CC BY
61
УДК618.36 - 06 : 616.155.194] - 056.7 - 07 - 08
Запорожан В.М., Анчева I.A., Микитенко Д.О., Евдокимова В.В. ГЕНЕТИЧНА ДЕТЕРМ1НАЦ1Я АНГ1ОГЕНЕЗУ ПРИ ФОРМУВАНН1 ДЕЦИДУАЛЬНО1 ТКАНИНИ У ВАГ1ТНИХ 13 ЗАЛ1ЗОДЕФ1ЦИТНОЮ АНЕМ16Ю
Одеський нацiональний медичний уыверситет Кл^ка репродуктивноТ медицини «Нaдiя», м. Кшв Вiйськово-медичний клiнiчний центр пiвденного регюну, м. Одеса
Метою досл'дження була оцнка експрес'й гену VEGFA у плацентарнш тканин ж/'нок, що страждали протягом ваг'тност'! на залiзодефiцитну анемiю. Дослiдження проведене на базi пологового будинку №2 (м. Одеса) протягом 2012-2013 рр. Обстежено 100 породль, були видлен наступн клiнiчнi групи: I група - плаценти в'д жiнок з фiзiологiчним перебгом ваг'тност'! та пологiв (n=20); II група - плаценти в'д жiнок з анем'ею вагтних в анамнезi (n=40); III група - плаценти вiд жнок з дисфункцею плаценти i анем'ею в анамнезi (n=40). Показано, що хронiчна гiпоксiя, яка виникае при зал1'зодеф1'цитн1'й анеми, негативно впливае на процеси формування децидуальноТ тканини. Доведено, що експреся гену VEGFA зростае у вагтних з проявами зал'зодеф'цитноТанеми у 5,1-10,8 раз'т. Ц змни ведуть до нерiвномiрного збльшення iнтенсивностi експресй' блку VeGfa в стiнцi судин термiнальних ворсин i клтинах периферичного цитотрофобласта.
Kлючовi слова: зaлiзодефiцитнa aнемiя, дисфунк^я плаценти, ангюгенез.
Виконане дослiдження е фрагментом науково-дослiдноi' роботи Одеського нацонального медичного унiверситету МОЗ УкраТни "Молекулярно-генетичнi та екологозалежнi механiзми розвитку пухлин репродуктивноТ системи: шляхи удосконалення дiагностики, лкування i профлактики" (№ держреестрацп 0102U006588).
Ваптнють - фiзiологiчний процес, пщ час якого дшть особл^ мехаызми, як регулюють взаемовщносини мiж алогенними оргашзмами. Основы поди, що визначають процеси формування i росту плаценти, а також виконання ТТ бар'ерноТ i трофiчноТ функцш вщбуваються в зон подту кровотоку мaтерi та плоду - в децидуальноТ оболонц плаценти [5, 7]. Як показують числены дослщження, порушення процеав активаци i диференцшвання кл^ин при формуванн децидуальноТ тканини сприяе розвитку акушерськоТ та перинатально!' патологи [5, 6].
Загалом, у формуванн хорюна можна розрiзнити три перiоди: предворсинчатий (7-8-й день розвитку), перюд утворення ворсин (13-50-й день) та утворення котиледошв (50-90-й день). У сформованш до 140-го дня ваптносп плацент мiститься 10 - 12 великих, 40-50 дрiбних i 140-150 рудиментарних котиледошв. З встановленням плодово-плацентарного i матково-плацентарного кровооб^у, тобто до кшця I триместру вaгiтностi, завершуеться перюд плацентаци. Слiд мати на уваз^ що до цього моменту вже сформовав основнi структурнi елементи плаценти, але в морфофункцюнальному вiдношеннi вона ще залишаеться незрiлою [4, 6]. Перетинки (септи) добре пом^ы починаючи з 12 тижня ваптностк З Тх розвитком (на 15-16 тижн вaгiтностi) плацента досягае остаточноТ товщини (1,5 - 2 см). З цього моменту збтьшення ТТ маси вiдбувaеться головним чином за рахунок процесу ппертрофп, а не пперплазп [4].
При хронiчнiй гiпоксiТ, причиною якоТ у вaгiтних нерiдко е зaлiзодефiцитнa aнемiя, ризик порушення процесу плацентаци значно зростае [1-3]. Вщповщно виникають передумови для розвитку дисфункцп плаценти у подaльшi термiни ваптностк
При дефiцитi зaлiзa у ваптних виникае не тiльки зaлiзодефiцитнa aнемiя, а й iншi порушення. Так, внаслщок зниження синтезу мiоглобiну розвиваеться швидка стомлювaнiсть, слaбкiсть, можлива втрата апетиту, задишка i набряки, через порушення активност мiелопероксидaзи лейкоцитiв виникають порушення iмунiтету. При вaжкiй анеми порушуеться основна функцiя еритроцитiв - доставка кисню до тканин оргашзму i виникають при aнемiТ патолопчы змiни пов'язaнi перш за все з ппошею [1, 2]. Одним з таких ускладнень е дисфунк^я плаценти [3, 5, 6]. Дисфунк^я плаценти виникае в результaтi порушень компенсаторно-пристосовних мехaнiзмiв у плaцентaрнiй системi в поеднaннi iз змiнaми в структурi самоТ плаценти [3-5]. Подiбнi змiни можуть бути обумовленi порушеннями основних функцш плаценти - трофiчноТ або дихальноТ [3, 4]. В™, досi невiдомо як саме змшюеться експресiя генiв, якi визначають активнють процесiв неоaнгiогенезу при формувaннi децидуальноТ тканини у жшок, що страждають на зaлiзодефiцитну aнемiю.
Мета дослщження
Оцiнкa експресiТ гену VEGFA у плацентарнш тканин ж1нок, що страждали протягом ваптносп на зaлiзодефiцитну анемю
Матерiал та методи
Дослiдження проведене на бaзi пологового будинку №2 (м. Одеса) протягом 2012-2013 рр. Обстежено 100 породть, вщ яких були одержат зразки плаценти. При цьому були видтеш наступн кл^чы групи:
I група - плаценти вщ ж1нок з фiзiологiчним переб^ом вaгiтностi та пологiв (n=20);
II група - плаценти вщ жшок з анемieю вагiтниx в анамнезi (n=40);
III група - плаценти вщ ж1нок з дисфункцieю плаценти i анемieю в анамнезi (n=40).
Пацieнтки були вiдiбранi залежно вщ показникiв кардiотокографiï, доплерометри' матково-плацентарного кровотоку. Критерiями виключення були: багатоплщдя, прееклампсiя, важка екстрагенiтальна патологiя пацГенток (цукровий дiабет, системнi захворювання серцево-судинноТ, дихальноТ i травноТ системи), природжен i спадковi захворювання плоду.
Дiагностику дисфункцп плаценти проводили на пщставГ клГнГчних спостережень за перебiгом ваптносп, ультразвуковоТ фетоплацентометрп, доплерометри', вивчення гормонально!' функци' плаценти. Визначення гормонГв фетоплацентарного комплексу в сироватцГ кровГ ваптних - естрГолу, прогестерону, плацентарного лактогену, а також специфГчних маркерГв ферокшетичного статусу -феритину та трансферину, проводили Гмуноферментним методом з використанням комерцшних тест-систем (1ФА, DRG, США; 1ФА «Хема», «Алкор-Бю», «Вектор-Бест», Роая). При проведеннГ доплерометри на ультразвуковому апаратГ Toshiba Xaria SSA 660A (Япошя) оцГнювали матково-плацентарний кровоток з використанням ¡мпульсноТ доплерометри i кольорового доплерГвського картування.
ВидГлення РНК проводилось на базГ клГнГки репродуктивноТ медицини «НадГя» зГ зразкГв бГоптату плаценти породть з метою дослГдження експреси генГв VEGFA (OMIM 192240).
Для цього послщовно проводились наступнГ процедури: вщбГр та проведення бГопсГТ плаценти, видтення РНК, проведення зворотноТ транскрипци' та полГмеразноТ ланцюговоТ реакци' (ПЛР) у режимГ реального часу.
Проведення бюпси тканини плаценти об'емом до 1,0 мм3 здшснювалось конхотомом. Фрагменти плаценти вщ часу взяття бюматерГалу до проведення дослГдження зберГгались у 10 ешвалентних об'емах RN Alater ® Solution (Ambion, USA, Cat# AM7024) за температури «-200°С».
ВидГлення РНК проводилося з використанням набору QIAamp RNA Blood Mini Kit (Qiagen, НГмеччина, кат № 52304) у вщповщносп до протоколу виробника для видтення нукпе'шових кислот з фрагментГв тканин. Для цього за рекомендацГею виробника проводились наступнГ дм:
- вщмивання бГоматерГалу вГд RN Alater ® Solution;
- розтирання шматочкГв тканини у рГдкому азотГ;
- гомогенГзацГя розтертих фрагментГв за допомогою центрифужних колонок QIAshredder (Qiagen, НГмеччина) у лГзуючому буферГ;
- преципГтацГя еквГвалентним об'емом 70% етанолу;
- сорбцГя РНК на центрифужних колонках QIAampspincolumn(Qiagen, НГмеччина) з наступною трикратною вГдмивкою та просушкою колонок;
- елюцГя РНК за допомогою втьноТ вГд рибокунлеаз води для молекулярних дослщжень.
Характеристики видтеноТ РНК визначали з використанням Nano Drop 1000 Spectrophotometer
(Thermo Scientific, США) шляхом визначення показниш А260/А280 та А260/А230.
Отримана РНК зберГгалась при температурГ «-20оС» та використовувалась для проведення зворотноТ транскрипци.
Зворотна транскрипцГя проводилась з використанням набору Hight-Capacityc DNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA, Cat# 4368814) вщповщно до рекомендацГй виробника. РеакцГйна сумГш для проведення зворотноТ транскрипци мютила (з розрахунку на 1 зразок): 2 мкл 10хбуферу для зворотноТ транскрипци', 0,8 мкл 25х сумЫ dNTP (по 100 мM кожного), 2 мкл 10х сумГшГ розаяних (випадкових) праймерГв, 1 мкл зворотноТ транскриптази Multi Scribe ™, 4,2 мкл втьноТ вГд нуклеаз води для проведення ПЛР та 10 мкл видтеноТ РНК. Зворотна транскрипцГя проводилася з використанням амплГфГкатору Applied Biosystems® 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems, USA) з наступними температурними умовами: 1. 10'@25C; 2.120'@37C; 3. 5"@85C; 4. 4C@«. Отримана кДНК зберГгалася при температурГ «4-8о С» та використовувалась для оцшки експреси гешв.
ОцГнка експреси генГв проводилась з використанням пресинтезованих Taq Man ® Gene Expression Assay (Applied Biosystems, USA) методом вщносноТ експреси. Використовували тест систему VEGFA (OMIM 192240): Cat# 4453320 - Hs 00900055_m1, а у якост внутрГшнього контролю - GAPDH (OMIM 138400) (Cat# 4331182 - Hs 99999905_m1).
Кожен 20xTaqMan ® Gene Expression Assay мютив два немГчен праймери (при кГнцевому 1х розведенн 900нM на праймер, при 20х стоковГй концентраци 18мкM на праймер) та один 6-FAM™ мГчений Taq Man ® MGB зонд (при кГнцевому 1х розведеннГ 250нM, при 20х стоковГй концентраци' 5мкM).
РеакцГйна сумГш мГстила: 1.0 мкл 20xTaqMan ® Gene Expression Assay, 10 мкл 10xTaqMan ® Gene Expression Master Mix, 6 мкл втьноТ вщ рибонуклеаз води для ПЛР та 3 мкл кДНК, отриманоТ на попередньому етапк АмплГфГкацГя та детекцГя проводилася за використання ПЛР-системи у реальному час 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США, кат. № 4351105) з програмним забезпеченням SDS 2,0,5 з наступними температурними умовами: 1. 2'@50C; 2. 10'@95C; 3. 60x (15"@95C, 1'@60C). Зчитування даних проводилось приладом на останньому етап кожного циклу. АналГз результатГв проводився у ручному режимГ за методом за AACt (дельта-дельта Ct).
Фенотип дослГджували шляхом оцшки рГвня експреси VEGF непрямим стрептавидш-пероксидазним методом. ПГсля депарафшГзаци' шматочкГв тканини на скло блокували ендогенну
пероксидази 3% розчином пероксиду водню, обробка предметного скла водою, блокування неспец^чних протеТ'нових сполук двома краплями 1% BSA, промивка в PBS-буферi нанесення первинних антитт до антигену VEGF №рма DAKO, Даыя) на одну годину. В подальшому промивають реакцшне середовище в PBS - буферi i наносять вториннi антитiла, пюля чого знову промивають пробу в PBS-буфер^ з нанесенням двох крапель комплексу стрептавщин -пероксидази та подальшою iнкубацieю на протязi 30 хв. Надалi здiйснюeться промивка i нанесення АЕС - хромоген - розчину з шкуба^ею вiд 5 до 20 хвилин, до появи коричневого забарвлення;
Статистична обробка проводилася загальноприйнятими методами варiацшноТ статистики за допомогою програмного забезпечення Statistica 10.0 (Stat Softlnc., США).
Результати дослщження
Клiнiчна картина у групах дослщження була стереотипною. Середнш вiк па^енток I, II та Ill групи склав 28,2±4,5, 31,2±6,8 й 27,2±1,8 рокiв вiдповiдно (р>0,05).У бiльшостi випадюв вагiтнiсть була першою, а перинатальн результати - цiлком задовiльними. Методом вибору анестезп у пологах була перидуральна анестезiя, яка прискорюе дилатацш шийки матки, дозволяе ефективно знеболити пологи та зменшити рiвень психоемоцшно'Т напруги, не впливаючи значущо на матково-плацентарний кровоток.
У па^енток II групи визначалися ктычно манiфестованi ознаки залiзодефiциту (залiзо сироватки кровi - 11,32±0,44 мкмоль/л, феритин - 11,92±1,57 нг/мл). У вагiтних III групи ваптнють перебiгала з дисфункцiею плаценти I-IIA ступеня, при чому у 8 (20,0%) па^енток гестацiйний перiод ускладнився маловоддям, у 3 (7,5%) - низькою плацента^ею, а у 9 (22,5%) породть виник дистрес плоду у I пер^ пологiв, який був показанням до оперативного розродження.
При аналiзi експресп генуVEGFA були визначен певнi вiдмiнностi мiж групами (рис. 1) у виглядi суттевого зростання показника у II та III ктычнш груш.
Достовiрне перевищення величини цтьового сигналу вiд амплкону над фоновою флуоресценцiею i шумами (рис. 2) дозволяе за графками наростання флуоресценцiТ, отриманим пiсля вирахування фону i згладжування, встановити деяке порогове значення флуоресценци (RT), однакове для вах спiльно аналiзованих проб. Коректне встановлення RT (вище порога детекци, але в межах log-фази) здшснюеться вручну або за допомогою програми амплiфiкатора (рис. 2).
Рис. 1 Експреая гену VEGFA у плацентарн1й тканин1.
Якщо для дослщжуваних проб визначити значення порогового циклу (Ct - вщ англ. Thresholdcycle - число раундiв амплiфiкацiТ, необхщне для досягнення порогового значення), то для будь-якого дослщжуваного зразка k при пороговому значеннi RT вiрна формула: RT = A x X0k x (1 + Ek) Ctk, де А - константа (коефiцiент пропорцiйностi).
З наведено' формули можна дшти висновку, що чим менша стартова кiлькiсть копiй ДНК-мшеы (X0), тим бiльше число ци^в амплiфiкацiТ (Ct) необхiдно для досягнення порогового значення. Характеристики приладiв, як найбiльш широко використовуються в кл^чнш дiагностицi для Real-TimePCR, таю, що для детекци поодиноких копш ДНК-мшеы в дослiджуванiй пробi потрiбно 35-37 циклiв амплiфiкацiТ.
Слiд зазначити, що зростання експресп гену VEGFA яке спостер^алося у ваптних II та III кшычноТ' групи цтком узгоджуеться з результатами iмуногiстохiмiчного дослщження. Так, у ваптних iз залiзодефiцитною анемiею спостерiгалося нерiвномiрне збiльшення штенсивносл експресiТ бiлку VEGFA в стшц судин термiнальних ворсин i кл^инах периферичного цитотрофобласта.
Рис. 2 Графк наростання флуоресценцп при дослiдженнi експресп гену VEGFA у вагтноТi3 залiзодефiциmною анемieю.
Таким чином, хрошчна ппошя, що виникае при залiзодефiцитнiй анеми, негативно впливае на процеси формування децидуальноТ тканини. Зниження штенсивносп ангюгенезу гтчастого типу може стати причиною вираженого дефщиту капiлярiв ворсин та, зрештою, до дисфункцп плаценти, обумовленоТ недостатнiм розвитком судинноТ мережi плаценти.
Висновки
1. Експреая гену VEGFA зростае у ваптних з проявами залiзодефiцитноТ анемiТ у 5,1-10,8 разiв
2. Змши експресп гену VEGFA ведуть до нерiвномiрного збiльшення iнтенсивностi експресп бтка VEGFA в стiнцi судин термшальних ворсин i клiтинах периферичного цитотрофобласта.
Перспективи подальших дослiджень можуть бути пов'язанi iз дослiдженням цитокшового профiлю при вагiтностi, ускладненiй дисфунк^ею плаценти на тлi залiзодефiцитноТ анемп.
Лiтература
1. Анчева I.A. Клтчна епiдемiологiя анеми вагiтностi на швдш УкраТни: ретроспективне дослщження / I.A. Анчева // Вюник проблем eicncriV i медицини. - 2013. - Т. 2, № 3. - С. 112-114.
2. Малкоч А.В. Железодефицитные состояния и железодефицитная анемия у женщин детородного возраста. / А.В. Малкоч, Л.А. Анастасевич, Н.Н. Филатова // Лечащийврач. - 2013. - № 4. - С. 37.
3. Серов В.Н. Железодефицитнаяанемия в гинекологическойпрактике: основныепринципылечения / В.Н. Серов, Н.В. Дубровина, А.А. Балушкина // Русскиймедицинский журнал. - 2011. - Т. 19, № 1. - С. 1-4.
4. Семенова М.В. Состояние плаценты при железодефицитной анемии у беременных / М.В. Семенова, Е.Л. Баженов, Н.М. Канунникова [и др.] // Морфологические ведомости. - 2007. - Т. 1, № 1-2. - С. 218-219.
5. Blackburn S. Maternal, Fetal, &NeonatalPhysiology / S. BlackburnPhD RN C N.Y. Saunders, 4 edition, 2012. - 768 р.
6. Chen C.P. Human placental multipotent mesenchymal stromalcells modulate trophoblas tmigration via Rap 1 activation / C.P. Chen, J.P. Huang, T.Y. Chu [et al.] // Placenta. - 2013. - Vol. 8 (11). - P. 532-541
7. Salomon C. Hypoxia-induced changes in the bioactivity of cytotrophoblast-derived exosomes / C. Salomon, M. Kobayashi, K. Ashman [et al.] // PLoS One. - 2013. - Vol. 8 (11). - P. 79-83.
Реферат
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДЕТЕРМИНАЦИЯ АНГИОГЕНЕЗА ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ДЕЦИДУАЛЬНОЙ ТКАНИ У БЕРЕМЕННЫХ С ЖЕЛЕЗОДЕФИЦИТНОЙ АНЕМИЕЙ
Запорожан В.М., Анчева И.А., Микитенко Д.О., Евдокимова В.В.
Ключевые слова: железодефицитная анемия, дисфункция плаценты, ангиогенез.
Целью исследования была оценка экспрессии гена VBGFA в плацентарной ткани женщин, страдавших на протяжении беременности железодефицитной анемией. Обследовано100 рожениц, были выделены следующие клинические группы: I группа -плаценты от женщин с физиологическим течением беременности и родов (n =20); II группа - плаценты от женщин с анемией беременных в анамнезе (n =40); III группа - плаценты от женщин с дисфункцией плаценты и анемией в анамнезе (n =40). Показано, что хроническая гипоксия, возникающая при железодефицитной анемии, негативно влияет на процессы формирования децидуальной ткани. Доказано, что экспрессия гена VEGF Арастету беременных с проявлениями железодефицитной анемии в 5,1-10,8 раз. Эти
изменения ведут к неравномерному увеличению интенсивности экспрессии белка VEGF в стенке сосудов терминальных ворсин и клетках периферического цитотрофо-бласта.
Summary
GENETIC DETERMINATION OF ANGIOGENESIS DURING DECIDUAL TISSUE FORMATION IN PREGNANT WOMEN WITH IRON DEFICIENCY ANEMIA
Zaporozhan V.M., Ancheva I.A., Mykytenko D.O., Yevdokimova V.V. Keywords: iron deficiency anemia, placental dysfunction, angiogenesis.
The aim of this study was to evaluate the expression of the VEGFA gene in placental tissue of women who suffered from iron deficiency anemia during pregnancy. 100 pregnant women passed through the clinical examination were divided into three clinical groups: I group included placentae taken from women with physiological pregnancy and childbirth (n = 20); II group included placentae of pregnant women with a history of anemia (n = 40); III group included placentae from women with placental dysfunction and a history of anemia (n = 40). It has been shown that chronic hypoxia that occurs in iron deficiency, affects the processes of formation of decidual tissue. It has been proved that the expression of the VEGF gene in pregnant women with symptoms of iron deficiency anemia in 5,1-10,8 times higher. These changes lead to an uneven increase in the intensity of VEGF protein expression in the vascular wall cells and terminal villi and cells of peripheral cytotrophoblasts.
