CC BY
294
технологии молекулярной диагностики, получения биомедицинских клеточных продуктов и др.
Оформился кластер геномных биотехнологий, составляющих наравне с нанотехнология-ми основу VI технологического уклада (рисунок). Предложен ряд новых высокоэффективных геномных биотехнологий для сельского хозяйства, здравоохранения, спорта, охраны окружающей среды.
Новейшие геномные подходы использованы при разработке биотехнологий маркерной селекции для растениеводства (по 10 культурам) и животноводства (крупный рогатый скот, свиньи, лошади). Предложены методы ДНК-идентификации и паспортизации для оценки достоверности происхождения животных и подтверждения сортовой принадлежности растений.
Геномные технологии нашли применение как инструмент для изучения генетического разнообразия и структуры популяций диких животных (больших белоголовых чаек, благородного оленя, европейской косули и др.). Проведен ДНК-анализ популяции беловежского зубра, результаты которого легли в основу Плана мероприятий по сохранению и рациональному использованию зубров на 2015-2019 гг., реализующегося в рамках государственной программы «Охрана окружающей среды и устойчивое использование природных ресурсов» на 2016-2020 гг.
Начато формирование инновационной инфраструктуры в сфере биотехнологий: созданы Республиканский центр геномных биотехнологий и Республиканский научно-медицинский центр «Клеточные технологии», Центр аналитических и генно-инженерных исследований, введены в эксплуатацию специальное поле для испытания трансгенных растений при их
первом высвобождении в окружающую среду и ферма для содержания коз - продуцентов ре-комбинантного лактоферрина человека.
Совершенствуется биоресурсная база биотехнологий: созданы республиканский банк ДНК человека, растений, животных и микроорганизмов (более 9 тыс. образцов); банк промышленно ценных микроорганизмов; регистр доноров костного мозга человека (более 18 тыс. доноров) и др.
Задачей первостепенной важности на ближайшую перспективу является обеспечение конкурентоспособности биотехнологического сектора экономики, что требует дальнейшего развития биоресурсной базы, повышения эффективности внедряемых биотехнологий, снижения их энерго- и материалоемкости, увеличения импортозамещающего и экспортного потенциала. На это направлены такие проекты, как Национальный научно-технологический парк в области фармацевтики, нано- и биотехнологий «БелБиоград», а также формирование Биотехнологической евразийской платформы.
Масштабное и повсеместное использование биотехнологий -необходимое условие перехода экономики на следующий технологический уровень. При этом задача научного обеспечения -разработать биотехнологии, способные составить основу научно-технологического «прорыва» и гарантировать их трансфер в практику в виде продукции и услуг. Достижению этой цели призвана содействовать подпрограмма «Инновационные биотехнологии - 2020» новой Государственной программы «Наукоемкие технологии и техника» на 2016-2020 гг., предусматривающая развитие всех основных сегментов биотехнологической отрасли в соответствии с мировыми тенденциями перехода к экономике будущего. СИ
Резюме. Изложены результаты использования генетических и биотехнологических методов в процессе создания новых форм и сортов сельскохозяйственных культур: люпина желтого, озимого тритикале, голозерного овса, яровой пшеницы, эспарцета песчаного, озимой ржи, трансгенного рапса с геном куриного интерферона. Отмечены основные направления и перспективы дальнейшего развития биотехнологии в селекции растений. Ключевые слова: биотехнология, генетика, селекция, сорт, люпин, рапс, интерферон.
Фото Юрия Иванова
Федор Привалов,
генеральный директор НПЦ НАН Беларуси по земледелию,
Станислав Гордей,
завлабораторией генетики и биотехнологии НПЦ НАН Беларуси по земледелию,
член-корреспондент кандидат биологических наук
О
своение современных ге-нетико-биотехнологи-
ческих методов в селекционной работе - одна из основных составляющих повышения ее результативности. Инновационные проекты направлены в первую очередь на решение проблем, связанных с такими глобальными вызовами, как питание и насыщение аграрного рынка при стремительном росте численности населения планеты.
Генетико-
биотехнологические методы в селекции сельскохозяйственных культур
Анализ мировых тенденций показал, что подавляющее большинство современных сортов и гибридов растений создано с использованием биотехнологии. Обычные методы селекции (внутривидовая гибридизация и отбор) уже не позволяют получать конкурентоспособные сорта. Активно развиваются новые направления биотехнологии, основанные на результатах изучения функционирования генетического аппарата клетки (геномика), внутриклеточных белков (проте-омика), надмолекулярных структур, отдельных клеток, а также нанобиология (нанобиоматериа-лы). В прогрессивных селекционных организациях при выведении новых сортов растений широко применяются именно генетико-биотехнологические методы.
В Беларуси есть все предпосылки и возможности для разработки и освоения новых конкурентоспособных эффективных биотехнологий, не уступающих лучшим зарубежным аналогам. Для селекции новых высокопродуктивных сортов и гибридов сельскохозяйственных культур, устойчивых к стрессовым факторам, болезням и вредителям, актуальны следующие направления и методы:
■ генная инженерия;
■ создание трансгенных растений;
■ ДНК-технологии;
■ отдаленная гибридизация;
■ экспериментальная гаплоидия;
■ культура in vitro органов и тканей;
■ индуцированный мутагенез и рекомбиногенез.
Основными видами сельхозкультур являются пшеница, тритикале, рожь, ячмень, овес, кукуруза, рапс, гречиха, горох. Внимания заслуживает также люпин -один из основных источников белка. Мировой рынок зерна контролируют США, Канада, Австралия, Аргентина и страны ЕС, представленные несколькими крупнейшими транснациональными корпорациями.
В Научно-практическом центре НАН Беларуси по земледелию в течение последних десятилетий существенно расширилось использование генетико-биотех-нологических методов при создании сортов сельскохозяйственных культур в рамках различных программ совместно со многими научными учреждениями. Наиболее значимые результаты получены по ряду заданий Государственной программы «Инновационные биотехнологии». В частности, для люпина, тритикале, овса, пшеницы, ячменя, эспарцета, ржи, рапса.
Люпин желтый (Lupinus luteus)
Дефицит белка, необходимость повышения плодородия почвы биологическим путем, вопрос снижения себестоимости продукции и энергозатрат - все эти факторы обусловили интерес к возрождению высокобелкового средиземноморского желтого люпина. Возделывание этого растения в Беларуси прекратили из-за его массового поражения в 1997-2000 гг. антракнозом [1]. Вызываемый двумя американскими разновидностями патогена (VCG 1, VCG 2), он в считанные дни способен повредить посевы люпина на огромных площадях и представляет собой чрезвычайно опасное заболевание для производителей разных видов этой культуры во многих странах мира: Австралии, Польше, Германии, Чили, ЮАР, России.
Сократить время, необходимое для оценки толерантности люпина к антракнозу, до 5 суток позволяет разработанный в НПЦ по земледелию микробиологический экспресс-метод, включающий три этапа: I - приготовление инокулюма гриба Colletotrichum lupini, II - инфицирование семян люпина, III - проращивание семян и учет степени поражения растений (рис. 1). Таким способом проанализирован ряд генотипов желтого люпина.
Отбор толерантных генотипов люпина из популяций (F2, Fn) и набора образцов путем искусственного
инфицирования семян спорами гриба Colletotrichum lupi
Оздоровление проростков антагонистами Pseudomonas aurantiaca
ВЫРАЩИВАНИЕ ТОЛЕРАНТНЫХ ГЕНОТИПОВ
Рис. 1.
Микробиологический экспресс-метод отбора in vitro толерантных кантракнозу генотипов люпина
Рис. 2.
Желтый люпин Владко: а - бобы, б - семена
В результате проведенных исследований выделен устойчивый к антракнозу образец люпина желтого ЛЛТ-2. За годы изучения (2010-2012) он существенно превысил показатели стандартных сортов (Першацвет, Мир-тан) по сбору белка с урожаем семян (на 2,9 и 3,1 ц/га), объему сухого вещества зеленой массы (на 20,4 и 11,8 ц/га соответственно) и имеет тенденцию к превышению стандартов по урожайности семян. С позиций современной таксономии сортообразец
V ■ "fir -*
V) <<
ЛЛТ-2 относится к новой подраз-новидности разновидности var. leucospermus Kurl. et Stankev.-Flores lutei. Semina albi.
Образец люпина желтого ЛЛТ-2 в 2013 г. был передан в Государственную инспекцию по испытанию и охране сортов растений Министерства сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь (ГСИ) под названием Владко и с 2016 г. включен в Государственный реестр сортов (рис. 2).
Тритикале озимое (Triticosecale)
Тритикале - самая молодая продовольственная и фуражная зерновая культура для Республики Беларусь. Пшеницы Triticum spelta и T. turgidum являются уникальными источниками генов, определяющих кормовые и пищевые достоинства, а также устойчивость к абиотическим факторам и болезням. Спельта, как и тритикале, менее требовательна по сравнению с мягкой пшеницей к комплексу почвенно-климатических условий. Новые формы тритикале с использованием Triticum spelta и T. turgidum позволяют повысить кормовые качества зерна, устойчивость к основным видам заболеваний и стрессовым факторам среды. Создание сортов тритикале проводилось по схеме, представленной на рис. 3. В результате комплексного изучения в течение нескольких лет по морфологическим, хозяйственно полезным признакам полученных генотипов выделен высокопродуктивный образец озимого тритикале, который передан в ГСИ Республики Беларусь под названием Жемчуг.
Овес (Avena sativa)
Генетический потенциал рода Avena позволяет на основе межвидовой гибридизации разработать формы овса с улучшенными кормовыми характеристиками. Голозерные гексаплоидные
образцы имеют высококачественное зерно и маркированы сцепленными генами, детерминирующими морфологические, визуально фиксируемые альтернативные признаки голозерности и многоцветковости, положенные в систематику этого вида. Межвидовая гибридизация с привлечением образцов диплоидного вида Avena strigosa S. и эмбриокульту-ры in vitro для преодоления пост-гамной несовместимости, полиплоидии и экспериментального мутагенеза (УФ-облучение) позволяют создавать продуктивные, гомозиготные, с высоким качеством зерна сортообразцы и сорта голозерного овса кормового [2-5]. A. strigosa - это дикий вид овса, донор генов устойчивости к основным видам грибных заболеваний, к стрессовым факторам среды, низкой пленчатости зерновок.
Предложена и апробирована методика получения новых форм голозерного овса (рис. 4). В ходе исследований с ее использованием получено 90 образцов по 20 межвидовым гибридным комбинациям A. strigosa (2n=14, AsAs) х A. sativa (2n=42, AACCDD). Образец с максимально выраженными хозяйственно полезными признаками передан в ГСИ Республики Беларусь в качестве сорта под названием Королёк.
Пшеница яровая (Triticum aestivum)
Российскими учеными еще в 1986 г. были описаны перспективные формы мягкой пшеницы, характеризующиеся высокими урожайностью и качеством зерна, и указан их сцепленный признак-маркер - фиолетовый цвет зерна [6].
В лаборатории генетики и биотехнологии НПЦ по земледелию на современной научной базе с использованием методов отдаленной гибридизации, индуцированного мутагенеза, рекомбиногенеза и направленного отбора рекомбинантных
высокопродуктивных форм с объединенным комплексом хозяйственно полезных свойств, сцепленных с маркерным признаком фиолетовой окраски зерна, создан сорт кормовой пшеницы Синтез (рис. 5), проходящий испытание в ГСИ Республики Беларусь.
Эспарцет
(Onobrychis arenaria)
Нерайонированные сорта эспарцета закавказского и песчаного в почвенно-климатических условиях Беларуси не обеспечивают тот уровень продуктивности, который показывают в местах, для которых они разрабатывались [7]. Поэтому главной нашей задачей было получение своих образцов. В ходе исследований выполнено расщепление сортов-популяций различных видов эспарцета, отбор биотипов с нужными свойствами и объединение их в одном генотипе на основе межвидовой гибридизации с использованием современных биотехнологических методов, включая культуру in vitro. Лучшие из 86 отобранных перспективных генотипов помещались в искусственную почву для адаптации в течение 30-40 дней, затем пересаживались для выращивания в полевом севообороте. В результате выявлены оптимальные солевые, витаминные и гормональные составляющие питательных сред, необходимые для успешного развития эксплантов и регенерантов. Также установлена генспецифичность каллу-сообразования и интенсивности процессов регенерации в зависимости от вида и сорта эспарцета.
Выделено 3 высокопродуктивных генотипа эспарцета песчаного, один из которых передан в ГСИ в качестве сорта под названием Караневичский (рис. 6).
Рожь (Secale cereale)
Использование эффекта гетерозиса у ржи - наиболее перспективное направление дальнейшего повышения потенциала
T. spelta (2n=42, AABBDD)
I
н
F1 TRITICALE (2n=42, AABBRR)
T. turgidum (2n=28, AABB)
Зимостойкость, белок, иммунитет, аминокислоты
;ислоты
Н
F1 эмбриокультура in vitro
белок, иммунитет
F2-F3
СП-2 308 образцов
урожайность, зимостойкость, белок, иммунитет
КП, ПСИ 16 образцов
урожайности этой культуры. На основе цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС) создается соответствующая генетическая система, состоящая из стерильного аналога материнского компонента скрещивания, закрепителя стерильности (для поддержания и размножения стерильного аналога), восстановителя фертильности - отцовского компонента (рис. 7).
Основная проблема при получении гибридных сортов ржи -дефицит эффективных восстановителей фертильности, поскольку частота необходимых для этого генов в популяциях ржи ниже 5% [8, 9]. Неполное возобновление ЦМС приводит к уменьшению количества жизнеспособной пыльцы, что в свою очередь благоприятствует заражению спорыньей (Claviceps purpurea). Данная инфекция загрязняет ржаные зерна склероциями, содержащими токсичные алкалоиды [10]. Относительно недавно новые источники генов-восстановителей были описаны в примитивной популяции иранской ржи (IRAN IX). Они обладают значительно более высокими показателями, чем европейские линии, и средовой стабильностью.
Сотрудники Института генетики и цитологии и Научно-практического центра по земледелию в результате совместных исследований разработали технологию ДНК-типирования
генов - восстановителей фертильности у озимой диплоидной ржи с индексом 83-94%.
Рапс (Brassica napus) ChIFN-a
Одним из направлений развития биотехнологии является так называемое «молекулярное производство». Его принципиальное отличие - получение и использование трансгенных растений в качестве биореакторов, продуцирующих ценные для различных отраслей хозяйства органические соединения, в том числе лекарственные. Такой подход полностью меняет устоявшиеся представления об организации биотехнологических производств. Так, в случае применения
Рис. 3.
Схема создания озимого кормового тритикале
Рис. 4.
Схема создания новых форм голозерного овса
Avena strigosa (2n=14, AsAs)
Avena sativa (2n=42, AACCDD)
Гибридные зерновки Fi (2n=28, AsACD)
Эмбриокультуры in vitro
Колхицинирование
Регенеранты Fi (2n=28-56, AsACD - AsAAsACCDD)
УФ-облучение + сенсибилизация
Стабилизация генома гибридов-муторекомбинантов F2-F4 (2n=42, AsACCDD)
2
5
Рис. 5. Семена
яровой пшеницы с фиолетовой окраской
Рис. 6.
Сорт эспарцета песчаного Караневичский: а - растение, б - семена, в - корневая система)
Рис. 7.
Родительские компоненты гетерозисного гибрида Fi ржи: а - мужски стерильная форма, б - закрепитель стерильности, в- восстановитель фертильности
Рис. 8.
Визуализация результатов иммуноблоттинга с использованием системы
«Bio-Rad VersaDoc»
Дорожка 1:
отрицательный контроль (листья рапса, не трансформированные плазмидой с геном куриного ИФН);
дорожки 2-5:
образцы листьев рапса №19-22; дорожка 6: положительный контроль (очищенный куриный ИФН)
Куриный ИФН
а
1 2 3 4 5 6
в качестве продуцента конкретного вещества растительных организмов ферментационные процессы, требующие огромных затрат на строительство, оборудование и функционирование биотехнологического предприятия, заменяются на агротехнические мероприятия, заключающиеся в выращивании растений-продуцентов.
Существенное преимущество культур со стабильным встраиванием в ядерный геном (трансгенных) - возможность получения их в больших объемах. В некоторых случаях при достаточно высокой биологической активности целевого белка растительные ткани можно использовать без его выделения. Например, растения, синтезирующие интерферон, перспективны для ветеринарии в виде лечебно-профилактической кормовой добавки.
Группой ученых из Научно-практического центра по земледелию, БГУ и Института биофизики и клеточной инженерии проведена агробактериаль-ная трансформация растений рапса с использованием генетических конструкций для синтеза куриного альфа-интерферона (ChIFN-а) - гликопротеина с мощным противовирусным действием. Он эффективен в борьбе с вирусами: птичьего гриппа, псевдочумы птиц, инфекционного бурсита, инфекционного бронхита птиц, болезни Марека, саркомы Рауса и др. Для масштабного получения препаратов интерферо-нов перспективно использование растений в качестве «биофабрик».
В ходе совместных исследований (с применением супервирулентных модифицированных штаммов агробактерий и физиологически активных веществ) был клонирован ген куриного интерферона в бактериальных векторах и определены особенности его структурной организации; создана экспрессируемая в E. coli конструкция и в модельных
экспериментах дана оценка эффективности орального применения внутриклеточного интерферона для птицы; ген куриного интерферона встроен в экспрессирующие агробакте-риальные векторы; конструкция введена в клетки растения; растения регенерированы; выполнен отбор и анализ наличия гена интерферона в образцах рапса.
В итоге получено 288 трансгенных форм рапса. Достигнутая средняя эффективность трансформации (9,3%) превосходит мировые аналоги (для данного метода средняя частота встроек составляет 3,3-5%).
Отбор генотипов с экспрес-сируемым геном куриного интерферона проводили по данным ПЦР-анализов, а также на основе результатов иммуноблоттин-га, который обладает на несколько порядков более высокой чувствительностью (рис. 8).
Из рисунка видно, что в образцах листьев рапса клонов №19-22 обнаруживается специфический сигнал, свидетельствующий о наличии куриного альфа-интерферона.
Созданы 3 высокопродуктивные линии ярового рапса, стабильно наследующие экспресси-руемый ген куриного а-интерфе-рона. Самая продуктивная линия с наибольшей экспрессией этого гена зарегистрирована в международной базе данных Центра управления Механизма посредничества по биобезопасности (МПБ) в рамках присоединения к Картахенскому протоколу [11].
Планируется увеличить синтез СШБЫ-а в растениях рапса с использованием трансформации хлоропластов, имеющих свою ДНК и исчисляемых в клетках сотнями.
Результаты работы научных и учебных учреждений по использованию генетико-биотех-нологических методов в селекции новых сортов и гибридов сельскохозяйственных растений
16
(не только описанных в статье, но и таких, как ячмень, пайза, капуста белокачанная, томаты, картофель, лен, соя и др.) говорят о большой перспективности продолжения исследований. СИ
Summary
In the article the results of genetic and biotechnological methods use in the development of new forms and cultivars of agricultural crops are stated: lupine yellow, winter triticale, oat, spring wheat, sandy sainfoin, winter rye, transgenic rapeseed with gene of chicken interferon. The basic directions and prospects of the further development of biotechnology in plant breeding are noted.
ff See: http://innosfera.by/2016/06/ Genetic-biotechnological_methods
Литература
1. Купцов Н.С., Такунов И.П.Люпин - генетика, селекция, гетерогенные посевы.-Брянск; Клинцы, 2006.
2. Шишлов М.П. и др. Роль современных селекционных и генетико-биотехнологическихметодов в создании исходного материала и сортов овса и ячменя // Материалы Междунар. науч.- практ. конф. «Принципы и методы оптимизации селекционного процесса сельскохозяйственных растений, 14-15 июля 2005, Жодино. С. 107-114.
3. Шишлова А.М. Преодоление постгамной несовместимости при межвидовых гетероплоидных (2х х 6х) скрещиваниях овса / А.М. Шишлова, И.А. Гордей, М.П. Шишлов // Генетика. Т. 29, №1. 1993. С. 91-98.
4. Шишлова А.М., Шишлов М.П. Создание новых форм голозерного овса на основе гетероплоидных (2х х 6х) скрещиваний // Материалы 8-й Междунар. науч.- практ. конф. Белорусского общества генетиков и селекционеров.-Мн., 2002. С. 185-187.
5. Шишлова А.М. Эффективность использования эмбрио-культуры in vitro при создании межвидовых гибридов овса / А.М. Шишлова и др. // Сельскохозяйственная биотехнология. II Международная научно-практическая конференция. Горки, 3-6 декабря 2001 г.- Горки, 2002. С. 323-325.
6. Зыкин В.А., Белан И.А., Козлова Г.Я., Колмаков Ю.В. Прогресс и регресс в селекции яровой мягкой пшеницы в условиях Западной Сибири // Селекция сельскохозяйственных культур. Омск, 1987. С. 56-61.
7. Чекель, Е.И. Эспарцет: особенности возделывания / Е.И. Чекель, С.В. Абраскова, В.В. Крицкая // Современные ресурсосберегающие технологии производства растениеводческой продукции в Беларуси: сб. науч. материалов, 2-е изд., доп. и перераб. / Науч.- практ. центр НАН Беларуси по земледелию.- Мн., 2007. С. 258-264.
8. Geiger, H.H. Hybrid rye and Heterosis / H.H. Geiger, Т. Miedaner // Genetics and Exploitation of Heterosis in Crops.- Madison, Wisconsin, USA, 1999. Р.439-450.
9. Geiger, H.H. Cytoplasmic male sterility in rye (Secale cereale L.) / H.H. Geiger, F.W. Schnell // Crop. Sci.- 1970. Vol. 10. P. 56-60.
10. УрбанЭ.П.Использование ЦМС Р-и G-типов в селекции и семеноводстве гетерозисных гибридов F1 озимой ржи (Secale cereale L.) / Урбан Э.П., Гордей С.И. // Земледелие и селекция в Беларуси. 2013. №49. С. 349-358.
11. http://bch.cbd.int/managementcentre/
Наталья Кухарчик,
руководитель отдела биотехнологии Института плодоводства НПЦ НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовоще-водству,
доктор сельскохозяйственных наук, доцент
Биотехнологии
в плодоводстве Беларуси
Основные биотехнологические исследования в области плодоводства сосредоточены в нескольких научных организациях Национальной академии наук Беларуси. Темы Института плодоводства - оздоровление и размножение in vitro, создание свободных от вирусов (virus free) коллекций плодовых и ягодных культур, диагностика и молекулярная характеристика системных патогенов (вирусы, фитоплазмы), эмбриокульту-ра в селекции ранних сортов и получении межвидовых гибридов косточковых культур. Институт генетики и цитологии занимается паспортизацией сортов, выделением маркеров устойчивости к болезням. В Центральном ботаническом саду ведутся работы по размножению брусничных; на Гомельской и Брестской областных сельскохозяйственных опытных станциях (ОСХОС),
в Гродненском зональном институте растениеводства, а также в Белорусской государственной сельскохозяйственной академии - по размножению плодовых и ягодных культур, созданию оздоровленных коллекций.
Биотехнологические исследования в области культуры тканей и органов in vitro весьма перспективны и являются частью большого перечня технологических операций в сельском хозяйстве. В плодоводстве эта методика используется:
■ при освобождении от системных патогенов (вирусов, фито-плазм, бактерий), как отдельно, так и в комплексе с хемо- и термотерапией in vitro;
■ депонировании генотипов при нормальной и минимальной вегетации, создании коллекций сортов, форм и гибридов;
■ массовом размножении посадочного материала;
■ регенерации растений после криоконсервации;
■ ускоренном размножении единичных экземпляров хозяйственно полезных генотипов;
■ обмене растительным материалом с минимальными затратами на подтверждение карантинного соответствия.
Оздоровление плодовых и ягодных растений in vitro
В течение 1998-2015 гг. в отделе биотехнологии Института плодоводства изучалась
