CC BY
53
© Запорожан В. М., Анчева I. А.
УДК 618. 36 - 06 : 616. 155. 194] - 056. 7 - 07 - 08
Запорожан В. М., Анчева I. А.
ГЕННА МЕРЕЖА АДАПТИВНО! В1ДПОВ1Д1 НА ХРОН1ЧНУ Г1ПОКС1Ю ПРИ
ЗАЛ1ЗОДЕФ1ЦИТН1Й АНЕМЙ" ВАГ1ТНИХ
Одеський нацюнальний медичний унiверситет (м. Одеса)
Виконане дослiдження е фрагментом науково-дослщно! роботи Одеського нацiонального медич-ного уыверситету МОЗ Укра1ни «Молекулярно-гене-тичн та екологозалежнi механiзми розвитку пухлин репродуктивно! системи: шляхи удосконалення дiа-гностики, лiкування i профiлактики», № держ. рее-страцiI 0102Ш06588.
Вступ. За даними експер^в ВООЗ анемiя вияв-ляеться щороку в свт у 35-75 % вагiтних [1]. У кра!-нах СНД за рiзними джерелами, на них страждае вiд 20 до 80 % вагггних, у розвинених кра!нах бвропи та США - вiд 20 до 30 % [1, 2]. Особливо часто (до 78-80 %) залiзодефiцитнi стани зустрiчаються в репонах з високим рiвнем народжуваностi [3], однак в останн роки з'являються данi про тiсну асоцiацiю сщеропенп iз соматичними захворюваннями [4].
На жаль, у бтышост випадкiв резерви залiза на початку вагiтностi е невисокими, а наприюнщ геста-цмного процесу залiзо дефiцит розвиваетыся у вЫх без винятку вагiтних або в латентнм, або в маыфес-тованiй формi [1, 5, 6]. Це пов'язано з тим, що вапт-нiсты супроводжуетыся додатковою втратою залiза: 320-500 мг залiза витрачаетыся на прирiст гемогло-бiну i зростання клiтинного метаболiзму, 100 мг на побудову плаценти, 50 мг на збтышення розмiрiв матки, 400-500 мг на потреби плода. В результату з урахуванням депонованого залiза, плщ забезпе-чуетыся залiзом в достатнм кiлыкостi, але при цыому у вагiтних нерiдко розвиваютыся залiзодефiцитнi стани рiзного ступеня тяжкостi [5-7].
Бюлопчна значимiсты залiза визначаетыся його участю в тканинному диханнi. При дефщит залiза у вагiтних виникае прогресуюча гемiчна гiпоксiя з по-далышим розвитком вторинних метаболiчних розла-дiв. Оскiлыки при вагiтностi споживання кисню збты-шуетыся на 15-33 %, це посилюе розвиток ппоксп [1, 6, 7]. У вагiтних з тяжким ступенем залiзодефiцитноi, анеми розвиваетыся не тiлыки тканинна i гемiчна п-поксiя, а й циркуляторна, обумовлена розвитком дистрофiчних змш в мiокардi, порушенням його ско-рочувалыно! здатностi, розвитком гiпокiнетичного типу кровооб^у [7].
Рiзнi дослiдження показали, що при дефщит за-лiза вагiтнi жiнки бiлыш сприйнятливi до шфекцмних захворюваны, тому що залiзо бере участы у зростанн1
нервових клггин, синтезi колагену, метаболiзмi по-рфiрину, термiналыному окисленнi i окисному фос-форилюванню в клiтинах, робот iмунноI системи [6, 7].
При тривалому переб^ анемiI порушуетыся функ^я плаценти, зростае ризик передчасних поло-гiв та прееклампсiI. У 10-15 % випадюв визначаютыся гiпотонiя i слабкiсты пологово! дiялыностi, гiпотонiчнi кровотечi в пологах, гнiйно-септичнi ускладнення та ппогалакпя [1, 3, 9]. Навггы при прихованому деф^ цитi залiза у 59 % жiнок вщзначено несприятливий перебiг вагiтностi [5].
У зв'язку з вищевикладеним виникае потреба у розробц пiдходiв до оцшки ризику виникнення асо-цiйованих iз залiзодефiцитними станами усклад-нены ваптностк Одним з найбiлыш перспективних напрямюв е дослiдження ролi генних регулятор-них мереж, якi визначаюты адаптации можливост1 органiзму та е чутливими до хроычно! гiпоксii. До таких геыв належаты зокрема Н1Р1Л (ОМ1М 603348), еЫОБ (ОМ1М 163729), ^^ЕЮРЛ (ОМ1М 192240) та РЮР (ОМ1М 600153).
Мережа генно! регуляцii - це сукупнюты опосе-редковано пов'язаних мiж собою модулыних еле-мен^в ДНК (генiв), якi приймаюты множинн вхiднi сигнали у виглядi РНК i бiлкiв, обробляюты сигнали i зумовлююты темп, з яким гени мережi транскри-буютыся в РНК i транслюютыся в бiлки. Архтектура мережi вiдцзеркалюе взаемодiю !! рiзних елементiв I дае найповнiше уявлення щодо регуляцii функцюну-вання кгмтини на вiдмiну вiд традицiйного вивчення поодиноких геыв. Таким чином, щентифка^я характеру функцiоналыних зв'язкiв мiж рiзними генами-кандидатами, що входяты до складу генно! мережi е важливим завданням для дослiдника.
Метою дослщження була оцiнка експресii геыв Н1Р1Л, еЫОБ, VЕGFA та РЮР, якi формуюты регуля-торну генну мережу, у плацент вагiтних iз проявами залiзодефiцитноi анемii.
Об'ект I методи дослщження. Дослщження виконане на базi пологового будинку № 2 (м. Одеса) та генетично! лаборатори клiнiки «Надiя» (м. Ки!в). Об-стежено 150 породiлы, вщ яких були одержанi зразки плаценти. При цыому були видтеы наступи клiнiчнi групи:
I група - плаценти вщ жiнок з фiзiологiчним пере-6iroM BariTHOCTi та полопв (n = 30);
II група - плаценти вщ жЫок з aнемieю вaгiтних в aHaMHe3i (n = 40);
III група - плаценти вщ жiнок з дисфунк^ею плаценти i aнемiею в aнaмнезi (n = 80).
Видтення РНК проводилось на бaзi Клiнiки ре-продуктивно'| медицини «Нaдiя» 3i зрaзкiв бiоптaту плаценти породть з метою дослщження експреси геыв HIF1A (OMIM 603348), eNOS (OMIM 163729), VEGFA (OMIM 192240) та PIGF(OMIM 600153).
Для цього послщовно проводились наступи про-цедури: вщ6!р та проведення бюпсп плаценти, видтення РНК, проведення зворотно'| транскрипцп та полiмерaзноï ланцюгово'| реакци (ПЛР) у режимi реального часу.
Проведення бюпси плаценти здмснювалось кон-хотомом. Фрагменти плаценти вщ часу взяття бю-мaтерiaлу до проведення доотдження зберiгaлись у 10 е^валентних об'емах RNAlater ® Solution (Ambion, USA, Cat# AM7024) за температури «-20oC».
Видiлення РНК проводилося з використанням набору QIAamp RNA Blood Mini Kit (Qiagen, Ымеччи-на, кат № 52304) у вщповщност до протоколу вироб-ника для видiлення нуклешових кислот з фрагмен^в тканин. Для цього за рекоменда^ею виробника проводились наступи дм:
- вiдмивaння бiомaтерiaлу вiд RNAlater ® Solution;
- розтирання шматочюв тканини у рiдкому азотг
- гомогенiзaцiя розтертих фрaгментiв за допо-могою центрифужних колонок QIAshredder (Qiagen, Нiмеччинa) у лiзуючому буферг
- преципiтaцiя еквiвaлентним об'емом 70 % етанолу;
- сорб^я РНК на центрифужних колонках QIAamp spin column (Qiagen, Нмеччина) з наступною трикратною вщмивкою та просушкою колонок;
- елю^я РНК за допомогою втьно'| вiд рибокун-леаз водi для молекулярних дослiджень.
Характеристики видтено'| РНК визначали з використанням NanoDrop 1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, США) шляхом визначення показ-
260 /А280 та А260/А 230'
Отримана РНК зберiгaлaсь при температур! «-200С» та використовувалась для проведення зво-ротно'|транскрипцп.
Зворотна транскрип^я проводилась з використанням набору Hight-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA, Cat# 4368814) вщповщно до рекомендацм виробника. Реaкцiйнa сум!ш для проведення зворотно'| транскрипцп мю-тила (з розрахунку на 1 зразок): 2 мкл 10х буферу для зворотно'| транскрипци, 0,8 мкл 25х сум!±п dNTP (по 100 мМ кожного), 2 мкл 10х сум1|±м розЫяних (ви-падкових) прaймерiв, 1 мкл зворотно'| транскрипта-зи MultiScribe ™, 4,2 мкл втьно'| вщ нуклеаз води для проведення ПЛР та 10 мкл видтено'| РНК. Зворотна транскрип^я проводилася з використанням ампл^ фiкaтору Applied Biosystems® 2720 Thermal Cycler
(Applied Biosystems, USA) з наступними температур-ними умовами: 1. 10'@25C; 2. 120'@37C; 3. 5"@85C; 4. 4C@<». Отримана кДНК збер^алася при темпера-Typi «4-8С» та використовувалась для оцiнки експре-cií генiв.
Оцiнка експpесiI геыв проводилась з використанням пресинтезованих TaqMan ® Gene Expression Assay (Applied Biosystems, USA) методом вщнос-но! експресп. Використовувались настyпнi тест-системи для генiв:
• HIF1A (OMIM 603348): Cat#4453320
- Hs00153153_m1;
• eNOS (OMIM 163729): Cat#4453320
- Hs01574659_m1;
• VEGFA (OMIM 192240): Cat# 4453320
- Hs00900055_m1;
• PIGF (OMIM 600153): Cat#4448892 - hCG1987697;
• GAPDH (OMIM 138400) - внутршнм контрольний
ген: Cat# 4331182 - Hs99999905_m1.
Кожен 20x TaqMan ® Gene Expression Assay мю-тив два немiченi праймера (при кiнцевомy 1х розве-деннi 900нМ на праймер, при 20х стоковiй концен-тpацiI 18мкМ на праймер) та один 6-FAM™ мiчений TaqMan ® MGB зонд (при юнцевому 1х розведенн1 250нМ, при 20х стоковiй концентpацiI 5мкМ).
Реакцiйна сyмiш мiстила: 1.0 мкл 20x TaqMan ® Gene Expression Assay, 10 мкл 10x TaqMan ® Gene Expression Master Mix, 6мкл вiльноI вiд рибонуклеаз води для ПЛР та 3 мкл кДНК, отримано! на попере-дньому етапк Амплiфiкацiя та детекцiя проводилася за використання ПЛР-системи у реальному час 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США, кат. № 4351105) з програмним забезпеченням SDS 2,0,5 з наступними температурними умовами: 1.2'@50C; 2.10'@95C; 3.60x (15"@95C, 1'@60C). Зчитування даних проводилось приладом на останньому етап1 кожного циклу. Аналiз pезyльтатiв проводився у ручному pежимi за методом за AACt.
Аналiз генно! меpежi проводили за допомогою програмного забезпечення GeneMania [8]. Статис-тична обробка виконана у сеpедовищi R [10].
Результати дослщжень та Ух обговорення. Клiнiчна картина у групах дослiдження була стереотипною. Середнм вiк пацieнток I, II та Ill групи склав 28,2 ± 4,5, 31,2 ± 6,8 й 27,2 ± 1,8 роюв вщпо-вiдно (p > 0,05). У пащенток II групи визначалися кл^чно манiфестованi ознаки залiзодефiцитy (за-лiзо сироватки кpовi - 11,3 ± 0,4 мкмоль/л, фери-тин - 11,9 ± 1,6 нг/мл). У ваптних III групи ваптнють пеpебiгала з дисфyнкцiею плаценти I-IIA ступеня, при чому у 11 (13,8 %) пащенток гестацмний пер^ од ускладнився маловоддям, у 5 (6,3 %) - низькою плацентащею, а у 13 (16,3 %) породть виник дис-трес плоду у I пеpiодi полопв, який був показанням до оперативного розродження.
При аналiзi генно! меpежi (рис. 1) встановлено, що до !! складу yвiйшли гени, як контролюють синтез iндyцибельних ппокЫею бiлкiв (родина EGLN), метаболiзм ксенобютиюв (ARNT, FLT, PLIN), пла-центарних фактоpiв росту (PGF), стан ытрерпчних систем (NOSTRIN), енергетичного забезпечення
[ф
сф)
ü^ii
Рис. 1. Генна мережа ре-гуляцм' адаптивно!' вщпо-Bifli на хрошчну rinoKciio (GeneMania).
16
14
12
10
Л С
-2
-4
I
HIFI А
eNOS
1$
VEGFA
PL
5F
Рис. 2. Експрес1я гешв у обстежених пац1енток.
функцюнування клггин оргашзму тощо. При цьому найбтьш TicHi функцюнальш зв'язки спостер1галися мiж генами HIF1A, eNOS та VEGFA.
HaTOMicTb, при аналiзi експресм reHiB HIF1A, eNOS, VEGFA та PIGF встановлено (рис. 2), що
©найменш виражеш змЫи на тл1 зал1-зодефщитноТ анемм вщбулися щодо експресм гену PIGF, тод1 як актив-
©нють експресм гешв HIF1A та VEGFA pi3KO збшыиилася, а експрес1я гену eNOS залежала вщ ступеня вира-женост1 дисфункцм плаценти - при наявност1 данного ускладнення екс-прес1я гену pi3KO знижувалася.
Зважаючи на те, що активнють експресм гешв HIF1A та VEGFA при зал1зодефщитшй анемм збшыиува-лася, вщповщно, у 10,2та 10,9 раз1в, менш виражений прирют експресм reHiB HIF1A та VEGFA у ваптних ¡з дисфункщею плаценти, що виникла на Tni зал1зодефщитноТ анемм, та супроводжувалася парадоксальним зниженням експресм гена eNOS, можна пояснити вичерпанням адап-тацмних можливостей оргашзму.
Таким чином, змЫи експресм reHiB, залучених до генноТ мереж! свщчать про активну адаптащю оргашзму ваптноТ до хрошчноТ rinoKcii, яка супроводжуе зал!зодефщитш стани. Водночас, ¡зольована ощнка експресм окремих гешв, вочевидь, не мае суттевого значения для потреб прогнозування nepeöiry вапт-HOCTi та и клЫчних перинатальних наслщюв. Висновки.
1. Найбтьш виражеш змши експресм при зал!зодефщитшй анемм вщбулися щодо reHiB HIF1A та VEGFA
2. Активнють експресм reHiB HIF1A та VEGFA при зал1зодефщитшй анемм збтьшуеться у 10,2 та 10,9 pa3iB
3. Менш виражений прирют експресм reHiB HIF1A та VEGFA у ваптних ¡з дисфункщею плаценти, що виникла на тл1 зал1зодефщитноТ анемм, може пояснюватися вичерпанням адаптацмних можливостей оргашзму.
Перспективи подальших дослщжень пов'я-3aHi i3 OЦiнKOЮ фенотипових 3MiH продукцм шду-цiбельних гiпоксieю бiлкiв, як маркеру прогнозу nepe6iry вaгiтностi, ускпадненоУ зaлiзодефiцитною aнемieю.
■ Трупа I "ЖГрупа II -^-Група III
Л^ература
2.
3.
Малкоч А. В. Железодефицитные состояния и железодефицитная анемия у женщин детородного возраста / А. В. Мал-коч, Л. А. Анастасевич, Н. Н. Филатова // Лечащий врач. - 2013. - № 04. - С. 37.
Семенова М. В. Состояние плаценты при железодефицитной анемии у беременных / М. В. Семенова, Е. Л. Баженов, Н. М. Канунникова, Т. В. Терехова // Морфологические ведомости. - 2007. - Т. 1, № 1-2. - С. 218-219. Amel Ivan E., A. M. Evaluation of anaemia in booked antenatal mothers during the last trimester. / Amel Ivan E., A. M. // J. Clin. Diagn. Res. - 2013. - Vol. 7(11) - P. 2487-2490.
4. Blackburn S. Maternal, Fetal, & Neonatal Physiology. 4 edition / S. Blackburn. - N. Y Saunders, 2012. - 768 р.
5. GeneMania Database. Електронний ресурс. Режим доступу: www. genemania. org
6. Pasricha S. R. Control of iron deficiency anemia in low- and middle-income countries / S. R. Pasricha, H. Drakesmith, J. Black [et al.] // Blood. - 2013. - Vol. 121 (14) - P. 2607-2617.
7. Salomon C. Hypoxia-induced changes in the bioactivity of cytotrophoblast-derived exosomes / C. Salomon, M. Kobayashi, K. Ashman [et al.] // PLoS One. - 2013. - Vol. 8(11) - Р e79636.
8. Tutorial R. Електронний ресурс. Режим доступу: http://www. r-tutor. com/r-introduction
9. Vandevijvere S. Iron status and its determinants in a nationally representative sample of pregnant women / S. Vandevijvere, S. Amsalkhir, H. Van Oyen [et al.] // J. Acad. Nutr. Diet. - 2013. - Vol. 113(5) - P. 659-666.
10. Winter W. E. The molecular biology of human iron metabolism / W. E. Winter, L. A. Bazydlo, N. S. Harris // Lab. Med. - 2014. -Vol. 45(2) - P. 92-102
УДК 618. 36 - 06 : 616. 155. 194] - 056. 7 - 07 - 08
ГЕН НА МЕРЕЖА АДАПТИВНОТ В1ДПОВ1Д1 НА ХРОН1ЧНУ Г1ПОКС1Ю ПРИ ЗАЛ1ЗОДЕФ1ЦИТН1Й АНЕМН ВАГ1ТНИХ
Запорожан В. М., Анчева I. А.
Резюме. Метою доотдження була оцшка експреси геыв HIF1A, eNOS, VЕGFA та PIGF, як формують ре-гуляторну генну мережу, у плацент вагггних i3 проявами залiзодефiцитноI анемп.
Наведений аналiз складових генно! мережг Показано, що при залiзодефiцитнiй анемп експреЫя геыв HIF1A та VЕGFA зростае у 10,2 та 10,9 разiв, тодi як при наявностi дисфункцп плаценти прирiст експресiI е менш вираженим, що може пояснюватися вичерпанням адаптацмних можливостей органiзму. Ключовi слова: залiзодефiцитна анемiя, вагiтнiсть, генетика, адапта^я.
УДК 618. 36 - 06 : 616. 155. 194] - 056. 7 - 07 - 08
ГЕННАЯ СЕТЬ АДАПТИВНОГО ОТВЕТА НА ХРОНИЧЕСКУЮ ГИПОКСИЮ ПРИ ЖЕЛЕЗОДЕФИЦИТ-НОЙ АНЕМИИ БЕРЕМЕННЫХ Запорожан В. Н., Анчева И. А.
Резюме. Целью исследования была оценка экспрессии генов HIF1A, eNOS, VЕGFA и PIGF, формирующих регуляторную генную сеть, в плаценте беременных с проявлениями железодефицитной анемии.
Проведен анализ составляющих генной сети. Показано, что при железодефицитной анемии экспрессия генов HIF1A и VЕGFA возрастает в 10,2 и 10,9 раз, тогда как при наличии дисфункции плаценты прирост экспрессии менее выраженный, что может объясняться истощением адаптационных возможностей организма. Ключевые слова: железодефицитная анемия, беременность, генетика, адаптация.
UDC 618. 36 - 06 : 616. 155. 194] - 056. 7 - 07 - 08
Gene Network of the Adaptive Response to Chronic Hypoxia with Iron Deficiency Anemia during Pregnancy
Zaporozhan V. M., Ancheva I. A.
Abstract. A gene regulatory network or genetic regulatory network is a collection of DNA segments in a cell which interact with each other indirectly (through their RNA and protein expression products) and with other substances in the cell, thereby governing the expression levels of mRNA and proteins. In general, each mRNA molecule goes on to make a specific protein (or set of proteins).
Genetic differences in the ability to regulate iron in the placenta tissue are likely to contribute; however, identifying the underlying genes is difficult. Placenta iron regulation is highly complex, involving many genes and biochemical pathways. These genes act at multiple levels, e. g., transcriptionally and post-transcriptionally, and by different mechanisms, e. g. transport, absorption, storage, and export. Moreover, they may interact with environmental factors such as diet.
The aim of the study was to evaluate the expression of genes HIF1A, eNOS, VEGFA and PIGF, which form a gene regulatory network in the placenta of pregnant women with signs of iron deficiency anemia.
Material & Methods. The research was performed at the maternity hospital № 2 (Odessa) and Genetic Laboratories "Nadiya" (Kyiv). The study involved 150 women in labor and placenta samples were obtained from them. Thus were the following clinical groups: I group - the placenta samples of women with physiological pregnancy and childbirth (n = 30). The second group - the placenta samples of pregnant women with a history of anemia (n = 40). The third group - the placenta samples of women with placental dysfunction and a history of anemia (n = 80).
RNA analysis was conducted at the Clinic of Reproductive Medicine "Nadiya" from biopsy samples of placentas to investigate gene expression HIF1A (OMIM 603348), eNOS (OMIM 163729), VEGFA (OMIM 192240) and PIGF (OMIM 600153). For completing the analysis of gene expression there were consistently carried out the following procedures: sampling and biopsy of the placenta, the selection of RNA by the reverse transcription and polymerase chain reaction (PCR) in real time.
Analysis of genetic networks was performed using the software GeneMania. Statistical analysis performed in the R environment.
Results. In the analysis of gene network revealed that its membership includes genes that control the synthesis of hypoxia inducible protein (family of EGLN), metabolism of xenobiotics (ARNT, FLT, PLIN), placental growth factor (PGF), state of nitric oxide depending regulatory systems (NOSTRIN), energy supply functioning of body cells and so on. The most strong functional relationships were observed between genes HIF1A, eNOS and VEGFA.
The analysis of gene network components determined that with iron deficiency anemia gene expression of HIF1A and VEGFA increased in 10. 2 and 10. 9 folds, while the presence of placental dysfunction increment expression is less pronounced, which may be due to the exhaustion of the adaptive capacity of the organism.
Thus the changes in expression of genes involved in studied genetic networks indicate active adaptation during pregnancy to chronic hypoxia that accompanies iron deficiency. However, an isolated score expression of individual genes were apparently not essential to predict the needs of pregnancy and perinatal outcomes of clinical.
Keywords: iron deficiency anemia, pregnancy, genetics, adaptation.
Рецензент - проф. Лiхачов К. В.
Стаття надшшла 14. 07. 2014 р.
