (сердечно-сосудистых, эндокринных, аутоиммунных, костно-мышечных, онкологических и некоронарогенных) в белорусской популяции и осуществляется коллективом Института
генетики и цитологии НАН Беларуси в сотрудничестве с учреждениями Министерства здравоохранения. Исследуемые заболевания зависят от генотипа и ряда других факторов, включая образ жизни, условия окружающей среды, инфекции и др. Оценка генетической предрасположенности к мультифак-ториальной патологии основана на изучении ассоциации фенотипических проявлений с индивидуальными особенностями (вариациями) структуры генома. При этом анализируется не один, а ряд генов, которые могут быть вовлечены в развитие заболевания. Молекулярно-генетический анализ структуры большого количества генов наиболее эффективно проводится с использованием современных технологий высокопроизводительного секвениро-вания (технология секвенирования нового поколения - NGS) в комплексе с биоинформационным анализом большого массива полученных данных.
В ходе выполнения работ в рамках Союзной программы осуществляется поиск генетических маркеров (мутации или одиночные нуклеотидные полиморфизмы - SNP) для каждого заболевания, что в дальнейшем будет использовано для оценки риска их развития еще до клинического проявления.
ЗАБОЛЕВАНИЯ
СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ
Выяснение генетических основ сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) - инфарктов, инсультов, тромбоэмболий легочных артерий, венозных тромбозов и др. - очень актуально, поскольку именно они являются первой причиной смертности в мире.
Частота их диагностирования в Беларуси выше, чем в среднем по Европе, а смертность от ССЗ в республике в 2015 г. составила 505,1 на 100 тыс. человек [3].
Выявлено несколько десятков генетических вариантов, носительство которых ассоциировано с развитием протромботических сдвигов в системе гемостаза и риском атеротромбоза. Большинство из них кодирует компоненты плазменного и тромбоцитар-ного звеньев гемостаза [4].
Цель проводимого в рамках программы «ДНК-идентификация» исследования - разработка инновационной ДНК-технологии, позволяющей определить индивидуальный генетический риск развития заболеваний тромбогенного характера. Для его оценки пациентам с ССЗ было проведено геноти-пирование по ряду полиморфных вариантов генов, отвечающих за функционирование систем гемостаза и антигемостаза, липидного обмена и регуляцию тонуса сосудов. Анализ полученных результатов позволяет c уверенностью констатировать наличие связи ряда полиморфных вариантов генов и их комбинаций с выбранными заболеваниями. У пациентов с выбранными нозологиями выявлено от 1 до 13 наследственных факторов риска, в большинстве случаев их количество равнялось 7, причем как среди мужчин, так и среди женщин (рис. 1). По итогам проведенных исследований составлен реестр наиболее информативных генетических маркеров риска возникновения заболеваний тромбогенного характера, что позволит определять индивидуальный риск их развития, разработать методики оценки вероятности их возникновения и медицинской профилактики на основе молекулярно-генетического анализа.
ЗАБОЛЕВАНИЯ ЭНДОКРИННОЙ СИСТЕМЫ
Актуальность проблемы медицинской профилактики моно-и сочетанных эндокринных заболеваний, нейроэндокрин-ных и метаболических нарушений определяется не только высокой численностью пациентов, страдающих данными недугами, но и сохраняющейся тенденцией к росту их числа, отсутствием единых подходов к оценке генетических рисков, проведению ранней медицинской профилактики сочетанных эндокринных и метаболических нарушений, развития
Рис. 1. Распределение факторов риска сердечно-сосудистой патологии у обследованной популяции
преддиабета, сахарного диабета, аутоиммунной и неопластической патологии щитовидной железы у молодых людей [5].
Ключевым компонентом предиктивной медицины является стратификация риска заболеваний. Чем раньше будет выявлен повышенный риск развития болезни, тем эффективнее будет профилактика. Своевременная коррекция образа жизни и применение соответствующих препаратов позволит избежать тяжелых осложнений или вовсе предотвратить манифестацию заболевания.
В ходе выполнения заданий программы «ДНК-идентификация» создана коллекция из более чем 600 образцов биологического материала лиц, отвечающих критериям отбора. Для молекулярно-гене-тического анализа выбраны по литературным данным ДНК-маркеры, ассоциированные с развитием ожирения, инсулинрезистентности, сахарного диабета 2 типа, артериальной гипертензии, патологии щитовидной железы (70 ДНК-маркеров), определяющие индивидуальную чувствительность пациентов к фармакологическим препаратам (12), влияющие на эффективность реабилитации людей с соче-танными эндокринными заболеваниями (23).
Разработан проект алгоритма индивидуальной оценки анамнестических рисков, учитывающий основные клинически значимые данные анамнеза пациента. По результатам проведенного геноти-пирования выявлены 5 полиморфных вариантов в гене, ассоциированном с ожирением (РТО), частоты минорных аллелей которых были более распространены у больных сахарным диабетом 2 типа. В группе лиц с этим заболеванием частота полиморфного варианта Г82229616 гена меланокортина ЫС4Я в 4,8 раза меньше наблюдаемой в контрольной группе. Установлено, что у носителей данного аллеля существенно снижен риск развития ожирения и метаболического синдрома.
На основе полученных информативных маркеров будет разработан персонифицированный подход к медицинской профилактике, что позволит снизить частоту развития преддиабета, сахарного диабета, тироидных нарушений и ассоциированных сердечно-сосудистых событий на 15-25%.
ЗАБОЛЕВАНИЯ
КОСТНО-МЫШЕЧНОЙ СИСТЕМЫ
Основная цель работ по изучению генетических аспектов патологии костно-мышечной системы -разработка инновационной ДНК-технологии, позволяющей с помощью современных молекулярно-ге-
нетических методов анализа ДНК найти наиболее информативные варианты генов, регулирующих процессы костного метаболизма и оценить риск развития заболеваний.
Одним из наиболее тяжелых заболеваний костно-мышечной системы является остеопороз, характеризующийся снижением минеральной плотности костной ткани и приводящий к повышенной ломкости костей [6]. Недуг развивается у каждой третьей женщины в менопаузе и у каждого пятого мужчины в возрасте старше 50 лет, и его частота в мире постоянно возрастает. Длительное время остеопороз протекает бессимптомно, и информация о генетической предрасположенности к нему может помочь провести своевременную профилактику и диагностику [7].
В лаборатории генетики человека Института проанализированы образцы ДНК 593 пациентов с осте-опорозом и лиц контрольной группы, которым проведено анамнестическое, клиническое и лаборатор-но-инструментальное обследование с определением уровня минеральной плотности костей методом денситометрии. Создан реестр генов-кандидатов предрасположенности к остеопорозу, включающий информативные для белорусской популяции гены, вовлеченные в костный метаболизм, гомеостаз кальция, регуляцию активности остеобластов и остеокластов, гормональной дисфункции, костного матрикса. На основе реестра разработана и апробирована оригинальная остеопанель, позволяющая с помощью технологии секвенирования нового поколения проанализировать полиморфные варианты в белок-ко-дирующей последовательности 29 генов одновременно у 192 человек.
Молекулярно-генетический анализ позволил выявить 12 генетических маркеров, существенно повышающих риск остеопороза, в генах коллагена I типа (COL1A1 и COL1A2), рецептора витамина Д (VDR), остеопротегерина (OPG), рецептора эстрогена (ESR1) и кальцитонина (CALCA). На данный момент модель оценки индивидуального риска остеопороза, построенная из 12 маркеров, имеет хорошую прогностическую ценность (AUC=0,79) с высоким уровнем чувствительности (82,9%) и средней специфичностью (69,4%).
По результатам проведенных исследований выявлен также комплекс информативных фармакоге-нетических маркеров чувствительности человека к терапии остеопороза. Разработанная молекуляр-но-генетическая технология оценки эффективности лечения включает 6 генетических маркеров и дает возможность заранее прогнозировать ответ на лечение бисфосфонатами [8].
С помощью технологии секвенирования изучена мутационная изменчивость белок-кодирующей последовательности генов коллагена I типа, найдены патогенные мутации у 59 из 90 пациентов с несовершенным остеогенезом. Впервые в мире идентифицированы и описаны 12 из них (рис. 2).
Результаты исследований переданы медицинским работникам, что позволило им верифицировать тип несовершенного остеогенеза и исходя из этого индивидуализировать терапию пациентов.
АУТОИММУННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ
Работы по геномике аутоиммунных заболеваний направлены на выявление молекулярно-гене-тических маркеров предрасположенности к наиболее распространенным заболеваниям этой группы у детей и взрослых и на создание геномных технологий определения риска их развития.
При аутоиммунной патологии клетки и ткани собственного организма распознаются иммунной системой как чужеродные, вследствие чего наносятся повреждения отдельным органам и организму в целом. Подавляющее большинство таких заболеваний имеют мультифакториальную (полигенную) природу, при этом генетическим вариациям как триггеру появления и развития проблем с аутоимму-нитетом отводится около 30%, к другим факторам, провоцирующим аутоиммунную реакцию, относятся инфекции, загрязнение окружающей среды, курение и пр. [9].
Особое место среди полигенных аутоиммунных заболеваний занимают системные формы, при которых вследствие аутоиммунной реакции повреждается соединительная ткань, как правило, многих органов и систем организма. Среди них наиболее
распространенные - ревматоидный артрит у взрослых и ювенильный идиопатический артрит, системная красная волчанка и ювенильная форма системной красной волчанки, склеродермия и ювенильная системная склеродермия, а также болезнь Кавасаки, преобладающая у мальчиков в возрасте до 5 лет. Все они находятся в фокусе наших молекулярно-генети-ческих исследований. Созданы коллекции из более чем 1700 образцов ДНК, которые депонированы для использования в научных целях в Республиканский банк ДНК человека, животных, растений и микроорганизмов.
В рамках программы Союзного государства изучено 27 генетических локусов, среди них выявлено 16 аллелей и генотипов, которые могут быть применены в качестве ДНК-маркеров предрасположенности к аутоиммунным заболеваниям у детей. Наибольшее их количество (8) обнаружено для ювенильного идиопатического артрита (рис. 3). При этом для локуса Г81048990 гена PSMA6 про-теасомной системы деградации белков, кодирующего протеасомную субъединицу аб, ассоциация с аутоиммунным заболеванием на примере ювенильного идиопатического артрита показана впервые [10]. В этой же работе продемонстрирована возможность участия других протеасомных генов, и в частности PSMA3 (гз2348071) субъединицы а3 протеасомы, к возникновению этого заболевания и болезни Кавасаки. Кроме того, подтверждена связь генов иммунного и воспалительного ответов (1Ь-6, ТКАП/С5 и др.) с указанной патологией у детей [11, 12]. Анализ генов главного комплекса гистосовме-стимости (ИЬА) позволил выявить аллели и гапло-типы, ассоциированные с риском возникновения наиболее распространенной формы ювенильного артрита - олигоартикулярной [13].
Рис.2. Спектр мутационной изменчивости генов коллагена I типа у пациентов с несовершенным остеогенезом. Оранжевым и красным шрифтом отмечены впервые выявленные мутации
В ходе изучения генетических вариантов, ассоциированных с ревматоидным артритом у взрослых в белорусской популяции, установлены как общие с ювенильным идиопатическим артритом (11-6 ^1800795 и ТВЛ¥1/СБ ^3761847) [11], так и специфические (БТЛТ4 Г87574865) ДНК-маркеры этого заболевания.
Полученные данные позволят выявлять среди взрослых и детей группы риска возникновения системных аутоиммунных заболеваний, что может быть использовано для проведения профилактических мероприятий, своевременной верификации диагнозов, и, соответственно, эффективной терапии.
ОНКОЛОГИЧЕСКИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ
Согласно данным ВОЗ, онкологические заболевания - причина 20% всех случаев смерти в развитых странах [14], а также значительной утраты трудового и жизненного потенциала общества.
Рак легкого - одно из самых распространенных злокачественных новообразований. У 90% пациентов наблюдается немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ), представленный двумя гистологическими типами: плоскоклеточным раком и аденокарцино-мой. В Беларуси на него приходится свыше 45 случаев на 100 тыс. населения, это лидирующая причина смерти от злокачественных образований у мужчин. В последнее время данный показатель возрастает и среди женщин [15]. Особенности патогенеза этого заболевания зависят от этнических и гендер-ных характеристик популяции [16].
В задании программы «Разработка технологии выявления риска онкологических заболеваний на основе эпигенетических и молекулярно-генети-ческих маркеров» у пациентов с НМРЛ проводится скрининг соматических мутаций и оценка их связи с клинико-морфологическими параметрами опухоли. Для этого был отобран биоматериал 318 пациентов Минского городского клинического онкологического диспансера и 436 человек без онкопатологии. У половины пациентов с НМРЛ был выявлен плоскоклеточный рак, среди них 90% - мужчин, 10% -женщин, у второй половины - аденокарцинома легкого: 50% и 50% соответственно.
У 318 пациентов с НМРЛ и 436 человек без онкопатологии определены молекулярные характеристики основных компонентов ангиогенеза. С использованием технологии N08 проведено секвенирование 113 образцов опухоли пациентов с НМРЛ и впервые в Беларуси проанализированы мутации в 48 генах и получены данные о молекулярных особенностях
НБМ£!01 Ш п.н. | *
Н$М$702 Ш П.Н. *-I
ШЗМЭбОг 170 П.Н. ' •
Р$МАА, щ<мдоо оо •-
Р5МА6. «НМБМОО ►-*-I
К-6, г? 1800791 СС--
П.-6. к] вооти с —*-■
ШАР!/€3,1*3761847 СХт > •
0 12 3 4
Огастижн! тянтсов (ОВД
Рис.3. Выявленные ДНК-маркеры (рисковые аллели и генотипы) ювенильного идиопатического артрита ^<0,05)
опухоли у пациентов с НМРЛ. Составлен перечень генов, в которых с наибольшей частотой регистрируются соматические мутации в опухолевой ткани пациентов с НМРЛ (рис. 4).
Показана существенная разница в молекулярном профиле плоскоклеточного рака легкого и аде-нокарциномы: у пациентов с последней превалируют мутации в генах, кодирующих компоненты МЛРК-киназного сигнального пути, у первых -мутации в генах, кодирующих компоненты РБ3/ ВЬ- и Р13К/ЛКТ/тТОВ-сигнальных путей. Определены варианты генов и клинико-морфологические параметры, влияющие на прогноз течения заболевания и агрессивность опухоли.
Предлагаемый методический подход позволяет разработать панели молекулярно-генетических маркеров прогноза течения конкретных гистологических типов НМРЛ для обеспечения персонализа-ции и повышения эффективности проводимой терапии. При неоперабельной стадии рака такой подход поможет подобрать лекарственное лечение, которое продлит жизнь пациенту и улучшит ее качество.
НЕКОРОНАРОГЕННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ СЕРДЦА
Основная цель задания по изучению генетических причин развития некоронарогенных заболеваний сердца - разработка алгоритма персонализированной стратификации риска внезапной смерти у пациентов с данной патологией.
Внезапная сердечная смерть (ВСС) наступает обычно в течение нескольких секунд/минут -одного часа от момента появления острых симптомов. Именно поэтому 80% случаев ВСС происходят вне медицинских учреждений, события регистрируются
Рис.4. Спектр выявленных вариантов генов в опухоли пациентов с НМРЛ
на улице, при занятиях физкультурой и спортом, во сне. Около трети ВСС ассоциированы с некорона-рогенной патологией сердца: дилатационной кардио-миопатией, аритмогенной дисплазией правого желудочка, гипертрофической кардиомиопатией, изолированной некомпактностью миокарда левого желудочка и ионными каналопатиями. Генетические факторы играют здесь важную роль. Причиной являются мутации в генах сократительных, ядерных и цитоскелет-ных белков, а также ионных каналов, межклеточных контактов и трансмембранных переносчиков [17].
С помощью технологии N08 нами проанализировано более 140 пациентов с некоронарогенными заболеваниями сердца. В 40% установлена их генетическая причина. В большинстве случаев выявлены аутосомно-доминантные мутации в генах саркомер-ных белков АСТС1, МУБРС3, МУИ7, ЫЕХЫ, ТТЫ и др. В 6% заболевание наследовалось Х-сцеплено и было обусловлено мутациями в генах ОЬА, ЬАМР2, ВМВ и ЕМБ. Обнаружены крупные делеции в генах ВМВ и РЯБМ16, повлекшие развитие кардиопатологии, а также мутации, нарушающие сплайсинг [18].
Рис.5. А. Топологическая модель протеина LAMP2 с учетом выявленной мутации. B. Уровень мРНК у пациентов с мутацией и в контрольной группе *Р < 0,05
Впервые в геноме человека идентифицированы и описаны 13 новых патогенных вариантов. Так, новая делеция в гене LAMP2 обнаружена у пациента с семейной историей ВСС и кардиомиопатией в трех поколениях: мутация в этом гене привела к развитию дила-тационной кардиомиопатии у женщин в возрасте 30-34 лет, а у мужчин - к гипертрофической кардиомиопатии в возрасте 7-14 лет. В исследовании показано, что развитие заболевания у женщин связано со снижением экспрессии нормальной копии гена LAMP2 (рис. 5) вследствие инактивации Х-хромосомы [19].
Проводится работа по выявлению бессимптомного носительства мутаций у родственников пациентов на доклинических стадиях развития заболевания. Это позволяет индивидуализировать план их динамического наблюдения и стратегию лечения для снижения риска ВСС.
СОЗДАНИЕ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ НАБОРОВ РЕАГЕНТОВ
В ходе совместной работы Института генетики и цитологии с Институтом биоорганической химии НАН Беларуси на основе полученных геномных данных создаются отечественные наборы реагентов для выявления генетических маркеров риска развития широко распространенных заболеваний. Уже разработаны опытные импортозамещающие наборы реагентов, которые в настоящий момент апробируются в генетических лабораториях.
Реализация программы «ДНК-идентификация» поможет обеспечить прорыв в диагностике и лечении тяжелейших заболеваний. Проводимая в рамках программы разработка ДНК-технологий определе-
ния генетического риска социально значимых заболеваний является необходимым этапом медицины будущего - персонализированной, предсказательной и профилактической. Ожидается, что оценка генетического риска развития патологий при последующих профилактических мероприятиях позволит снизить частоту их появления на 15-20%.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Концепция безопасности Союза Беларуси и России. Утверждена решением Высшего Совета Союза Беларуси и России от 28 апреля 1999 г. // Информационный сборник «Безопасность», 2000, №1-12.
2. Goetz L.H., Schork N.J. Personalized medicine: motivation, challenges, and progress. Fertil Steril. 2018;109(6):952-963. doi:10.1016/j.fertnstert.2018.05.006
3. Country report Belarus / Pavlova O., Patseyev A., Stelmashok V. // The European Association of Preventive Cardiology (EAPC) // https://www.escardio.org/static_ file/Escardio/Subspecialty/EAPC/Country%20of%20the%20month/Documents/ belarus-country-of-the-month-full-report.pdf.
4. Campello E., Spiezia L., Adamo A., Simioni P. Thrombophilia, risk factors and prevention. Expert Rev Hematol. 2019;12(3). Р. 147-158.
5. Данилова Л.И. Сахарный диабет 2-го типа: изменились ли подходы к его лечению? // ARS Medica. 2011. №10. С. 31-43.
6. Kanis J.A., Burlet N., Cooper C., Delmas P.D., Reginster J.Y., Borgstrom F., et al. European guidance for the diagnosis and management of osteoporosis in postmenopausal women. Osteoporos Int 2008; 19:399-428.
7. Corrado A., Cici D., Rotondo C., Maruotti N, Cantatore F.P. Molecular Basis of Bone Aging. Int J Mol Sci. 2020;21(10):3679. Published 2020 May 23. doi:10.3390/ ijms21103679.
8. Marozik P., Alekna V., Rudenko E., Tamulaitiene M., Rudenka A., Mastaviciute A., Samokhovec V., Cernovas A., Kobets K., Mosse I. Bone metabolism genes variation and response to bisphosphonate treatment in women with postmenopausal osteoporosis. PLoS One, 2019. Vol. 14, no. 8, p. e0221511.
Полный список использованных источников http://innosfera.by/2020/10/genomic_technologies
