CC BY
815. Fokin A.S. Neurogenic hypercholesterolemia and atherosclerosis. St. Petersburg: ELBI; 2001: 192 p. (in Russian)
16. Khnychenko L.K., Sapronov N.S. // Obzory po klinicheskoy farmakologii I lekarstvennoi terapii. 2003; Vol. 2; 3: 2—15 (in Russian)
17. Accetoi M., Arruda LA, Vanderlei M.J. et al. // Rev. cienc. farm. — 1985. — Vol.7.— P. 119-126.
18. Boggild H., Knutsson A. // Scand. J. Work Env. Health. — 1999. — № 25.— P. 85-99.
19. Bryant R., Harvey A. // J. Trauma Stress. — 1996.— № 9.— P. 51-52.
20. Mutter J., Naumann J., Sadaghiani C. et al. // Met. Ions Life Sci. — 2011. — №8.— P. 247-262
21. Titov V.N., Lisitsyn D.M. // Bul. of Exp. Biol. and
Medicine. — 2006.— Vol.142,— № 5.— P. 577-580.
Поступила 28.02.2014 СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Кудаева Ирина Валерьевна,
зав. КДЛ, руководитель лаб. биохимии, ФГБУ «ВСНЦ ЭЧ» СО РАМН, д-р мед. наук, доцент. Е-mail: kudaeva_ irina @mail .ru.
Рукавишников Виктор Степанович,
директор ФГБУ «ВСНЦ ЭЧ» СО РАМН, д-р мед. наук, проф., член-корр. РАМН. E-mail: rvs_2010@mail.ru.
УДК 615.9: 546.49: 577.1+575.17
О.В. Попкова, И.В. Кудаева, Л.Б. Маснавиева, В.П. Белик
ГЕНО-ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БИОХИМИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДИСФУНКЦИИ ЭНДОТЕЛИЯ У ЛИЦ С ХРОНИЧЕСКОЙ РТУТНОЙ
ИНТОКСИКАЦИЕЙ
ФГБУ «Восточно-Сибирский научный центр экологии человека» СО РАМН, Ангарск
В статье представлены данные о полиморфизме генов-кандидатов, участвующих в формировании дисфункции эндотелия — эндотелина-1 (EDN1 Lys198Asn) и эндотелиальной син-тазы оксида азота (N083 Т786С) в совокупности с концентрациями их активных продуктов (оксида азота, эндотелина-1) у лиц с хронической ртутной интоксикацией.
Установлено изменение концентрации метаболитов оксида азота и эндотелина-1, что указывает на наличие эндотелиальной дисфункции у обследованных лиц. Выявлено, что изучаемые полиморфизмы играют второстепенную роль в патогенезе эндотелиальной дисфункции при хронической интоксикации ртутью.
Ключевые слова: хроническое воздействие ртути, хроническая ртутная интоксикация, эндотелиальная дисфункция, полиморфизм генов, ген эндотелиальной синтазы оксида азота, ген эндотелина-1, оксид азота, эндотелин-1.
O.V. Popkova, I.V. Kudaeva, L.B. Masnavieva, V.P. Belik. Genotype-phenotype characteristics of biochemical markers of endothelial dysfunction in patients with chronic mercury intoxication
East-Siberian Scientific Center of Human Ecology, Siberian Branch of the RAMS, Angarsk
The paper presents data on the frequency of polymorphisms of candidate genes involved in the formation of endothelial dysfunction — endothelin-1 (EDN1 Lys198Asn) and endothelial nitric oxide synthase (NOS3 T786C) together with the concentrations of their active products (nitric oxide, endothelin-1) in individuals with chronic mercury intoxication. The concentration change of nitric oxide and endothelin-1 indicates the presence of endothelial dysfunction in the individuals examined. The studied polymorphisms appeared to play a minor role in the pathogenesis of endothelial dysfunction in patients with chronic mercury intoxication.
Key words: chronic exposure to mercury, chronic mercury intoxication, endothelial dysfunction, gene polymorphisms, gene of endothelial nitric oxide synthase, gene endothelin-1, nitric oxide, endothelin-1.
В последние годы всё более актуальным ста- при развитии различных патологий. Большинство новится изучение генно-средовых взаимодействий генетических вариаций — это замены единичных
нуклеотидов (англ. single nucleotide polymorphism — SNP), приводящие к количественным изменениям экспрессии или затрагивающие биологические свойства белков. Вместе с тем, влияние генотипа на возникновение и течение патологического процесса проявляется при его аддитивном взаимодействии с факторами внешней среды.
Показано, что у лиц, контактирующих с ртутью, чаще и раньше, чем у неэкспонированных развиваются сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ). При этом наиболее распространенными среди них являются артериальная гипертония (АГ) и ишемиче-ская болезнь сердца (ИБС), которые встречаются у 77% пациентов в отдаленном периоде интоксикации ртутью и у 36% стажированных работающих [6]. В то же время механизмы развития этих заболеваний у лиц, контактирующих с ртутью, до настоящего времени остаются невыясненными, в связи с чем особую актуальность представляет поиск дополнительных маркеров, позволяющих более точно предсказать вероятность возникновения ССЗ.
В патогенезе заболеваний сердечно-сосудистой системы, согласно современным представлениям, одна из ведущих ролей отводится дисфункции эндотелия (ДЭ) [1]. Установлено, что выраженность нарушений функционального состояния эндотелия является предиктором сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности [10]. Таким образом, диагностика нарушений функционального состояния эндотелия может быть одним из инструментов прогноза возникновения сердечно-сосудистой патологии у данных пациентов.
С другой стороны, в основе развития ДЭ, кроме известных факторов, ответственных за прямое повреждение клеток эндотелия и последующее нарушение их функциональной активности, имеют значение структурные полиморфизмы генов, белковые продукты которых либо непосредственно являются биологически активными веществами эндотелиального происхождения, либо вовлечены в их синтез и секрецию клетками эндотелия. К таким генам можно отнести ген эндотелиальной синтазы оксида азота и эндотелина-1 (ЭТ-1). Генетические аберрации в структуре указанных генов приводят к развитию нарушений функции эндотелия, и, таким образом, создают предпосылки для возникновения
ССЗ.
Целью настоящего исследования явилось изучение частоты полиморфизма генов эндотелина-1 (EDN1 Lys198Asn) и эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS3 Т786С) в совокупности с концентрациями их активных продуктов — оксида азота NOx и эндотелина-1 в крови у лиц с хронической ртутной интоксикацией (ХРИ).
Материал и методики. В условиях клиники ФГБУ «ВСНЦ ЭЧ» СО РАМН были обследованы
44 мужчины в возрасте 54 (48—56) лет с диагнозом хронической ртутной интоксикации в отдаленном постконтактном периоде (на момент обследования период разобщения с токсикантом составлял более 5 лет). Диагноз профессионального заболевания был установлен врачами-профпатологами клиники. Исследования выполнены с информированного согласия обследуемых и соответствуют этическим нормам Хельсинкской декларации (2000 г.) и Приказа Минздрава РФ №266 (от 19.06.2003 г.).
Материалом для исследования служила венозная кровь. Выделение ДНК проводили при помощи наборов «ДНК-экспресс кровь» («Литех», Россия). Полиморфизм генов определяли методом ПЦР с использованием наборов реагентов «SNP-экспресс» («Литех», Россия) с электрофоретической детекцией продуктов реакции в агарозном геле, и в режиме реального времени. Суммарное содержание стабильных метаболитов оксида азота определяли спектрофо-тометрическим методом с использованием реактива Грисса [5]. Концентрацию эндотелина-1 определяли методом иммуноферментного анализа при помощи тест-системы Biomedica Gruppe (Англия) на ИФА-ридере (BioTek, США).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Результаты представлены в виде медианы и интерквартильного диапазона. Сравнение наблюдаемой и ожидаемой частот осуществляли по критерию %2.Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Относительная частота встречаемости признака приведена с указанием границ 95% доверительного интервала (ДИ).
Результаты и их обсуждение. Результаты анализа встречаемости генотипов и аллелей полиморфизма генов EDN1 и NOS3 в изучаемой выборке представлены в табл. Выявлено равномерное распределение «дикого» ТТ и гетерозиготного ТС генотипов полиморфизма Т786С в гене NOS3: 43,2% и 45,4% соответственно. Встречаемость «неблагоприятного» генотипа СС составила 11,4%. Процентное соотношение аллелей данного гена (Т и С) составила 65,9% и 34,1% соответственно. При изучении полиморфизма Lys198Asn гена EDN1 чаще определялся «дикий» генотип LysLys — 72,7%, в отличие от более редко встречающегося «неблагоприятного» генотипа AsnAsn — 2,3%. Удельный вес гетерозиготного генотипа LysAsn составил 25,0%. Аллель Lys соответственно выявлялся чаще — в 85,2%. Встречаемость аллеля Asn в обследованной группе была представлена в 14,8% случаев.
Таким образом, распределение генотипов и аллелей изучаемых генов соответствует выявляемости данных вариантов в европейской популяции: частота
генотипов ТТ, ТС, СС промотора в положении 786 в гене N083 варьируется в значительных пределах
— 29,9-40,6; 41,3-52,3 и 13,5-17,8% соответственно [13, 14]; генотипы полиморфизма Ьув198Авп гена EDN1 распределяются в популяции следующим
образом — ЬувЬув 56,7%, АвпАвп 5,0%, ЬувАвп 38,3% [15, 17].
Таблица
Распределение генотипов и аллелей генов-кандидатов, участвующих в формировании дисфункции эндотелия у лиц, экспонированных ртутью (удельный вес, % [95% ДИ])
Полиморфизм гена (SNP) Генотипы и аллели Результаты
NOS3 Т786С генотип ТТ 43,2 [26,3-60,1]
генотип СС 11,4 [0,1-23,0]
генотип ТС 45,4 [28,5-62,3]
аллель Т 65,9 [54,9-76,9]
аллель С 34,1 [23,1-45,1]
EDN1 Lys198Asn генотип LysLys 72,7 [57,3-88,1]
генотип AsnAsn 2,3 [0,1-9,1]
генотип LysAsn 25,0 [10,1-40,0]
аллель Lys 85,2 [76,7-93,7]
аллель Asn 14,8 [6,3-23,3]
Известно, что изучаемые нами гены активно участвуют в функционировании сердечно-сосудистой системы, контролируя равновесие между факторами вазоконстрикции и вазодилатации. При этом аллели Т и Lys выступают протекторами в поддержании нормальной функции эндотелия сосудов. Аллели С и Asn (генотипы СС/ТС и AsnAsn/LysAsn) напротив, являются генетическими маркерами в отношении пре-дикции развития сердечных заболеваний или формирования осложнений. Результаты распределения изучаемых полиморфизмов показали наличие «дикого» генотипа гена EDN1 у 73% больных ХРИ. Можно утверждать, что в изучаемой выборке большая часть обследуемых являлась носителями гена-протектора EDN1. А носительство «нормальных» и «неблагоприятных» генотипов гена эндотелиальной синтазы оксида азота NOS3 распределилось равномерно — у 43,2% и 56,8% обследованных соответственно. В то же время, ранее проведенные исследования позволили установить статистически значимое снижение уровня NOx в динамике обследования пациентов с хронической ртутной интоксикацией почти на 30%, выходящее за пределы нижней референсной границы и повышенный уровень эндотелина-1 [7].
В связи с этим на следующем этапе исследований была проведена оценка концентрации изучаемых
биохимических маркеров в зависимости от генотипов соответствующих генов. Содержание в соответствии с распределением полиморфизма NOS3 (Т786С) представлено на рис. 1. Следует отметить, что низкая концентрация данного аналита была выявлена у всех обследованных лиц и не зависела от генотипа, при этом среднегрупповые концентрации NOx составили 26,2 (22,4—30,6) мкМ/мл, что было ниже нормативных величин (32,5 — 45,6 мкМ/л). Известно, что снижение содержания NOx может быть связано с нарушением экспрессии или транскрипции фермента NO-синтазы, снижением доступности L-аргинина или ускоренным разрушением NOx. Ген NOS3 контролирует активность конститутивной NOS, содержащейся, преимущественно, в эндотели-альных клетках, то есть эндотелиальная NO-синтаза экспрессируется как в условиях физиологической нормы, так и при патологии. Синтезируемый ею NO![ в клетках эндотелия вызывает расслабление гладких мышц сосудов, увеличение кровотока, снижение периферического сопротивления и системного артериального давления. Наличие «неблагоприятного» генотипа Т786С гена эндотелиальной синтазы оксида азота приводит к уменьшению концентрации оксида азота в кровяном русле, вследствие чего нарушается процесс вазодилатации. Учитывая, что статистически значимые различия в содержании NOx у носителей разных генотипов NOS3 отсутствовали, его концентрация была ниже референсной границы и средний возраст обследованных составил 54 (48; 56) года, для выявления начальных признаков ДЭ необходимо начинать мониторинг уровня оксида азота в крови у лиц, имеющих «неблагоприятный» генотип и контактирующих с ртутью, в более раннем возрасте.
Учитывая, что NOjj является антагонистом в отношении сосудосуживающего действия эндоте-лина-1, обладающего выраженным вазоконстрик-торным эффектом [2,4], на следующем этапе было изучено его содержание в сыворотке крови (рис. 2). Установлено, что у всех обследованных вне зависимости от генотипов EDN1 Lys198Asn уровень ЭТ-1 находился в диапазоне повышенных значений и составил 1,0 (0,9; 1,2) фмоль/мл (референсный уровень — до 0,26 фмоль/мл). Следовательно, наличие «нормального» генотипа EDN1 у большинства обследуемых лиц не являлось протективным в отношении повышенного образования ЭТ-1 в условиях хронического экспонирования ртутью. Данный факт является дополнительным подтверждением необходимости раннего начала исследования биохимических маркеров ДЭ у лиц, контактирующих с данным токсикантом.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что помимо генетических факторов в развитии эн-
дотелиальной дисфункции большое значение имеют другие патологические механизмы. В частности, известно, что основными активаторами синтеза эн-дотелина-1 в организме являются гипоксия, ишемия и стресс [19]. Эти факторы активируют транскрипцию иРНК, синтез предшественников эндотелина, превращение их в эндотелин-1 и его секрецию за несколько минут [11]. В то же время, катехоламины, ангиотензин II, липопротеины высокой плотности, факторы роста активируют внутриклеточные механизмы синтеза эндотелина-1 без взаимодействия с рецепторами плазмолемы, путем непосредственного влияния на протеинкиназу С [18]. А на культуре эндотелиальных клеток пуповины человека было показано, что липопротеины низкой плотности увеличивают секрецию эндотелина-1, тогда как липо-протеины высокой плотности, наоборот, этот процесс тормозят [12]. В то же время установлено, что длительное воздействие ртути сопровождается, с одной стороны, увеличением сывороточной концентрации норадреналина, приобретающем декомпен-сированный характер при установленном диагнозе ртутной интоксикации, а с другой стороны, снижением уровня липопротеинов высокой плотности и ростом концентрации атерогенных липопротеиновых фракций [8].
Данные факторы могут играть патогенетическую значимость в развитии как гиперэндотелиемии, так и гипооксидазотемии.
N0*, мкМ/л
40
30 -
20 -
10
«Дикий» генотип
генотип
генотип
- - - Нижняя референсная граница
- Верхняя референсная граница
Рис. 1. Содержание оксида азота в крови у больных ХРИ в зависимости от полиморфного варианта гена NOS3
(Т786С)
Среди важных свойств эндотелина-1 необходимо отметить его способность индуцировать временную вазодилатацию, связанную с повышением высвобождения N0,, из эндотелиальных клеток, причем этот процесс возможен только при сохраненной функции эндотелия [16]. Учитывая данный факт,
можно предположить, что повышенный уровень данного пептида при параллельном стойком снижении концентрации N0^ развивающиеся вследствие хронического воздействия ртути, свидетельствуют о серьезных нарушениях функций эндотелия. Кроме того, существуют доказательства роли эндотелина в процессах оксидативного стресса [3]. Его развитие отмечается, в том числе, и при интоксикации ртутью [9].
В свою очередь, оксидативный стресс усугубляет как формирование процесса эндотелиальной дисфункции, так и развитие атеросклеротических изменений.
ЭТ-1, фмоль/мл
«Неблагоприятный» Гетерозиготный
«Дикий» «Неблагоприятный» Гетерозиготный
генотип генотип генотип
- - - Нижняя референсная граница
- Верхняя референсная граница
Рис. 2. Содержание эндотелина-1 в крови у больных ХРИ в зависимости от полиморфного варианта гена EDN1 (Lys198Asn)
Заключение. Удельный вес неблагоприятных генотипов СС/ТС гена эндотелиальной синта-зы оксида азота и AsnAsn/LysAsn гена EDN1 встречается соответственно у 56,8% и 27,3%о мужчин, экспонированных ртутью. При этом снижение концентрации метаболитов оксида азота и повышение уровня эндотелина-1 у обследованных лиц с ртутной интоксик ацией указывает на наличие эндотелиальной дисфункции. Отсутствие зависимости данных нарушений от генотипа изучаемых генов-кандидатов у лиц в возрасте 54 (48—56) лет, свидетельствует о необходимости раннего начала исследования биохимических маркеров ДЭ у лиц, контактирующих с данным токсикантом.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ (см References пп.12-19)
1. Бэр Ф.М. // Топ Медицина. — 2000. — №3. — С.13—18.
2. Ванин А.Ф. // Вест. РАМН. — 2000. — № 4. — С. 3-5.
0
3. Визир ВА., Березин А.Е., Демиденко А.В. // Укр. терапевт. журн. — 2003. — № 6. — С. 25—31.
4. Власов Т.Д. // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. — 2002. — Т. 1. — № 4. — С. 68-73.
5. Голиков П.П., Николаева Н.Ю. // Биомедицинская химия. — 2004. — №.1. — С. 79-85.
6. Катаманова Е.В. Нарушения функциональной активности мозга при профессиональном воздействии ней-ротоксикантов: автореф. дис. док. мед. наук. Иркутск,
2012. - 47 с.
7. Кудаева И.В., Попкова О.В. // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. — 2012. — Т. 87. — № 5 -2. — С. 34-38.
8. Кудаева И.В. Роль биохимических процессов при формировании неврологических нарушений у работающих в условиях экспозиции производственными токсикантами: автореф. дис... д-ра мед. наук. Иркутск, 2013. — 47 с.
9. Кудаева И.В. // Вест. новых мед. технологий. —
2009. — №1. — С. 253-258.
10. Оганов Р.Г., Масленникова Г.Я.//Профилактиче-ская медицина. — 2009. — Т.12. — №6. — С. 3-7.
11. Патарая С.А., Преображенский Д.В. Сидоренко Б.А., Масенко В.П. // Кардиология. — 2000. — Т.40. — № 6. — С. 78-85.
REFERENCES
1. Ber F.M. // Top Meditsina. 2000; 3: 13-18 (in Russian).
2. Vanin A.F. // Vest. RAMN. 2000; 4: 3-5 (in
Russian).
3. Vizir V.A., Berezin A.E., Demidenko A.V. / Ukr. terapevt. zhurn. 2003; 6: 25-31 (in Russian).
4. Vlasov T.D. // Regionarnoe krovoobrashenie i mikrotsirkulyatsiya. 2002; Vol. 1; 4: 68-73 (in Russian).
5. Golikov P.P., Nikolayeva N.Yu. // Biomeditsinskaya
khimiya. 2004; 1: 79-85 (in Russian).
6. Katamanova E.V. Disorders of brain functional activity under occupational exposure to neurotoxic agents: diss. Irkutsk.
2012: 47 (in Russian).
7. Kudaeva I.V., Popkova O.V. // Byull. VSNTS SO RAMN. 2012; Vol. 87; 5-2: 34-38 (in Russian).
8. Kudaeva I.V. Role of biochemical processes in neurologic disorders formation in workers exposed to occupaitonal toxic agents: diss. Irkutsk. 2013; 47 p. (in Russian).
9. Kudaeva I.V. // Vestnik novykh med. Tekhnologiy. 2009; 1: 253-258 (in Russian).
10. Oganov R.G., Maslennikova G.Ya. // Profilakticheskaya meditsina. 2009; Vol. 12; 6: 3-7 (in Russian).
11. Pataraya S.A., Preobrazhenskiy D.V., Sidorenko BA., Masenko V.P. // Kardiologiya. 2000; Vol. 40; 6: 78-85 (in Russian).
12. Barsukov A.E., Makhnov N.A. // Vestn. Khir. Im. I I Grek. — 2005. — Vol.164. — P. 102-104.
13. Colombo M.G., Paradossi U., Andreassi M.G. et al. // Clin. Chem. — 2003.- 49(3). — Р. 389-395.
14. Ghilardi G., Biondi ML, DeMonti M. et al. // Clin. Chem. — 2002. — 48. — Р. 989-993.
15. Marasciulo F.L., Montagnani M., Potenza M.A. // Curr. Med. Chem. — 2006. - 13 (14). — Р. 1655-65.
16. Negrusz-Kawechka M. // Pol. Mercuriusz. Lek. —
2001. — Vol. 11. — P. 444-446.
17. Nelis M. et al. // PLos one. — 2009. — Р. 5472.
18. Rothermund L., Pinto Y.M., Hocher B. et al. // Circulation. — 2000. — Vol. 102. — P. 1582-1588.
19. Willey K.E. Davenport A.P. Brit. // J. Pharmacology. — 2001. — Vol. 132. — P. 213-220.
Поступила 28.02.2014
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Попкова Ольга Вячеславовна,
мл. науч. сотр. лаборатории биохимии. E-mail: angpovolga@mail.ru. Кудаева Ирина Валерьевна,
зав. клинико-диагностической лабораторией, руководитель лаборатории биохимии, д-р мед. наук, доцент. E-mail: kudaeva irina @mail .ru. Маснавиева Людмила Борисовш,
ст. науч. сотр. лаборатории биохимии, канд. биол. наук. E-mail: masnavieva_luda@mail.ru. Белик Владимир Павлович,
врач клинико-диагностической лаборатории. E-mail: vp_belik@mail.ru.
