CC BY
195
УДК б15.35б : 547/577.125 : 577.2 : б1б-00б
В.В. Ляхович, В.А. Вавилин, А.Ю. Гришанова, Л.Ф. Гуляева, С.П. Коваленко
ГЕНОМНАЯ МЕДИЦИНА И НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ ОНКОЗАБОЛЕВАНИЙ*
ГУ НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, Новосибирск
Авторы рассматривают современные направления геномных исследований в онкологии с привлечением собственных результатов. Представлены результаты исследований связи полиморфизма генов метаболизма ксенобиотиков (СУР1Л1, ОЗТМ1, 08ТТ1, МЛТ2) с предрасположенностью к раку легкого, изучения экспрессии генов апоптоза и ангиогенеза (!Ь-8, Вс1-2, УЕОР) при раке матки, шейки матки и щитовидной железы, а также связи полиморфизма генов множественной лекарственной резистентности (МОЯ1, 08ТР1) и активности Р-гликопротеина с эффективностью химиотерапии у больных с хроническими лимфопролиферативными заболеваниями. Публикуется способ оценки дозы гена НЕК2 для прогнозирования эффективности применения герцептина у больных раком молочной железы.
Ключевые слова: онкопатология, генетический полиморфизм, экспрессия генов, молекулярные маркеры предрасположенности, трансформации, лекарственной резистентности
Геномная медицина - новое направление науки на стыке молекулярной генетики, клеточной биологии и современной медицины. Геномная медицина увязывает патологические процессы человека с процессами реализации генетической информации и с индивидуальными, генетически обусловленными особенностями пациента. На сегодняшний день можно выделить несколько направлений исследований в геномной медицине:
1. Генетический полиморфизм и наследственно обусловленные индивидуальные различия в предрасположенности к различным заболеваниям; особенности ответа на воздействие лекарственных препаратов (фармакогенетика).
2. Изменения экспрессии специфических генов при различных патологиях, которая может быть как маркером заболевания, так и причиной этого заболевания.
3. Изменения экспрессии генов в результате генетической реорганизации в клетках патологических тканей (прежде всего в тканях различных опухолей); формирование прогноза развития патологий и обоснованных рекомендаций по лечению.
Онкологические заболевания являются центральной темой многих исследований в русле геномной медицины. Это вполне объяснимо, ведь первопричиной злокачественного роста являются именно генетические аномалии, приводящие к нарушению управления процессом деления клеток. Как и всякая медицинская дисциплина, онкология решает задачи профилактики, диагностики и лечения. Применительно к ним и с ориентацией на индивидуума геномная медицина изучает генетические факторы предрасположенности к онкозаболеваниям, ранние молекулярные признаки злокачественной трансформации и основные компоненты диспозиции противоопухолевых препаратов. Ниже в этой логической последовательности будут рассмотрены некоторые возможности геномных технологий в онкологии.
Ассоциация полиморфизмов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с предрасположенностью к онкозаболеваниям
Важным результатом онкологических исследований является формирование представлений о многостадий-ности развития опухоли [6]. Первыми в ряду событий являются процессы инициации, и в силу этого с ними в значительной мере связаны само возникновение онкозаболеваний, их риск и возможности профилактики.
По оценкам Международного агентства по изучению рака, 80-90% всех случаев рака связаны с воздействием химических факторов [18]. Канцерогенность многих соединений связана с их генотоксичностью, причем более 75% известных канцерогенов приобретают её в результате ферментативной активации. Это объективно делает важной в инициации канцерогенеза роль ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК). Гены ФБК высокополиморфны; многие полиморфизмы имеют выраженные функцио- нальные проявления, частоты некоторых достигают в популяциях европеоидов 50%, поэтому потенциально могут иметь большое эпидемиологическое значение.
В качестве факторов генетической предрасположенности к онкозаболеваниям интенсивно исследуется полиморфизм практически всех генов тех семейств, которые в суперсемействе цитохрома Р450 (CYP) ответственны за метаболизм ксенобиотиков - CYP1, CYP2, CYP3, а из ферментов конъюгации более других - глута-тион- и N-ацетилтрансферазы (GST и NAT). Большое число работ посвящено полиморфизму 7 экзона гена CYP1A1 (замена 2455A>G, в результате которой происходит замена Ile462Val в гем-связывающей области фермента и увеличение активности фермента) [19].
Ряд публикаций показывают увеличение частоты аллеля CYP1A1Val у больных раком легкого по сравнению с группой здоровых людей [1,4, 12, 20]. Есть такие наблюдения и для гомозиготных делеций GSTM1 и GSTT1, встречающихся у европеоидов с частотой 40-60% и 20% соответственно [1, 25, 28]. В последовательности гена N-ацетилтрансферазы 2 (NAT2), согласно действующей номенклатуре, выявлено 13 точковых мутаций [13]. Часть из них проявляется в человеческой популяции фенотипом медленного ацетилирования, частота которого
- часть работы поддержана грантом РФФИ № 02-04-48328.
*
в популяциях европеоидов составляет около 50%. Увеличение частоты медленных ацетиляторов наблюдается среди больных раком мочевого пузыря [3, 22], а быстрых ацетиляторов - среди больных колоректальным раком [9, 14].
Более чем десятилетний период исследований ассоциаций полиморфизма генов ФБК с различными онкозаболеваниями позволил [8] сделать выводы о том, что гены этой системы имеют безусловное значение, но сила связанного с ними риска значительно варьирует в подгруппах, на которые распадается популяция с учетом таких факторов, как профессия, вредные привычки, качество питания, пол, возраст и др.
В нашей работе мы исследовали ассоциацию полиморфизмов СУР1Л1, 05ТМ1, ОБТТ1 и ИЛТ2 с раком легкого в Новосибирске. Частоты встречаемости исследованных аллелей и генотипов в контрольной группе совпадали с данными литературы по европеоидным популяциям [1, 4]. В группе больных наблюдались отклонения их частот от контрольных величин. Данные стратификационного анализа их ассоциации с подверженностью раку легкого с учетом пола, возраста и отношения к курению представлены в табл. 1. Можно видеть, что отношение шансов для Уа1-аллеля во всей группе равно 2,94 и его величина зависит от возраста и фактора курения. Средний возраст пациентов, имеющих аллель СУР1Л1Уа1 (45,9 лет), почти на 12 лет ниже, чем у пациентов, гомозиготных по 11е-аллелю (57,7 лет). Высокая частота Уа1-аллеля (0,117) наблюдалась также в группе некурящих больных (ОЯ=4,85). Таким образом, полученные данные позволяют считать аллель
СУР1Л1Уа1 фактором предрасположенности к раку легкого.
Наблюдаемые частоты генотипов ОБТМГ’-” и ОБТТГ’-“ в группе пациентов с диагнозом - рак легкого (57,4% и 25,7%) были выше, чем в контрольной группе (48,5% и 19,4%), однако для индивидуальных генотипов статистическая достоверность отношения шансов не достигается. Оценка относительного риска рака легкого для различных комбинаций генотипов ОБТМ1 и ОБТТ1 показала статистически достоверную связь для комбинации С5ТМ1”-”/С5ТТ1”-” в группе женщин и устойчивость к развитию заболевания для комбинации С5ТМ1”+”/С5ТТ1”-” - в группе курящих. Близок к статистической достоверности и защитный эффект комбинации двух плюс-генотипов в группе некурящих (р<0,1).
Нами исследована также связь с раком легкого двух точковых мутаций гена ЫЛТ2, по-разному проявляющихся в фенотипе ацетилирования: замены в590Л, влекущей значительное снижение скорости реакции ацетилирования, и Л803в, незначительно влияющей на ее скорость [7]. Можно видеть, что последний признак ведет себя как фактор устойчивости при воздействии фактора курения. Это согласуется с данными о том, что именно медленные ацетиляторы, подвергающиеся воздействию ариламинов, имеют повышенный риск рака мочевого пузыря, что обусловлено накоплением в моче токсичных неконъюгированных К-гидроксиметаболи-тов, образующихся с участием цитохрома Р450. У быстрых ацетиляторов происходит их инактивация и выведение из организма. Защитные эффекты быстрого фенотипа ацетилирования при воздействии табачного дыма
Таблица 1
Ассоциация валинового аллеля СУР1Л1, нуль-генотипов ОБТМ1, ОБТТ1
и их комбинаций и мутаций МЛТ2 с раком легкого с учетом возраста и отношения к курению
Генотипы, аллели Отношение шансов (95% - доверительный интервал) в подгруппах
все <50 лет >50 лет курящие некурящие
СУР1Л1-¥а! 2,94 (0,75-14,4) 5,78* (1,2-36,7) 1,93 (0,4-10,7) 1,49 (0,22-10) 4,85* (1,04-23,4)
в$ТМ1*0/0 1,43 (0,79-2,6) 1,57 (0,58-4,29) 1,19 (0,48-2,95) 1,05 (0,41-2,7) 1,81 (0,8-4,05)
в$ТТ1*0/0 1,44 (0,71-2,9) 1,34 (0,39-4,48) 1,82 (0,7-4,82) 1,14 (0,35-3,7) 1,96 (0,77-5,1)
М1*0/0/Т1*0/0 1,43 (0,79-0,58) 1,57 (0,58-4,29) 1,19 (0,48-2,95) 1,05 (0,41-2,65) 1,81 (0,81-4,05)
М1*0/0/Т1+ 0,89 (0,49-1,6) 1,02 (0,37-2,82) 1,25 (0,25-2,8) 0,86 (0,33-2,21) 1,19 (0,53-2,65)
М1+/Т1*0/0 0,82 (0,29-2,25) 0,37 (0,01-3,12) 0,84 (0,2-4,11) 0,17* (0,02-1,17) 1,21 (0,32-4,68)
М1+/Т1+ 0,74 (0,4-1,36) 0,72 (0,26-1,97) 0,9 (0,34-2,36) 1,26 (0,49-3,2) 0,47* (0,2-1,11)
ЫЛТ2-590Л 1,16 (0,75-1,8) 1,66 (0,8-3,43) 1,04 (0,65-1,68) 1,17 (0,63-1,93) 1,15 (0,71-2,06)
ЫЛТ2-8030 0,76 (0,5-1,15) 0,78 (0,37-1,61) 0,75 (0,48-1,18) 0,53* (0,3-0,93) 1,04 (0,63-1,7)
Примечание. * контроле.
р<0,05; р - уровень значимости различий по критерию у} в сравнении с аналогичными группами в
связывают также с инактивацией аминобифенилов [14, 22].
Баланс активации/инактивации канцерогенов складывается из соотношения активностей реакций I и II фаз биотрансформации. Поэтому мы проверили эффекты взаимодействия генотипов СУР1Л1 и ОБТМ1 и Т1 на степень риска. Поскольку в нашем исследовании отчетливо наблюдался эффект возраста, данный анализ мы провели с учетом этого фактора. Анализ выявил возрастание риска заболевания для комбинации СУР1Л1Пе/Уа1/О8ТМ1”-“ в сравнении с индивидуальными генотипами (ОЯ= 3,01; 95%С1: 0,63 - 19,1; р = 0,18 во всей группе и ОЯ= 6,89*; 95%С1: 0,79 - 83,38; р =
0,045 у лиц не старше 50 лет). Максимальный риск наблюдался для комбинации
СУР1Л111е/Уа1/О8ТМ1”-“/Т1”+” у лиц не старше 50 лет (ОЯ = 10,0; 95% С1: 0,2 - 704,49).
В целом, полученные результаты свидетельствуют в пользу связи полиморфизма генов ФБК с раком легкого в условиях Западно-Сибирского региона. Изученные полиморфизмы взаимодействуют между собой в детерминации риска заболевания. Сила связанного с ними риска зависит также от пола, возраста и курения.
Молекулярно-генетические маркеры опухолевой трансформации тканей
Согласно существующим представлениям, в механизмы канцерогенеза вовлечены гены регуляции клеточного роста и апоптоза - онкогены и раковые супрессорные гены [6]. Рост опухоли может быть обусловлен нарушением баланса между пролиферацией клеток и их программированной гибелью, и эти молекулярные события предшествуют морфологическим изменениям и, тем более, клиническим проявлениям [5, 27]. Поэтому поиск новых молекулярных маркеров опухоли является актуальным направлением, которое определяет, в частности, возможности ранней диагностики. Одним из важных свойств злокачественной опухоли является способность ее клеток к метастазированию. Метастатический потенциал связывают со способностью стимулировать ангиогенез [5]. Известно множество молекулярных маркеров ангиогенеза, но наиболее важными из них являются цитокины - факторы роста эндотелиоцитов, в первую очередь интерлейкин 8 (1Ь-8) [10]. Одним из перспективных направлений изучения механизмов трансформации и поиска ее молекулярных маркеров является исследование экспрессии генов сигнальных молекул, ответственных за пролиферацию, апоптоз и ангиогенез.
Нами была проведена оценка экспрессии основных генов апоптоза и ангиогенеза (Вс1-2,1Ь-8 и УБОЕ) в нормальных и опухолевых тканях матки и щитовидной железы человека.
Среди злокачественных заболеваний женских половых органов рак матки занимает второе место после рака молочной железы. Метастазы при раке матки возникают рано и распространяются, прежде всего, лимфатическим путем; позднее наблюдаются и гематогенные метастазы. На рис. 1 представлены результаты исследования экспрессии гена ингибитора апоптоза Вс1-2 гена 1Ь-8 в нормальных и опухолевых тканях тела матки, опухоли шейки матки и культурах фибробластов человека. Уровни экспрессии исследуемых генов нормировали относительно уровня экспрессии гена “домашнего хозяйства” циклофиллина. Исследование экспрессии гена Вс1-2 и
фактора роста 1Б-8 в операционном материале больных раком матки показало, что во всех образцах в опухолевой ткани регистрируется повышенная в сравнении с нормальной тканью экспрессия гена Вс1-2 (рис. 1А), а экспрессия гена 1Ь-8 регистрируется в опухолевых тканях матки (рис. 1Б, дорожки 1, 2, 3, 7, 9), в отличие от нормальной ткани (дорожки 4-6) и культур фибробла-стов (дорожки 10-12).
Отмечающийся за последние годы рост частоты опухолей щитовидной железы и трудность их распознавания на ранних стадиях заставляют ориентировать молекулярные исследования на опухоли этого органа. В структуре заболеваемости рак щитовидной железы входит в десятку самых распространенных форм злокачественных опухолей в Новосибирской области. Заболеваемость раком щитовидной железы в Новосибирске за 1998 г. составила4,6 на 100 тыс. населения, аза 2002 г. -уже 7,1.
Мы исследовали экспрессию генов Вс1-2 и УБОЕ (васкулярный эндоделиальный фактор роста) в нормальных и опухолевых тканях щитовидной железы в операционном материале больных с опухолями щитовидной железы. Уровни экспрессии выбранных генов также оценивали относительно экспрессии гена Р-актина. Уровень экспрессии гена Вс1-2 представлен на рис. 2А. В тканях папиллярного рака щитовидной железы наблюдается более выраженная экспрессия гена Вс1-2 (больные № 2, 3), чем в нормальных тканях от тех же пациентов, а для фолликулярного рака отмечается противоположный эффект (больной № 1). Возможно, эти различия связаны с разными механизмами трансформации для этих типов опухолей. Для доброкачественных опухолей щитовидной железы (больные № 4-7) какой-либо закономерности в экспрессии генов Вс1-2 по сравнению с нормальной тканью не выявлено. Скорее всего, белок Вс1-2 не влияет на формирование доброкачественной опухоли щитовидной железы. Этот факт также может косвенно свидетельствовать о различных механизмах формирования исследуемых патологий.
Исследование гена УБОБ показало, что его экспрессия наблюдается у больного фолликулярным раком (рис. 2Б). В остальных случаях экспрессия гена УБОБ наблюдается только в нормальных тканях (рис. 2Б, больные № 3-7). Этот факт оказался неожиданным, поскольку, как правило, опухоли хорошо васкуляризированы. Вероятно, отсутствие экспрессии гена УБОБ в исследованных опухолях может свидетельствовать о включении альтернативных путей ангиогенеза, характерных для метастазирования, которые не оценивались нами. Результаты проведенных оценок показывают, что экспрессия исследованных генов Вс1-2 и УБОБ по-разному меняется при разных формах рака щитовидной железы.
Таким образом, предварительные ре- зультаты свидетельствуют, что гены Вс1-2, 1Ь-8 и УБОБ можно рассматривать как перспективные кандидаты в молекулярные маркеры для диагностики злокачественных опухолей матки и щитовидной железы.
Фармакогенетика онкозаболеваний
Изучение биохимической основы различий в терапевтических эффектах лекарств, проводившееся до начала 90-х годов XX века с применением, главным образом, либо оценок активности ферментов, участвующих
Рис. 1. Оценка экспрессии генов (А) - Всї-2 и (Б) - ЇЬ-8.
Дорожки 1-4 - опухоль тела матки; 5-7 - нормальная ткань тела матки; 8 - молекулярный маркер pBluescript II БК (+) / МзрІ; 9-опухоль шейки матки; 10-12-культуры клетокфибробластов человека ФЭЧ 16-1, ФЭЧ 16-2 и ФЭЧ Л68 соответственно
в их метаболизме ex vivo, либо по фармакокинетике лекарств в условиях in vivo, обосновало важную роль этапа биотрансформации лекарств и выявило многочисленные примеры генетического полиморфизма ферментов метаболизма лекарств, драматически сказывающихся на лекарственном ответе. Вторая половина 90-х годов характеризуется возрастающими объемами исследований ферментов транспорта и молекулярных мишеней лекарств.
В числе первых большой интерес у исследователей вызывают гены, связанные с “множественной лекарственной устойчивостью”, - феноменом, актуальным в терапии злокачественных опухолей.
Одним из этих генов, обусловливающих формирование множественной лекарственной устойчивости, является ген MDR1, кодирующий белок транспорта лекарств Р-гликопротеин. Ген MDR1 полиморфен и имеет 28 однонуклеотидных замен. Показано, что синонимичная однонуклеотидная замена в 26-м экзоне (3435 С^Т) гена MDR1 связана со снижением экспрессии P-гликопротеина в клетках слизистой двенадцатиперстной кишки у пациентов с Т/Т3435 генотипом [16]. Этот же полиморфизм сопровождается увеличением активности P-гликопротеина в клетках NK-киллеров человека (CD56). Обнаружена более высокая биодоступность дигоксина (субстрат P-гликопротеина) у субъектов с Т/Т3435 генотипом.
Проведенный нами анализ ассоциаций между генетическими вариантами в экзонах 21 и 26 гена MDR1 и эффектом от химиотерапии больных с лимфопролиферативными заболеваниями (табл. 2) показал, что для больных с генотипом T/T 2677 вероятность быть устойчивыми к химиотерапии в
Рис. 2. Уровень экспрессии генов (А) - Вс1-2 и (Б) - УЕОГ в опухолевых и нормальных тканях щитовидной железы.
А - № 1 - фолликулярный рак; № 2, 3 - папиллярный рак; № 4-7 - нормальная ткань щитовидной железы. Б - № 1 - фолликулярный рак; № 2 - папиллярный рак; № 3-7 - нормальная ткань щитовидной железы
2З
4,5 раза выше по сравнению с индивидуумами c G/G2677 генотипом и в 6,8 раза выше в сравнении с больными, имеющими один или оба G2677-аллеля. Аналогичная связь прослеживается для больных с генотипом T/T3435: вероятность устойчивости к химиотерапии у них в 6,3 раза выше, чем у больных с генотипом C/C3435, и еще более выше по сравнению с больными, имеющими один или оба С-аллеля в генотипе. Кроме того, если больной имеет гаплотип T/T2677 T/T3435, то риск быть устойчивым к химиотерапии у него в 10 раз выше, чем у больного с гаплотипом G/G2677 C/C3435, а по отношению к больным с другими гаплотипами - в 17 раз.
Таким образом, сопоставление генетического полиморфизма MDR1 с лекарственной устойчивостью новообразований лимфоидного происхождения показало, что G2677T и C3435T полиморфизмы гена MDR1 влияют на результат терапии у пациентов с хроническими лимфопролиферативными заболеваниями. Поэтому знание генотипа MDR1 таких больных важно для прогноза и выбора терапии.
Ген фермента II фазы биотрансформации лекарств GSTtc входит в число генов, с которыми также связывают формирование фенотипа множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток [26]. Ген GSTP1 имеет мутации в экзонах 5 и 6, которые приводят к замене в кодоне 105 аминокислоты Ile на Val, и в кодоне 114 Ala на Val соответственно.
Исследование роли полиморфных вариантов гена GSTP1 в формировании лекарственной устойчивости больных с лимфопролиферативными заболеваниями выявило риск устойчивости к химиотерапии у носителей мутантного аллеля в 5-м экзоне гена GSTP1, который был в 2,79 раза выше по сравнению с индивидуумами, являющимися гомозиготами “дикого” генотипа (табл. 3).
Тот факт, что среди обследованных нами больных лимфопролиферативными заболеваниями, устойчивых к химиотерапии, преобладают носители мутантных аллелей генов MDR1 и GSTP1, дает основание предположить, что мутантные аллели генов кодируют белки с более высокой активностью по отношению к противоопухолевым препаратам. Функциональное значение мутаций в генах, определяющих фенотип множественной лекарственной устойчивости, мало изучено. Есть данные о повышенной активности GSTP1 в отношении эпоксидов полиароматических соединений при наличии аллеля Val105 [17]. В работе [15] исследовалась функциональная активность Р-гликопротеина в лимфоцитах у пациентов с учетом полиморфизма MDR1 в 26-м экзоне. Она оказалась
выше в случае мутантного генотипа Т/Т3435 по сравнению с “диким” С/С3435, а уровень мРНК, наоборот, быт ниже в лимфоцитах пациентов с Т/Т3435 генотипом по сравнению с С/С3435 генотипом.
Мы проанализировали, как уровень экспрессии генов МБЯ1 и ОБТР1 и активность Р-гликопротеина влияют на фенотип множественной лекарственной устойчивости у больных лимфопролиферативными заболеваниями. При анализе уровней экспрессии мРНК МБЯ1 и ОБТР1 в костном мозге больных лимфопролиферативными заболеваниями не выгавлено достоверных различий в экспрессии мРНК МБЯ1 и ОБТР1 между чувствительными и устойчивыми к химиотерапии больными (табл. 4). В то же время функциональная активность Р-гликопротеина была повышенной в лимфоцитах устойчивых к химиотерапии больных, в сравнении с лимфоцитами тех, кто имел хороший ответ на лечение химиопрепаратами (табл. 4).
Таким образом, для прогноза эффективности терапии онкогематологических больных важно знание их генотипов МБЯ1 и ОБТР1.
Представленный выше материал иллюстрирует основополагающее положение фармакогенетики о влиянии генетических факторов на лекарственный ответ. Классическая фармакогенетика рассматривает генотип пациента как существенный элемент в корректном выборе вариантов медикаментозного лечения. В то же время в клетках опухоли, как правило, происходят значительные реорганизации генома, поэтому и ответ клеток опухоли на медикаментозное лечение определяется не только генотипом пациента, но и генотипом опухолевых клеток.
Наиболее ясные результаты по связи генотипа опухоли с оптимальным вариантом терапии получены в последнее время в исследованиях, связанных с анализом дозы гена ИЕЯ2/пви [2, 23]. Клетки многих злокачест-
Таблица 2
Ассоциация генотипов гена МОЯ1 с устойчивостью к химиотерапии больных лимфопролиферативными заболеваниями (п=53)
Генотип Комбинации генотипов, относительно которых считалось ОШ Отношение шансов Уровень значимости различий
T/T2677 G/G2677 4,5 p<0,05
G/G2677+G/T2677 6,8 p<0,0084
T/T3435 C/C3435 6,3 p<0,023
C/C3435+C/T3435 10,08 p<0,024
T/T2677+T/T3435 G/G2677 + C/C3435 10,50 p<0,007
Все, кроме T/T2677 + T/T3435 17,73 p<0,00045
Таблица 3
Ассоциация генотипов гена 08ТР1 с устойчивостью к химиотерапии больных лимфопролиферативными заболеваниями
Экзоны гена GSTP1 Генотипы GSTP1 N Генотипы, относительно которых считалось ОШ Отношение шансов Уровень значимости различий
5 Val105Val + Ile105Val 76 Ile105Ile 2,79 р<0,1
6 Val114Val + Ala114Val 38 Ala114Ala 1,6 р<0,47
венных опухолей (прежде всего при раке молочной железы) содержат на поверхности увеличенное количество рецепторов HER2. Причиной такой гиперэкспрессии является, как правило, увеличенная доза гена HER2. Гиперэкспрессия рецептора HER2 характеризует опухоль как агрессивную, но в то же время эффективно отвечающую на лечение антителами к рецептору HER2. Генно-инженерно-модифицированные (“гуманизированные”) моноклональные антитела к рецепторам HER2 лежат в основе эффективного препарата нового поколения
- Герцептин [11]. Использование Герцептина обосновано только в случаях опухолей с гиперэкспрессией рецепторов на поверхности опухолевых клеток.
Проанализировать количество рецепторов можно с помощью иммуноферментных методов, однако часто результаты, полученные с помощью таких методов, неточны из-за наличия на поверхности клеток опухоли близких по структуре рецепторов. Поскольку в основе гиперэкспрессии рецептора HER2 лежит увеличение дозы гена, кодирующего рецептор, альтернативой иммунноферментным методам стал метод FISH (Fluorescent In Situ Hybridization). Однако FISH требует достаточно специализированных исследований и всегда остаётся качественным, а не количественным [21, 24].
Нами предложено определять дозу гена HER2 с помощью конкурентной ПЦР, при которой одновременно амплифицируется фрагмент гена HER2 с использованием ДНК-матрицы из клеток опухоли и генно-инженер-но-конструированый фрагмент ДНК (референс-ДНК), позволяющий оценивать количество исследуемой геномной ДНК, а стало быть, и дозу гена. На рис. 3 показано, как этим способом возможно выявление пациентов, у которых клетки опухоли гиперэкспрессируют рецепторы HER2, лечение которых Герцептином может быть очень эффективно. Референс-ДНК сконструирована таким образом, что амплификация происходит с тех же праймеров, что и для фрагмента гена HER2, однако размер ампликона, полученного с референс-ДНК, отличается от амплифицируемого фрагмента гена HER2. Амплификация известного количества референс-ДНК (фрагмента гена HER2 с инсерцией) совместно с геномной ДНК позволяет отслеживать копийность гена HER2 в исследуемых образцах.
Экспрессия мРНК МВЯ1 и С8ТР1 в костном мозге и функциональная активность Р-гликопротеина в лимфоцитах крови (М±ш) у больных лимфопролиферативными заболеваниями, чувствительных и устойчивых к химиотерапии
Таким образом, накопленные современные знания о механизмах канцерогенеза свидетельствуют о чрезвычайной сложности этого процесса. Полная картина станет результатом обширных будущих исследований. В то же время современные представления о стадийности канцерогенеза позволяют рационально, с точки зрения таких задач медицины, как профилактика, диагностика и лечение онкологических заболеваний, направлять наши усилия на поиск информативных маркеров всех основных его стадий. Именно к этому мы стремились в наших исследованиях.
GENOME MEDICINE AND NEW APPROACHES TO ONCOLOGICAL DISEASES DIAGNOSTICS AND TREATMENT
V.V. Lyakhovich, V.A. Vavilin, A.Yu. Grishanova,
L.F. Gulyaeva, S.P. Kovalenko
The current trends of genomic research in oncology are reviewed. Original results on the lung cancer predisposition of xe-nobiotic metabolism genes polymorphisms (CYP1A1, GSTM1, GSTT1 andNAT2) are presented. Expressions of apoptosis-rela-ted and angiogenesis-related genes (IL-8, Bcl-2, VEGF) in endometrial, cervical and thyroid cancers are investigated. Multidrug resistance gene polymorphisms (MDR1 and GSTP1) and P-glycoprotein activity are estimated in connection with the effectiveness of anticancer drugs treatment in patients with lymp-hoproliferative diseases. PCR- approach to the her2 gene dosage estimation is described. The dosage of HER2 gene is a valuable indicator of the cytostatic drug choice for breast tumor treatment.
ЛИТЕРАТУРА
1. AlexandrieA.-K., Ingelman SundbergM., Seidegard J. et al. // Carcinogenesis. 1994. № 9. P. 1785-1790.
2. Arteaga C.L. // The Oncologist. 2002. Vol. 7. Suppl. 4. P. 31-39.
3. Brockmoller J., Cascorbi I., Kerb R. and Roots I. // Cancer Res. 1996. Vol. 56. P. 3915-3925.
4. Drakoulis N., Cascorbi I., Brockmoller J. et al. // Clin. In-vestig. 1994. Vol. 72. P. 240-248.
5. FolkmanJ. //Curr. Mol. Med. 2003. Vol. 3. P. 643-651.
6. Franks L.M., Teich N.M. // Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer. New-York. 1999. 485 p.
7.
Таблица4 Fretland A.J., Leff M.A., Doll M.A., Hein D.W. // Pharmacogenetics. 2001. Vol. 11. №
3.P. 207-215.
Показатели Уровень экспрессии генов МЛУ (мРНК гена МЛУ/мРНК гена р-акти^) 9
Чувствительные к химиотерапии больные Устойчивые к химиотерапии больные
мРНК MDR1 0,19± 0,06 0,27± 0,06 1
(n=7) (n= 18)
мРНК GSTP1 0,77± 0,10 0,76± 0,09 1
(n=7) (n= 18)
Функциональная активность по выбросу Rh 123 (относит. ед)
Р-гликопротеин 1,57±0,22 2,44±0,5* 1
(n=7) (n=4)
Garte S. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2001. Vol. 10. № 12. P. 1233-1237.
Gil J.P., Lechner M.C. // Carcinogenesis. 1998. Vol. 19. №1. P. 37-41.
GlenjenN., Hovland R., Wergeland L. etal. // Eur. J. Haematol. 2003. Vol. 71. P. 163-173.
Harries M., Smith I. // Endocr. Relat. Cancer. 2002. Vol. 9. № 2. P. 75-85.
Hayashi S., Watanabe J., Kawajiri K. // Jpn. J. Cancer Res. 1992. Vol. 83. P. 866-870.
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, № 2 (ll2), 2004 г. 12 3 4
Рис. 3. Оценка количества копий гена her-2 с помощью совместной амплификации исследуемого образца и рефе-ренс-ДНК.
Дорожка 1 - маркер молекулярного веса ДНК pBluescript II SK (+)/Mspl; дорожки 2, 3,4 - амплификация различных количеств геномной ДНК (10 нг, 5 нг и 3 нг) совместно с референс-ДНК (0,001 пкг)
13. Hein D.W., Grant D.M., Sim E. // Pharmacogenetics. 2000. Vol. 10. М 4. P. 291-292.
14. Hein D.W. // Mutat Res. 2002. Vol. 506-507. P. 65-77.
15. HitzlM., DrescherS., van derKuipH. etal. //Pharmacogenetics. 2001. Vol. 11. № 4. P. 293-298.
16. Hoffmeyer S., Burk O., von Richter O. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. № 7. P. 3473-3478.
17. Hu X., Xia H, Srivastava S.K. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. Vol. 238. P. 397-402.
18. IARC. Cancer: causes, occurrence and control. Ed.: Tomatis L. IARC Sci. Publ. № 100. Lyon, 1990. 383 p.
19. Kawajiri K., Nakachi K., Imai K. et al. // Crit. Rev. Oncol. Hematol. 1993a. Vol. 14. P. 77-87.
20. Kawajiri K., Nakachi K., Imai K. et al. // Carcinogenesis. 1993b. Vol. 14. P. 1085-1089.
21. Larsimont D., Di Leo A., Rouas G. et al. // Anticancer Res. 2002. Vol. 22. № 4. P. 2485-2490.
22. Marcus P.M., Hayes R.B., VineisP. etal. // Cancer Epidemi-
ol. Biomarkers & Prevent. 2000. Vol. 9. № 5. P. 461-467.
23. Masood S., Bui M.M. // Microsc. Res. Tech. 2002. Vol. 59. №2. P. 102-108.
24. Mueller R.E., O’Malley F.P. // Methods Mol Biol. 2002. Vol. 204. P. 353-367.
25. PembleS., Schroeder K.R., Spencer S.R. et al. //Biochem. J. 1994. Vol. 300. Pt. 1. P. 271-276.
26. Ribrag V., Massade L., Faussat A.M. // Leukemia. 1996. Vol. 10. № 12. P. 1944-1949.
27. Soares P., Fonseca E. et al. // Eur. J. Cancer. 1997. Vol. 32. P.293-296.
28. Zhong S., Wyllie A.H., Barnes D., Wolf C.R., Spurr N.K. // Carcinogenesis. 1993. Vol. 14. P. 1821-1824.
