Геномные изменения эмбриональных стволовых клеток человека при длительном культивировании Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

I I I I I I

[Hein

Новости клеточных технологий

биологического феномена у остальных видов млекопитающих, включая человека.

Очень интересный комментарий к статье можно найти в последнем номере Reproductive Biology and Endocrinology [3]. В нем одна из определяющих ролей в замеченном явлении передается поверхностному эпителию яичников. Автор критикует Johnson за то, что они игнорируют теорию обновления фолликулов у взрослых млекопитающих за счёт поверхностного эпителия, выдвинутую Edgar Allen and Herbert M. Evans более 70-ти лет назад. Кроме того, в комментарии указывается, что клетки, несущие маркёры ГСК могут мигрировать в кост-

ный мозг, а не наоборот. На этот факт указывают опыты по удалению яичников, в которых клетки, экспрессирующие герминативные маркёры, в костном мозге не находили. Также обсуждаются возможные пути использования результатов исследования в медицине, при лечении бесплодия различного генеза [3]. Кроме того, необходимо помнить, что фолликул, помимо овоцита образован клетками фолликулярного эпителия, соединительной тканью, в его состав входят сосуды, поэтому требуются более четкие указания авторов на то, о происхождении каких элементов фолликула идет речь.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Deng W., Lin H. Assymetric germ cell division and oocyte determination during Drozophila oogenesis. Int. Rev. Cytol. 2001; 203: 93-138.

2. Johnson J., Canning J., Kaneko T., et al. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature 2004; 428: 145-50.

3. Bukovsky A. Can ovarian infertility be treated with bone marrow- or ovary-derived germ cells? Reprod. Biol. Endocrinol. 2005; 3: 36.

Подготовила B.C. Мелихова по материалам Cell 2005; 122: 303-15.

Геномные изменения эмбриональных стволовых клеток человека при длительном культивировании

Известно, что при длительном культивировании клетки могут претерпевать значительные фено- и генотипические изменения. Как и все активно делящиеся в культуре клетки, эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСКч) претерпевают 10-9 спонтанных мутаций на нуклеотид. Ограниченные деления таких мутантов и работа репаративных ферментов позволяет поддержать практически неизменные свойства культуры в целом, если только речь не идет о мутациях, способствующих лучшему выживанию и влияющих на клеточное деление. В организме мутантные клетки элиминируются иммунной системой, однако в культуре этого не происходит.

В журнале Nature Genetics опубликованы результаты международного исследования геномных изменений в длительно поддерживаемых в культуре линий ЭСКч из регистра NIH. В предыдущих работах, в которых рассматривался вопрос генетической стабильности этих же линий,использовался кариотипический подход, в некоторых из них приводились данные об уникальной стабильности культивируемых долгое время [2 года) ЭСК [1 -3]. Однако в прошлом году, в Великобритании группой исследователей были установлены некоторые изменения кариотипа в линиях ЭСКч [4].

В данной работе приводится сравнение генотипов линий ЭСКч на ранних и поздних пассажах. Линии, зарегистрированные в NIH и доступные для исследований, были предоставлены компаниями ES Cell International, WiCell Institute, BresaGen, и Cellartis AB. Для анализа клеточного генома было использовано три различных подхода, независимо выявляющих изменения в клеточной ДНК:

- изучение количества копий ядерной ДНК (плоидность);

- изучение митохондриальной ДНК;

- уровень метилирования генных промоторов.

Всего было проанализировано 9 пар различных линий ЭСКч на различных сроках культивирования и одна непарная линия.

Для геномного анализа исследователи применили генные чипы Affymetrix GeneChip компании Affymetrix. Один такой чип позволяет выявлять полиморфизм единичных нуклеотидов 100 000 генов. Для каждого подхода применялся соответствующий чип.

Для выявления изменений в плоидности был использован кит Affymetrix GeneChip Chromosome. Из девяти парных линий четыре [45%) имели явные изменения в количестве копий геномной ДНК на поздних пассажах. Эти изменения были различны - от амплификаций и делеций больших участков [как, например, полная амплификация 17q плеча), до менее заметных - таких, как 2Mb амплификация вблизи myc-онкогена. Данные, полученные при использовании генного чипирования, были подтверждены методикой FISH и количественной ПЦР. Важно отметить, что все эти изменения касались районов, имеющих отношения к различным типам рака.

Скрининг митохондриального генома показал, что в 22% случаев [две из 9 линий) на поздних пассажах присутствуют изменения нуклеотидной последовательности [мутации) митохондриальной ДНК.

Наконец, исследователи показали аберрации в метилировании ряда генов в ЭСКч. Метилирование этих же генов является эпигенетической характеристикой для некоторых видов опухолевых клеток, как показатель естественного клеточного старения. В целом, восемь из 9 линий ЭСК на поздних пассажах [55-59), по сравнению с ранними пассажами имели более высокий уровень метилирования генных промотеров [11-33).

Таким образом, при изучении генома поздних пассажей ЭСКч, 8 из 9 линий несли одно или несколько генетических изменений, некоторые из которых характерны для злокачественных трансформаций человеческих клеток. Так, изменения в плоидности наблюдались в 45% случаев, последовательности митохондриальной ДНК - в 22%, изменения в уровне метилирования генных промоторов -в 90%.

Линии ЭСКч, поддерживаемые in vitro, подвержены генетическим и эпигенетическим изменениям, следовательно, нуждаются в тщательном мониторинге как во время культивирования, так и в детальном анализе при использовании in vivo и в клинических целях.

Приведенный в этой работе анализ является на сегодняшний день самым детальным и имеет более «высокое разрешение», чем все предыдущие методы исследования

Клеточная трансплантология и инженерия № 2, 2005

■■■ lililí

■ I I I

Клеточная биология

генотипа и кариотипа линий ЭСКч [5]. Весь набор методов, применяемых в предшествующих работах, не позволял комплексно и глубоко оценить геномные изменения клеток [1-3]. Поскольку этой международной группой были проанализированы линии из разных источников [из разных стран), исследование можно считать независимым и законченным.

Результаты предполагают применение универсального подхода сканирования клеточных геномов при помощи генных чипов. Основная заслуга в распространении такого подхода, безусловно, принадлежит компании Affymetrix, применение чипов которой становится своеобразным стандартом в клеточной и молекулярной биологии [5].

ЛИТЕРАТУРА:

1. Brimble S.N., Zeng X., Weiler D.A. et al. Karyotypic stability, genotyping, differentiation, feeder-free maintenance, and gene expression sampling in three human embryonic stem cell lines derived prior to August 9, 2001. Stem Cells Dev. 2004; 13: 585-97.

2.Buzzard J.J., Gough N.M., Crook J.M., Colman A. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nat. Biotechnol. 2004; 22: 381 -2.

Таким образом, линии ЭСКч, поддерживаемые in vitro длительное время, подвержены генетическим и эпигенетическим изменениям, а значит, нуждаются в тщательном геномном мониторинге как во время культивирования, так и в детальном анализе при использовании in vivo и тем более в клинических целях. Тем не менее, приведенные данные не дают информации о причинах генных аберраций. Авторы статьи призывают к более внимательному исследованию карио-и генотипа ЭСК на поздних пассажах. Применение линий ЭСК для модельных фармакологических экспериментов, прекли-нических и клинических испытаний в будущем, предполагает использование для этих целей клеток, прошедших минимальное количество пассажей в культуре.

3. Rosler E.S., Fisk G.J., Ares X. et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Dev. Dyn. 2004; 229: 259-74.

4. Draper J.S., Smith K., Gokhale P. et al. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2004; 22: 53-4.

5. Matsuzaki H., Dong S., Loi H. et al. Genotyping over 100,000 SNPs on a pair of oligonucleotide arrays. Nat Methods 2004; 1: 109-11.

Подготовила B.C. Мелихова по материалам Nat. Genet. AOP; 4 September 2005;

doi: 10.1038/ng 1631.

Иммуногенность эмбриональных стволовых клеток -реакция отторжения при аллогенной трансплантации

Степень иммунной реакции реципиента на вводимые эмбриональные стволовые клетки [ЭСК) и их дериваты является одним из ключевых вопросов, ответ на который определит будущие возможности и особенности их применения в медицине. В настоящее время существуют значительные противоречия во взглядах на способность ЭСК индуцировать специфический иммунный ответ. Исследовано наличие ключевых молекул на поверхности ЭСК, ответственных за взаимодействие с клетками иммунной системы. Было показано, что для ЭСК характерна низкая степень экспрессии антигенов MHC-I и отсутствие экспрессии антигенов MHC-II [1, 2]. Таким образом, ЭСК, как и все другие клетки, экспрессирующие MHC-I, должны распознаваться и уничтожаться аллогенными Т-лимфоцитами в реакции отторжения [3]. С другой стороны, показано, что ЭСК не стимулируют аллогенные Т-лимфоциты в кокультуре и, более того, ингибируют их пролиферацию в смешанной реакции лимфоцитов [1]. Ингибирующий эффект пропорционален количеству ЭСК и, в целом, имеет сходные черты с иммуномодулирующими эффектами костномозговых стромаль-ных/мезенхимальных стволовых клеток [4]. Описанный феномен позволил предположить иммунопривилегиро-ванный статус ЭСК, в том числе и при их трансплантации аллогенному реципиенту.

Необходимо отметить, что иммуногенность ЭСК изучалась, главным образом, в опытах in vitro, и представления о характере взаимодействия ЭСК с иммунной системой реципиента до недавнего времени оставались лишь результатом умозаключений. Недавно группа Kofidis Т. исследовала иммунологические аспекты трансплантации ЭСК в опытах in vivo. Авторы не изучали иммуногенность предиф-ференцированных производных ЭСК.

Мышиные ЭСК, меченые маркерным геном GFP, инъецировались интрамиокардиально в зону инфаркта, полученную

в результате предварительной перевязки коронарной артерии. Трансплантация производилась трем группам животных: группа 1 - аллогенные животные, 2 - сингенные мыши [контроль), группа 3 - мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (БСЮ). Оценка иммунного ответа реципиентов производилась в разные сроки посттрансплантаци-онного периода [1-я, 2-я и 4-я недели). Гистологическими и иммуногистохимическими исследованиями окружающих тканей сердца определялись характер экспрессии молекул МНС, степень инфильтрации лейкоцитами и оценка клеточного состава инфильтрата.

Схема этой части эксперимента представлена на рисунке.

Через 2 недели после трансплантации у всех животных сформировались большие инфильтраты в области введения клеточных трансплантатов, размер которых несколько уменьшался к 4-й неделе. На 4-й неделе посттранспланта-ционного периода имели место выраженная клеточная дисплазия и ядерный полиморфизм, тем не менее, классической тератомы на данном сроке не наблюдалось. Иммуногис-тохимическое исследование показало наличие множества Т-лимфоцитов и дендритных клеток (ДК) вокруг и внутри инфильтрата у мышей другой линии [аллогенная трансплантация), их незначительное количество имелось у сингенных мышей и полное отсутствие наблюдалось у БСЮ-мышей. Т-лимфоциты концентрировались вокруг трансплантата, тогда как ДК располагались, главным образом, внутри него. Часть ДК алллогенной группы животных имела донорское происхождение. Количество клеток исследуемых популяций у ал-логенных мышей прогрессивно возрастало от 1-й к 4-й неделям. Экспрессия молекул МНС I класса клетками донора наблюдалась у всех групп животных. При аллогенной трансплантации она была максимально высока на 1-й неделе, значительно возрастала ко 2-й и затем снижалась к 4-й неделе посттрансплантационного периода. Экспрессия

Клеточная трансплантология и инженерия № 2, 2005