CC BY
28
DOI: 10.17650/2070-9781-2023-24-1-115-129 (cc)
Генетическое и спермиологическое обследование пациентов с 46,ХХ-тестикулярной формой нарушения формирования пола
BY 4.0
М.И. Штаут1, Т.М. Сорокина1, Л.Ф. Курило1, М.В. Андреева1, Н.В. Опарина2, А.В. Поляков1, Н.В. Шилова1, В.Б. Черных1
ФГБНУ«Медико-генетический научный центр им. акад. Н.П. Бочкова»; Россия, 115522 Москва, ул. Москворечье, 1; 2ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского»; Россия, 129110 Москва, ул. Щепкина, 61/2
Контакты: Вячеслав Борисович Черных chernykh@med-gen.ru
Введение. Синдром «46,ХХ-мужчина», или 46,ХХ-тестикулярная форма нарушения формирования пола (НФП), -генетическое заболевание, характеризующееся ХХ-инверсией пола, первичным гипогонадизмом и мужским бесплодием вследствие тяжелого нарушения сперматогенеза. В большинстве случаев причиной ХХ-инверсии пола являются микроструктурные перестройки хромосом с транслокацией гена SRY Y-хромосомы на Х-хромосому или аутосому. Генетическая гетерогенность и фенотипическая вариабельность, в том числе влияние генотипа на спер-миологические показатели, у пациентов с синдромом «46,ХХ-мужчина» недостаточно изучены. Цель исследования - генетическое и спермиологическое обследование пациентов с 46,ХХ-тестикулярной формой НФП.
Материалы и методы. Обследованы 32 пациента с 46,ХХ-тестикулярной формой НФП и 2 мужчины с мозаицизмом 46,ХХ/46,Х^ Выполняли цитогенетическое, молекулярно-генетическое и спермиологическое исследование, которое включало стандартный спермиологический анализ и количественный кариологический анализ незрелых половых клеток из эякулята.
Результаты. Наличие гена SRY обнаружено у 23 (82,1 %) из 28 пациентов, которым выполнено молекулярно-гене-тическое исследование, у 5 пациентов выявлено его отсутствие. По данным стандартного спермиологического исследования у 24 (75 %) из 32 пациентов диагностирована азооспермия, у 8 (25 %) - олигозооспермия тяжелой степени. У 3 пациентов, у которых была первично диагностирована азооспермия, при повторных спермиологических исследованиях с помощью количественного кариологического анализа незрелых половых клеток обнаружена криптозооспермия. Олигозооспермия тяжелой степени и криптозооспермия отмечены как среди SRY-позитивных, так и среди SRY-негативных пациентов.
Заключение. 46,ХХ-тестикулярная форма НФП характеризуется выраженным нарушением сперматогенеза (азооспермией или экстремально тяжелой формой олигозооспермии). Небольшое количество половых клеток, обнару- о женных в эякуляте у некоторых 46,ХХ-мужчин, в том числе SRY-негативных, свидетельствует о частичном сохране- <и
нии сперматогенеза при данных генетических формах мужского бесплодия даже при отсутствии генов Y-хромосомы, генов локуса AZF.
Ключевые слова: нарушение формирования пола, мужское бесплодие, азооспермия, олигозооспермия, сперматогенез, сперматозоиды, незрелые половые клетки, Y-хромосома, ген SRY
га с
£1 О
Для цитирования: Штаут М.И., Сорокина Т.М., Курило Л.Ф. и др. Генетическое и спермиологическое обследование пациентов с 46,ХХ-тестикулярной формой нарушения формирования пола. Андрология и генитальная хирургия 2022;24(1):115-29. Э01: 10.17650/2070-9781-2023-24-1-115-129
и
к
га
Genetic and semen examination of patients with 46,XX testicular disorder of sex development
M.I. Shtaut1, T.M. Sorokina1, L.F. Kurilo1, M.V. Andreeva1, N.V. Oparina2, A.V. Polyakov1, N.V. Shilova1, V.B. Chernykh1
1Research Centre for Medical Genetics; 1 Moskvorechie St., Moscow 115522, Russia;
2M.F. Vladimirsky Moscow Region Scientific Research Clinical Institute; 61/2 Shchepkina St., Moscow 129110, Russia
a о
Contacts: Vyacheslav Borisovich Chernykh chernykh@med-gen.ru
Background. 46,XX male syndrome (XX sex reversal) or 46,XX testicular disorder of sex development (DSD) - a genetic disorder that characterized by primary hypogonadism and male infertility because of severe spermatogenesis defects. 46,XX testicular DSD is resulted from unbalanced microstructural sex chromosome abnormalities, mostly X-Y translocations involving SRY gene. Genetic heterogeneity and phenotypic variability, particularly the effect of the genotype on semen parameters in XX sex reversed patients are not sufficiently studied. Aim. Genetic and semen examination in patients with 46,XX testicular DSD.
Materials and methods. 32 patients with 46,XX testicular DSD and 2 men with mosaicism 46,XX/46,XY were examined. Cytogenetics, molecular genetics and spermatology examination (standard semen analysis and quantitative karyological analysis of immature germ cells) were performed.
Results. The presence of the SRY gene was detected in 23 (82.1 %) of 28 patients who underwent a molecular genetic study, and 5 patients were SRY-negative. Azoospermia and severe oligozoospermia were diagnosed in 24 (75 %) and 8 (25 %) patients, respectively. Quantitative karyological analysis of immature germ cells allowed to reveal cryptozoospermia in 3 patients with initially diagnosed azoospermia (according to a standard semen analysis). Severe oligozoospermia and cryptozoospermia were mentioned both in some of SRY-positive and SRY-negative patients.
Conclusion. 46,XX testicular DSD is characterized by severe degree of spermatogenesis defects (azoospermia and extremely severe oligozoospermia). Small number of germ cells detected in ejaculate in some patients with 46,XX testicular DSD, including SRY-negative individuals, indicates partial preservation of spermatogenesis in the absence of Y chromosome genes.
Keywords: 46,XX testicular disorders of sex development, male infertility, azoospermia, oligozoospermia, spermatogenesis, sperm, immature germ cells, Y chromosome, SRY gene
For citation: Shtaut M.I., Sorokina T.M., Kurilo L.F. et al. Genetic and semen examination of patients with 46,XX testicular disorder of sex development. Andrologiya i genital'naya khirurgiya = Andrology and Genital Surgery 2023;24(1):115-29. (In Russ.). DOI: 10.17650/2070-9781-2023-24-1-115-129
о a
<u
IB
с
'5 o
к .0
к
re
.0
re
a О
Введение
Нарушение фертильности у мужчин в большинстве случаев связано с дефектами сперматогенеза и/или па-тозооспермией. По крайней мере у 20—30 % мужчин с азооспермией и олигозооспермией тяжелой степени обнаруживают генетические причины бесплодия [1]. Среди них отмечают как синдромальные, так и несин-дромальные формы, например синдром Клайнфельтера (кариотип 47,ХХУ и другие варианты), 46 ,ХХ-тестику-лярную форму нарушения формирования пола (НФП), синдром тестикулярного дисгенеза, мозаицизм по половым хромосомам, микроделеции У-хромосомы, роберт-соновские и реципрокные транслокации и другие сбалансированные структурные аномалии хромосом, двустороннюю аплазию семявыносящих протоков, мутации генов, вовлеченных в формирование пола, диф-ференцировку гонад и развитие мужских половых органов, сперматогенез и мейоз [1—3].
ХХ-инверсия пола (точнее, ее полная форма), или синдром «46,ХХ-мужчина», впервые была описана доктором Альбертом де ла Шапелем в 1964 г. [4]. Попу-ляционная частота данной формы НФП составляет 1 случай на 20 тыс. мужчин [5, 6]. Согласно принятому в 2006 г. Консенсусу по нарушениям формирования пола синдром «46,ХХ-мужчина» приято относить к группе 46,ХХ-НФП и называть 46,ХХ-тестикулярной формой НФП [7].
Синдром «46,ХХ-мужчина» — генетическое заболевание, характеризующееся ХХ-инверсией пола, гипер-гонадотропным гипогонадизмом и первичным
мужским бесплодием вследствие тяжелого нарушения сперматогенеза, как правило приводящего к азооспермии, и крайне редко — к олигозооспермии тяжелой степени [5, 6, 8—11]. Причинами данной формы НФП являются несбалансированные микроструктурные аномалии хромосом, в большинстве случаев с наличием гена SRY (sex-determining region of Y, детерминирующий пол регион Y-хромосомы). В 90 % случаев XX-инвер-сия пола вызвана микроструктурной хромосомной перестройкой с транслокацией фрагмента короткого плеча Y-хромосомы (локуса Yp11.3), содержащего ген SRY, на Х-хромосому, реже — на какую-либо из аутосом с потерей или без потери ее материала [11—18]. Наличие гена SRY (ключевого Y-сцепленного гена, контролирующего дифференцировку пола по мужскому типу) даже при отсутствии остального материала Y-хромосомы может приводить к развитию тестикулярной ткани, формированию яичек и маскулинизации половых органов, в результате формируется мужской фенотип при женском наборе половых хромосом (ХХ-инверсия пола) [19].
У пациентов с 46,ХХ-тестикулярной формой НФП имеются некоторые общие клинические признаки (ги-пергонадотропный гипогонадизм, гипоплазия тестикул, первичное бесплодие, связанное с необструктивной азооспермией) с пациентами с синдромом Клайнфельтера, но, в отличие от последних, 46,ХХ-мужчины, как правило, невысокого роста и не имеют евнухоидных пропорций тела [5, 6, 11, 12]. Пациенты с 46,ХХ-тестикулярным НФП имеют мужской фенотип с полной или неполной степенью маскулинизации [6, 20]. У SRY-позитивных па-
циентов с ХХ-инверсией пола чаще отмечают нормальную маскулинизацию, а у SRY-негативных пациентов с ХХ-инверсией пола чаще обнаруживают признаки дефицита внутриутробной маскулинизации (гипоспадию, крипторхизм, двойственное строение половых органов), выраженный первичный гипогонадизм, при этом могут отмечаться как тестикулярная, так и овотестикулярная формы НФП [11, 12, 21]. В последнем случае это обусловлено неполной дифференцировкой гонад по мужскому типу, редко отмечаемой у SRY-позитивных 46,ХХ-мужчин.
Синдром Клайнфельтера и 46,ХХ-тестикулярная форма НФП имеют и некоторое генетическое сходство [22]. Оно обусловлено наличием дополнительной хромосомы Х в кариотипе, поэтому ранее их относили к одной форме хромосомного заболевания, связанного с аномальным набором половых хромосом у мужчин. Однако важным генетическим отличием 46,ХХ-тестикулярной формы НФП является отсутствие у пациентов большинства генов Y-хромосомы, в частности генов локуса AZF (azoospermia factor, фактор азооспермии), играющих существенную роль в сперматогенезе у человека [11—14]. Поэтому при спермиоло-гическом обследовании у большинства 46,ХХ-мужчин диагностируют необструктивную форму азооспермии, крайне редко — олигозооспермию тяжелой степени [23]. У пациентов с ХХ-инверсией пола не обнаруживают нетяжелые формы патозооспермии. В научной литературе не описаны случаи наступления беременности от 46,ХХ-мужчин естественным путем или с помощью экстракорпорального оплодотворения (ЭКО/ICSI), а также возможности получения сперматозоидов с помощью тестикулярной биопсии. У данных пациентов не исследованы возможности сохранения и восстановления сперматогенеза. Генетическая гетерогенность и фе-нотипическая вариабельность у пациентов с ХХ-инвер-сией пола, в том числе влияние генотипа на спермиологические показатели, недостаточно изучены.
Цель исследования — генетическое и спермиологи-ческое обследование пациентов с 46,ХХ-тестикуляр-ной формой НФП.
Материалы и методы
Обследованная выборка пациентов с 46,ХХ-тести-кулярной формой НФП состояла из 32 неродственных русских мужчин, у которых по данным стандартного цитогенетического исследования (СЦИ) была выявлена ХХ-инверсия пола (не обнаружено наличия Y-хромосомы или ее материала в кариотипе). Пациенты обратились для сперматологического и/или ци-тогенетического, либо молекулярно-генетического обследования и медико-генетического консультирования в ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. акад. Н.П. Бочкова». Взрослые пациенты обращались в связи с бесплодием в браке или для репродук-
тологического обследования с уже поставленным диагнозом, подтвержденным результатами цитогенетическо-го обследования, несовершеннолетние — в связи с задержкой пубертата, гипогоногадизмом, подозрением на НФП. Возраст пациентов варьировал от 16 до 52 лет (средний возраст составил 29 ± 8 лет). Дополнительно обследованы 2 мужчины (21 и 36 лет) с мозаицизмом 46,ХХ/46,ХУ, имеющие схожий фенотип с 46,ХХ-тести-кулярной формой НФП. Эти пациенты были описаны отдельно из-за особенностей кариотипа (наличие мо-заицизма по Y-хромосоме).
Стандартное цитогенетическое исследование выполнено на метафазных пластинках хромосом, приготовленных из 72-часовой фитогемагглютинин-стиму-лированной культуры лимфоцитов периферической крови с последующим использованием GTG-окра-шивания хромосом. У 2 пациентов с мозаицизмом 46,ХХ/46,ХУ (табл. 1), описанных дополнительно, мо-заицизм по половым хромосомам выявлен по данным флуоресцентной in situ гибридизации (fluorescent in situ hybridization, FISH) с ДНК-зондами из коммерчески доступных наборов реактивов AneuVysion® Multi-color 5 Probe Panel (Abbott Molecular Vysis Inc., США).
Наличие ДНК-последовательностей, специфичных для Y-хромосомы, детектировали с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с набором праймеров для следующих локусов/регионов Y-хро-мосомы: SRY, ZFY(Yp11.3), AMELY(Yp11.2); sY84, sY86, sY615 (Yq11.21, регион AZFa), sY127, sY134 (Yq11.22, регион AZFb), sY254, sY255 (Yq11.23, регион AZFc). В качестве внутреннего контроля реакции выполняли амплификацию Х-гомологичных последовательностей для локусов ZFX и AMELX. Детально методика моле-кулярно-генетического исследования описана нами ранее [13]. Молекулярно-генетическое обследование проведено у 28 пациентов, а у 4 пациентов не было выполнено в связи с недоступностью биологического материала.
Пациентам выполняли стандартное спермиологи-ческое исследование (ССИ) согласно рекомендациям Руководства по исследованию эякулята Всемирной организации здравоохранения (2010) [24]. У 6 пациентов спермиологическое исследование выполняли неоднократно (от 2 до 12 раз). Сперматологические показатели (объем, pH и вязкость эякулята, концентрация лейкоцитов, концентрация и общее количество сперматозоидов в эякуляте, количество сперматозоидов и незрелых половых клеток (НПК) в осадке эякулята, доля сперматоцитов II и сперматид от всего числа НПК, доля неразошедшихся ядер в половых клетках от общего количества сперматоцитов II и сперматид) представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения, а также минимальных и максимальных значений. У 13 пациентов выполнен количественный кариологичес-кий анализ незрелых половых клеток (ККА НПК)
о а
<и
га с
ъ! О
к .о I-
га
I-
u
к га г .о
га
а О
из осадка эякулята (авторский метод проф. Л.Ф. Курило, патент на изобретение № 2328736/10.07.2008 «Способ цитологической диагностики нарушения сперматогенеза», бюлл. № 19 от 10.07.2008, http:// www.freepatent.ru/patents/2328736), позволяющий не-инвазивно оценивать прохождение различных стадий сперматогенеза. Детально метод ККА НПК описан ранее [25]. У остальных пациентов данный анализ не был выполнен вследствие недоступности биологического материала или недостаточного объема эякулята.
Статистический анализ данных выполнен с использованием программы StatSoft Statistica, версия 8 (Dell Technologies, США).
Исследование одобрено этическим комитетом ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. акад. Н.П. Бочкова». Все пациенты или их родственники (законные представители) дали письменное информирование согласие на участие в данном исследовании.
Результаты
По данным СЦИ кариотип 46,ХХ обнаружен у 29 (90,6 %) из 32 пациентов с ХХ-инверсией пола (см. табл. 1). У одного пациента с ХХ-инверсией пола отмечено носительство робертсоновской транслокации (13;14). Очевидно, что данная хромосомная аномалия не связана с НФП и не оказывает существенного влияния на фенотип. У 2 пациентов обнаружен мозаицизм по Х-хромосоме, в том числе у одного пациента при СЦИ (кариотип 45,Х/46,ХХ), у другого пациента — с помощью FISH-анализа. По результатам FISH-ана-лиза на лимфоцитах периферической крови у последнего выявлен скрытый сложный мозаицизм XSRY/ XSRYX/XSRYXSRYX с наличием 3 клеточных линий, содержащих одну или две SRY-несущих Х-хромосомы в клетке. У 2 пациентов с мозаицизмом по хромосоме ■м Y, обследованных дополнительно к выборке 46,ХХ-° мужчин, выявлен мозаицизм 46,ХХ/46,XY, в том числе £ в одном случае диагностированный по результатам FISH-анализа (см. табл. 1).
Молекулярный анализ последовательностей Y-хро-'С мосомы выполнен у 28 пациентов (см. табл. 1). У пациен-^ тов с ХХ-инверсией пола, которым выполнено моле-к кулярно-генетическое исследование, отсутствовали ¡5 все исследованные маркеры локуса AZF (локус Yq11.2). ¡3 Наличие гена SRYобнаружено у 23 (82,1 %) из 28 па-¡§ циентов, которым выполнено молекулярно-генетиче-^ ское исследование, у 5 пациентов выявлено его отсут-¡5 ствие, т. е. диагностирован SRY-негативный вариант s 46,ХХ-тестикулярной формы НФП. У одного из них s выявлена азооспермия, у трех — олигозооспермия тя-о желой степени с концентрацией сперматозоидов в эякуляте 0,05—0,15 млн/мл. У обоих пациентов с мозаицизмом 46,ХХ/46,XY обнаружено наличие всех исследованных Y-специфичных маркеров, в том числе
короткого (SRY, ZFY) и длинного плеча (локуса AZF) У-хромосомы (см. табл. 1).
По результатам ССИ азооспермия выявлена в 75 % образцов эякулята, олигозооспермия тяжелой степени или криптозооспермия — в 25 % исследованных образцов. Концентрация сперматозоидов у пациентов с олигозооспермией составляла от 0,05 до 0,15 млн/мл (см. табл. 1).
Объем эякулята у пациентов с 46,ХХ-тестикуляр-ной формой НФП варьировал от 0,1 до 5,1 мл, в среднем составляя 2,2 ± 1,2 мл (табл. 2). Олигоспермия отмечена в 11 (31,4 %) из 35 образцов эякулята, при этом объем эякулята в случаях с олигоспермией составлял от 0,1 до 1,3 мл. Среднее значение показателя рН эякулята равнялось 7,7 ± 0,5 ед., вязкости эякулята — 19,6 ± 15,2 мм (см. табл. 2). Лейкоспермия не была обнаружена ни в одном из исследованных образцов эякулята.
У 13 пациентов с 46,ХХ-тестикулярной формой НФП дополнительно к ССИ проведен ККА НПК из осадка эякулята (табл. 3). Из них у 6 пациентов по данным ССИ диагностированы олигозооспермия тяжелой степени или криптозооспермия, у 7 пациентов — азооспермия. У 3 из 7 пациентов с азооспермией (диагностированной по результатам ССИ) при проведении ККА НПК выявлена криптозооспермия. Сперматозоиды обнаружены в 14 из 18 образцов эякулята, исследованных с помощью ККА НПК, в том числе в 8 (67 %) из 12 образцов с азооспермией по данным ССИ. Выполнение комплексного спермиологического исследования (ССИ и ККА НПК) позволило обнаружить сперматозоиды в исследованных образцах эякулята у 9 из 13 пациентов, в том числе в 43 % образцов эякулята с диагнозом «азооспермия» по данным ССИ. Общее количество обнаруженных в осадке эякулята НПК в образцах существенно варьировало: от их полного отсутствия до нескольких сотен клеток, при этом обнаруженные НПК были представлены сперматоцита-ми II порядка и сперматидами разных стадий развития (см. табл. 3).
Все сперматозоиды, обнаруженные в осадке эякулята (как с помощью ССИ, так и ККА НПК), имели неспецифические структурные аномалии (дефекты головки, акросомы, жгутика), т. е. являлись морфологически атипичными. Количество неразошедшихся ядер сперматоцитов II и сперматид составило 23,4 ± ± 17,9 % (условный контроль - 22,98 ± 2,65 % [17]). Таким образом, у 21 пациента с 46,ХХ-тестикулярной формой НФП диагностирована азооспермия, у 11 пациентов - олигозооспермия тяжелой степени или криптозооспермия. В этих группах пациентов проведен сравнительный анализ данных обследования (табл. 4).
Возраст пациентов с 46,ХХ-инверсией пола, у которых были диагностированы азооспермия и олигозоо-спермия или криптозооспермия, существенно
1
Таблица 1. Результаты генетического и спермиологического обследования 32 пациентов с 46,ХХ-тестикулярной формой нарушения формирования пола и 2 мужчин с мозаицизмом 46,XX/46,XY
Table 1. Results of genetic and semen analysis in 32 patients with 46,XX testicular disorder of sex development and two male patients with 46,XX/46,XYmosaicism
Код пациента
Age, year
Кариотип
Karyotype
SRY
Сперматологический диагноз
Spermatological diagnosis
Концентрация спер-оидов, млн/мл
1 28 46,ХХ + Олигозооспермия тяжелой степени Severe oligozoospermia 0,05
2 25 46,ХХ + Азооспермия Azoospermia 0
3 35 46,ХХ + Азооспермия Azoospermia 0
4 23 46,ХХ н. и. n. t. Азооспермия Azoospermia 0
5 25 46,ХХ + Азооспермия Azoospermia 0
6 23 46,ХХ + Азооспермия Azoospermia 0
7 24 46,ХХ - Олигозооспермия Oligozoospermia 0,15
8 27 46,ХХ + Азооспермия Azoospermia 0
9 27 45,XX,der(13;14)(q10;q10) + Азооспермия Azoospermia 0
10 24 46,ХХ н. и. n. t. Азооспермия Azoospermia 0
11 27 46,ХХ + Олигозооспермия тяжелой степени Severe oligozoospermia 0,05
12 33 46,ХХ + Азооспермия Azoospermia 0
13 24 46,ХХ - Азооспермия Azoospermia 0
14 17 46,ХХ - Азооспермия Azoospermia 0
15 16 46,ХХ + Азооспермия Azoospermia 0
16 28 46,ХХ - Олигозооспермия тяжелой степени Severe oligozoospermia 0,05
17 36 46,ХХ + Азооспермия, криптозооспермия Azoospermia, cryptozoospermia 0
18 28 46,ХХ + Азооспермия, криптозооспермия Azoospermia, cryptozoospermia 0
19 25 46,ХХ + Азооспермия Azoospermia 0
о а
<и
га с
ъ! О
к .о I-
га
I-
u
к га г .о
га
a О
1
Окончание табл. 1 End of table 1
о а
<u
га с
'5 i-
o
к .0
к
re
I .0
re
а О
Код па-
Кариотип
Karyotype
SRY
Сперматологический диагноз
Spermatological diagnosis
Концентрация спер-эидов, млн/мл
матоз Sperm concentration, million/ml
20 52 46,ХХ + Олигозооспермия тяжелой степени Severe oligozoospermia 0,05
21 16 46,ХХ + Олигозооспермия тяжелой степени Severe oligozoospermia 0,05
22 36 46,ХХ + Азооспермия, криптозооспермия Azoospermia, cryptozoospermia 0
23 40 46,ХХ н. и. n. t. Азооспермия Azoospermia 0
24 32 46,ХХ - Олигозооспермия тяжелой степени Severe oligozoospermia 0,1
25 36 46,ХХ (45,Х/46,ХХ/47,ХХХ)* + Олигозооспермия Oligozoospermia 0,15
26 36 45,Х/46,ХХ + Азооспермия Azoospermia 0
27 35 46,ХХ + Азооспермия Azoospermia 0
28 26 46,ХХ + Азооспермия Azoospermia 0
29 29 46,ХХ + Азооспермия Azoospermia 0
30 30 46,ХХ + Азооспермия Azoospermia 0
31 29 46,ХХ н. и. n. t. Азооспермия Azoospermia 0
32 36 46,ХХ + Азооспермия Azoospermia 0
33 21 mos 46,XX[24]/46,XY[6] + Олигозооспермия тяжелой степени Severe oligozoospermia 0,15
34 36 mos 46,XY[190]/46,XX[10]** + Олигозооспермия тяжелой степени Severe oligozoospermia 0,1
*По результатам флуоресцентной гибридизации in situ на лимфоцитах периферической крови у пациента выявлен скрытый мозаицизм XSRY/XSRYX/XSRYXSRYX; **мозаицизм по половым хромосомам обнаружен по результатам анализа методом флуоресцентной гибридизации in situ на лимфоцитах периферической крови.
*Results offluorescence in situ hybridization show hidden mosaicism XSRY/XSRYX/XSRYXSRYX in the patient's peripheral lymphocytes; **sex chromosome mosaicism was detected by fluorescence in situ hybridization in peripheral lymphocytes. Примечание. н. и. — не исследовано. Note. n. t. — not tested.
Таблица 2. Результаты стандартного спермиологического анализа у пациентов с 46,ХХ-тестикулярной формой нарушения формирования пола Table 2. Results of a standard semen analysis in patients with 46,XX testicular disorder of sex development
Показатель
Объем эякулята, мл
pH, ед.
Вязкость эякулята, мм
эякулята, мл • эякулята, мм
■ШВ
Концентрация сперматозоидов, млн/мл
Sperm concentration, million/mm
Общее количество , млн/мл
Total sperm coun million/ml
Концентрация лейкоцитов, млн/мл
Min—max
0,1-5,1 6,0-8,5 1,0-50,0
0,00-2,95
0,00-5,9
0,05-1,20
M ± SD
2,2 ± 1,2 7,7 ± 0,5 19,6 ± 15,2
0,09 ± 0,41
0,19 ± 0,85
0,43 ± 0,43
Примечание. Здесь и в табл. 3: M — среднее значение; SD — стандартное отклонение. Note. Here and in table 3: M — mean value; SD — standard deviation.
Таблица 3. Результаты количественного кариологического анализа незрелых половых клеток (ККА НПК) у 13 пациентов с 46,ХХ-тестикулярной формой нарушения формирования пола
Table 3. Results of quantitative karyological analysis of immature germ cells (QKA ofIGCs) in 13 patients with 46,XX testicular disorder of sex development
Показатель Parameter Количество сперматозоидов, обнаруженных в осадке Количество НПК, обнаруженных в осадке Доля сперматоцитов II и сперматид от всех обнаруженных НПК, % Неразошедшиеся ядра в половых клетках от общего количества обнаруженных сперматоцитов II и сперматид, %
эякулята, n эякулята, n Percentage of sperma-
Number of sperm cells in ejaculate sediment, n Number of IGCs in ejaculate sediment, n tocytes II and spermatids of all IGCs, % Nondisjunction of nuclei in germ cells of all spermatocytes II and spermatids, %
Min-max 0-150 6-507 41-100 0-60
M ± SD 22 ± 43 202 ± 224 86 ± 17 23,4 ± 17,9
Примечание. НПК — незрелые половые клетки. Note. IGCs — immature germ cells.
Таблица 4. Результаты генетического и сперматологического исследования у пациентов с 46,ХХ-инверсией пола в группах с азооспермией и олигозооспермией/криптозооспермией
Table 4. Results of genetic and semen analysis in azoospermic and severe oligozoospermic/cryptozoospermic patients with 46,XX-testicular disorder of sex development
Критерий сравнения Пациенты с азооспермией Пациенты с олигозооспермией
(n = 21) или криптозооспермией (n = 11)
Azoospermic patients (n = 21) Severe oligozoospermic/ cryptozoosprmic patients (n = 11)
Возраст, лет Age, year 28 ± 6 (16-40) 31 ± 9 (16-52)
Кариотип Karyotype 46,ХХ (n = 19) 45,XX,der(13;14)(q10;q10) (n = 1) 45,Х/46,ХХ (n = 1) 46,ХХ (n = 10) 45,Х/46,ХХ/47,ХХХ (n = 1)
Наличие гена SRY Presence of the SRY gene присутствует (n = 15) present (n = 15) отсутствует (n = 2) absent (n = 2) не исследовано (n = 4) not tested (n = 4) присутствует (n = 8) present (n = 8) отсутствует (n = 3) absent (n = 3)
Наличие локуса AZF Presence of the AZF locus отсутствует (n = 15) absent (n = 15) не исследовано (n = 6) not tested (n = 6) отсутствует (n = 11) absent (n = 11)
Окончание табл. 4 End of table 4
Критерий сравнения Пациенты с азооспермией (n = 21) Azoospermie patients (n = 21) cryptozoosprmic patients (n = 11)
Объем эякулята, мл Sperm volume, ml 2,4 ± 1,6 (0,1-5,1) 2,0 ± 0,6 (0,6-3,0)
Частота олигоспермии, % Frequency of oligospermia, % 30 22
pH, ед. pH, units 7,7 ± 0,5 (6,0-8,3) 7,8 ± 0,4 (6,8-8,5)
Концентрация сперматозоидов, млн/мл Sperm concentration, million/ml 0 0,3 ± 0,7 (0,0-2,95)
Общее количество сперматозоидов, млн Total sperm count, million 0 0,3 ± 0,5 (от единичных сперматозоидов до 2,95 млн) (from single spermatozoa to 2.95 mln)
не различался и варьировал в данных подгруппах от 16 до 40 и от 1 до 52 лет соответственно, в среднем составляя 31 ± 9 и 28 ± 6 лет соответственно (см. табл. 4). В обеих группах преобладал «классический» цитоге-нетический вариант ХХ-инверсии пола с наличием в кариотипе двух Х-хромосом, однако отмечены единичные случаи мозаицизма по Х-хромосоме. Ген SRY обнаружен у 87 и 73 % обследованных пациентов соответственно. Наличие последовательностей локуса AZF не отмечено ни у одного из пациентов в обеих подгруппах, которым выполнено молекулярно-гене-тическое исследование. Объем и рН эякулята существенно не различались, но частота олигоспермии была выше (30 %) в группе пациентов с азооспермией и меньше (22 %) у пациентов с олигозооспермией (см. табл. 4).
При сравнении данных обследования пациентов с SRY-позитивной и SRY-негативной формами ХХ-ин-версии пола не отмечено статистически значимых различий по возрасту и сперматологическим параметрам, за исключением объема эякулята и частоты встречаемости олигоспермии. У SRY-негативных мужчин по сравнению с SRY-позитивными пациентами отмечены статистически значимо меньший средний объем эякулята (0,8 ± 1,0 мл против 2,7 ± 1,2 мл; р = 0,0212; и = 7,00) и более частая встречаемость олигоспермии (табл. 5).
У 6 пациентов с 46,ХХ-тестикулярной формой НФП ССИ выполнено в динамике неоднократно, а также имелись результаты предыдущих сперматоло-гических анализов. Один клинический случай представляет особый интерес, поэтому он будет описан ниже отдельно.
о а
<и
га с
'5 о
к .0
к га г .о
га
a О
Таблица 5. Результаты генетического и сперматологического исследования в группах пациентов с SRY-позитивной (SRY+) и SRY-негативной (SRY-) 46,ХХ-тестикулярной формой нарушения формирования пола
Table 5. The results of cytogenetic examination and semen analysis in groups ofpatients with SRY-positive (SRY+) and SRY-negative (SRY—) 46,XX-testicular disorder of sex development
Критерий сравнения Пациенты с SRY+ ХХ-инверсией пола (n = 23) Пациенты с SRY— ХХ-инверсией пола (n = 5)
comparison criteria Patients with SRY+ ХХ sex reversal (n = 23) Patients with SRY— ХХ sex reversal (n = 5)
Возраст, лет Age, year 30 ± 8 (16-52) 25 ± 6 (17-32)
Кариотип (по данным СЦИ) Karyotype (according to SCA) 46,ХХ (n = 21)* 45,XX,der(13;14)(q10;q10) (n = 1) 45,Х/46,ХХ (n = 1) 46,ХХ (n = 5)
Наличие локуса AZF Presence of the AZF locus Отсутствует Absence Отсутствует Absence
Объем эякулята, мл Ejaculate volume, ml 2,7 ± 1,2 (0,1-5,1) 0,8 ± 1,0 (0,1-2,0)
Окончание табл. 5 End of table 5
Критерий сравнения Пациенты с SRY+ ХХ-инверсией пола (n = 23) Пациенты с SRY— ХХ-инверсией пола (n = 5)
comparison cineiid Patients with SRY+ ХХ sex reversal (n = 23) Patients with SRY- ХХ sex reversal (n = 5)
Частота олигоспермии, % (n/N) Frequency of oligospermia, % (n/N) 8(2/24) 67(2/3)
pH, ед. pH, units 7,7 ± 0,4 (6,8-8,5) 7,5 ± 1,0 (6,0-8,1)
Концентрация сперматозоидов, млн/мл Sperm concentration, million/ml 0,16 ± 0,58 (0-2,95) 0,06 ± 0,07 (0-0,15)
Общее количество сперматозоидов, млн Total sperm count, million 0,27 ± 1,03 (0-5,9) 0,03 ± 0,06 (0-0,1)
*У 1 пациента по данным исследования методом флуоресцентной гибридизации in situ обнаружен 45,Х/46,ХХ/47,ХХХ-мозаицизм. *Results of fluorescence in situ hybridization show hidden mosaicism 45,Х/46,ХХ/47,ХХХ in one patient. Примечание. СЦИ — стандартное цитогенетическое исследование. Note. SCA — standard cytogenetic analysis.
Пациент П.В., 36лет (код пациента 25, см. табл. 1), диагноз: SRY-позитивная 46,ХХ-тестикулярная форма НФП. В течение нескольких лет наблюдался и проходил лечение у андролога по поводу первичного бесплодия в браке, в том числе в течение 3 лет с использованием гормональной терапии для стимулирования сперматогенеза. Поскольку лечение было неэффективным, пациенту было рекомендовано выполнение медико-генетического обследования. В нашу лабораторию пациент обратился для повторного генетического обследования в связи с несоответствием данных цитогенетического (анализ кариотипа) и молекулярно-генетического исследований (анализ микроделеций Y-хромосомы), выполненных; по месту жительства (Украина). При первичном генетическом исследовании кариотип пациента определен как 46,ХХ, и каких-либо микроделеций Y-хромосомы не обнаружено. При повторном генетическом обследовании было установлено, что по данным СЦИ кариотип пациента — 46,ХХ, однако последовательностей длинного плеча Y-хромосо-мы не было обнаружено, что свидетельствовало об ошибочности результатов (ложноотрицательныерезультаты) первичного анализа микроделеций в локусе AZF. Кроме того, при молекулярно-цитогенетическом исследовании (FISH) лимфоцитов периферической крови у него выявлен сложный мозаицизм по Х-хромосоме (XSRY/ XSRYX/XSRYXSRYX), при этом все 3 клеточные линии содержали ген SRY.
Спермиологическое исследование пациенту выполняли многократно в динамике. По данным ССИ, спермато-логические заключения были преимущественно представлены азооспермией и олигозооспермией (табл. 6). Концентрация сперматозоидов в случаях с олигозоо-спермией составляла от 0,05 до 2,95 млн/мл, общее
количество сперматозоидов в соответствующих случаях составило от 0,1 до 5,9млн/мл. Результаты сперми-ологического исследования от 01.12.2006 (анализ выполнен не в нашей лаборатории) представляются нам крайне сомнительными. Олигоспермия отмечена в 2 исследованных образцах эякулята (объем эякулята — 1,0 и 1,3 мл). Показатели pH эякулята в норме. Лейкоспермии в исследованных образцах не обнаружено.
Дополнительно обследованы 2 мужчины (21 и 36 лет), у которых обнаружен мозаицизм XX/XY (также описаны отдельно). Фенотипические признаки у них близки к анализируемой нами группе 46,ХХ-мужчин. Пациенты обратились для обследования в связи с первичным мужским бесплодием. По данным цитогенетического исследования на лимфоцитах крови кариотипы пациентов определены как mos 46,XX[24]/46,XY[6] (код пациента 33, возраст 21 год) и mos 46,XY[190]/46,XX[10] (код пациента 34, возраст 36 лет). У обоих мужчин обнаружены клоны клеток 46,XX, при этом у одного из них (код пациента 33) доминировала клеточная линия с кариотипом 46,ХХ, у другого — линия с кариотипом 46,XY (код пациента 34). У пациента 36 лет отмечена гипоспадия, что свидетельствовало о недостаточной маскулинизации в фетальный период. У обоих мужчин с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции обнаружено наличие последовательностей гена SRY и всех исследованных маркеров локуса AZF. По результатам ССИ в образцах эякулята от данных пациентов отмечены нормальный объем (2,5 и 3 мл) и pH (7,9 и 8,1), вязкость составила 30 и 2 мм, концентрация сперматозоидов в эякуляте — 0,15 и 0,1 млн/мл соответственно. При этом у пациента 33 (см. табл. 1) в возрасте 21 года найдены единичные подвижные спермато-
о а
<и
га с
£1 О
к .о I-
га
I-
u
к га г .о
га
а О
Таблица 6. Результаты стандартного спермиологического исследования у пациента с 46,ХХ-тестикулярной формой нарушения формирования пола (код пациента 25), обследованного в динамике
Table 6. Results of standard sperm analysis in patient with 46,ХХ testicular disorder of sex development (patient code 25), dynamic observation
Дата исследования Объем эякулята, мл Концентрация сперматозоидов, млн/мл Общее количество сперматозоидов, млн Живые/мертвые сперматозоиды, % Подвижные/ неподвижные сперматозоиды, % Нормальные/морфологически атипичные сперматозоиды, %
Date of study Ejaculate volume, ml Sperm concentration, million/ml Total sperm count, million Live/dead sperm, % Motile/non-motile sperm, % Normal/morphologically atypical sperm, %
16.05.1995 2,0 0 0 - - -
14.08.1995 2,0 0 0 - - -
08.12.1995 2,0 0 0 - - -
21.05.1996 1,0 0 0 - - -
07.03.2006 2,0 0,05 0,1 н.о. n. a. 0/100 н.о. n. a.
15.03.2006 2,0 0,85 1,7 н.о. n. a. Единичные подвижные Single motile spermatozoa н.о. n. a.
22.03.2006 2,0 2,95 5,9 н.о. n. a. 0/100 н.о. n. a.
25.09.2006 2,6 0 0 - - -
01.12.2006 3,0 54 162 80/20 56/44 53/47
06.03.2007 2,0 0 0 - - -
27.06.2007 1,3 0 0 - - -
24.10.2007 2,5 0,15 0,3 30/70 0/100 0/100
Примечание. н. о. — не определено. Note. n. a. — not available.
о a
<u
ra с
'5 i-
o
к .0
к re i .о
re
а О
зоиды. Все обнаруженные сперматозоиды имели признаки морфологических аномалий. По результатам ККА НПК в осадке эякулята у пациентов обнаружены сперматозоиды и незрелые половые клетки, в большинстве представленные сперматидами, — 98 и 78 % всех обнаруженных НПК соответственно.
Обсуждение
Среди обследованных нами пациентов ген SRY обнаружен у 82 % 46,ХХ-мужчин, что примерно соответствует результатам, описанным другими авторами. Согласно данным литературы, ген SRY присутствует у 85—90 % пациентов с 46,ХХ-тестикулярной формой НФП и 10 % 46,ХХ-пациентов с овотестикулярной формой НФП [14—18, 21]. У большинства из них обнаруживают транслокацию фрагмента короткого плеча Y-хромосомы (несущего ген SRY) на Х-хромосому, реже на какую-либо аутосому [16, 23]. В последнем случае может иметь место несбалансированная Y-ауто-
сомная транслокация с потерей фрагмента аутосомы, что приведет к соответствующим фенотипическим нарушениям, например врожденным порокам развития, умственной отсталости.
Отсутствие гена SRYустановлено у 18 % пациентов нашей выборки, которым выполнено молекулярно-генетическое исследование. Согласно данным литературы, у 10—15 % пациентов с ХХ-инверсией пола диагностируют SRY-негативную форму НФП, при этом не обнаруживают каких-либо Y-специфичных последовательностей ДНК [11]. В редких случаях SRY-по-зитивная ХХ-инверсия пола обусловлена скрытым низкоуровневым, межтканевым или внутригонадным мозаицизмом по Y-хромосоме, например 46,ХХ/46,ХУ или 46,XX/47,XXY [13]. Среди обследованных нами мужчин с ХХ-инверсией пола, которым выполнено молекулярно-цитогенетическое и/или молекулярно-генетическое исследование, ни у одного из пациентов не обнаружено наличия последовательностей центро-
мерной области (Ycen) и длинного плеча (локуса AZF) Y-хромосомы, что косвенно свидетельствует об отсутствии мозаицизма по Y-хромосоме, по крайней мере в лимфоцитах периферической крови. У пациентов с SRY-негативной формой ХХ-инверсии пола обнаруживают генные мутации или изменение числа копий (CNV) генов или локусов, вовлеченных в процесс диф-ференцировки гонад - DAX1 (Xp21.2), FGF9 (13q11-q12), FOXL2 (3q22.3), NR2F2 (15q26.2), NR5A1/SF-1 (9q33.3), RSPO1 (1p34.3), SOX3 (Xq27.1), SOX9 (17q24.3), SOXIO (22q13.1), WNT4 (1p36.12) и WT1 (11p13) [11]. Таким образом, ХХ-инверсия пола представляет собой гетерогенную группу генетически обусловленных НФП, характеризующихся наличием мужского фенотипа (или отнесенного к мужскому полу) при отсутствии в кариотипе Y-хромосомы (по данным цитогене-тического исследования).
У большинства пациентов с ХХ-инверсией пола по данным цитогенетического исследования обнаруживают кариотип 46,ХХ [5, 6, 11, 13, 14]. У 1 из обследованных нами пациентов обнаружено наличие роберт-соновской транслокации с участием хромосом 13 и 14 - der(13;14)(q10;q10). Данный тип робертсонов-ских транслокаций является наиболее частым и составляет около 70-75 % всех типов робертсоновских транслокаций. Хотя ее происхождение (de novo или унаследованная от матери или отца) не было установлено, очевидно, что эта хромосомная аномалия являлась не связанным с ХХ-инверсией пола генетическим нарушением, которое не оказывало существенного влияния на фенотип.
У некоторых пациентов с ХХ-инверсией пола при СЦИ диагностируют мозаичный ее вариант, например 45,X/46,XX, 45,X/46,XX/47,XXX или 46,XX/47,XXX [13]. Также к 46,ХХ-тестикулярной форме НФП можно отнести кариотип пациентов мужского пола с ка-риотипом 45,Х и 47,ХХХ [26, 27]. В первом случае все пациенты являются SRY-позитивными вследствие наличия Y-аутосомной или X-Y-транслокации (крайне редко), во втором - X-Y-транслокации в сочетании с Х-Х-нерасхождением. С помощью молекулярно-цитогенетического (FISH) исследования установлено, что некоторые SRY-позитивные пациенты с ХХ-ин-версией пола, в том числе те, у которых по данным СЦИ не обнаружено мозаицизма, могут являться мозаиками по дериватной (SRY-несущей) Х-хромосоме. Так, у одного из пациентов исследованной нами выборки, описанного нами ранее [23], обнаружен сложный мозаицизм 45,Xsry/46,XwX/47,X'wX'wX Примечательно, что все 3 клеточные линии имели 1 или 2 дериватные Х-хромосомы, содержащие фрагмент Y-хромосомы с локусом SRY, что, вероятно, обусловливало отсутствие дефицита маскулинизации у данного пациента. Вероятно, в данном случае, как и в других мозаичных вариантах Yp+^Х-инверсии пола,
мозаицизм возник в результате постзиготических ошибок митотического расхождения дериватной (SRY-несущей) хромосомы на ранних стадиях эмбрионального развития. Очевидно, что наличие, тип и выраженность гоносомного мозаицизма, особенно в гонадах, являются одним из генетических факторов, влияющих на экспрессию генов, вовлеченных в половую дифференци-ровку и гаметогенез, и определяющих фенотип пациентов с ХХ-инверсией пола.
Фенотипические проявления у SRY-позитивных и SRY-негативных пациентов с 46,ХХ-тестикулярной формой НФП зачастую не имеют существенных отличий. Однако признаки нарушения половой дифферен-цировки, двойственности развития половой системы, как правило, отсутствуют, при этом выраженность маскулинизации может вполне соответствовать здоровому мужчине (за исключением первичного мужского бесплодия, гипогонадизма и азооспермии). У SRY-негативных пациентов с ХХ-инверсией пола несколько чаще отмечают фенотипические признаки внутриутробного дефицита маскулинизации, такие как гипоспадия, расщепление мошонки, крипторхизм, тестикулярный дисгенез, выраженная гипоплазия те-стикул, в некоторых случаях у пациентов диагностируют овотестикулярную форму НФП, пороки развития органов и систем (костной системы, почек, глаз и др.), не относящихся к мочеполовой системе [11]. Среди обследованных нами 46,ХХ-мужчин, в том числе SRY-негативных, нами не отмечено врожденных пороков развития органов, не относящихся к половой системе. Крипторхизм и/или гипоспадия присутствовали у 13,2 % пациентов с ХХ-инверсией пола [14]. В обследованной нами выборке ХХ-мужчин также отмечена гипоплазия тестикул, а у некоторых пациентов — гипоспадия и крипторхизм в анамнезе (данные не показаны).
У большинства (66 %) пациентов с 46,ХХ-тестику-лярной формой НФП в исследуемой выборке диагностирована азооспермия, у остальных мужчин выявлена олигозооспермия тяжелой степени или криптозооспер-мия. Согласно данным литературы, у пациентов с такой формой НФП сперматогенез практически отсутствует, почти у всех из них диагностируют необструктивную азооспермию [14], поэтому им рекомендуется использовать донорские гаметы в протоколах программ ЭКО [11].
Более частое выявление случаев криптозооспермии у пациентов с ХХ-инверсией пола можно объяснить использованием разработанных в нашей лаборатории методик исследования, в частности метода ККА НПК. Данный метод позволяет более детально исследовать количество и состав половых клеток в эякуляте, в том числе при низких и экстремально низких концентрациях половых клеток при выраженных нарушениях сперматогенеза [25]. Обнаружение половых клеток указывает на частичное сохранение сперматогенеза
о а
<и
га с
ъ! О
к .о I-
га
I-
u
к га г .о
га
a О
О tt
<u
га с
'5 о
к .0
к га г .о
га
а О
вплоть до созревания небольшого количества сперматозоидов, а у части пациентов олигозооспермия выявлена при ССИ (в нативном препарате). Поскольку в эякуляте обнаружены половые клетки на разных стадиях, это косвенно доказывает возможность прохождения всех стадий мейоза некоторыми 46,ХХ-спер-матоцитами. Вариабельность по количеству НПК и сперматозоидов, обнаруженных в эякуляте у обследованных нами 46,ХХ-мужчин, косвенно указывает на различия в степени тяжести нарушения сперматогенеза между пациентами.
Вероятно, на возможность и степень частичного сохранения сперматогенеза в некоторых извитых семенных канальцах у пациентов с 46,ХХ-тестикулярной формой НФП может влиять множество генетических факторов, вовлеченных в регуляцию процессов развития НПК и сперматогенного эпителия, в первую очередь связанных с самим НФП. В исследованной нами выборке пациенты, имеющие и не имеющие ген SRY, существенно не отличались по сперматологическим показателям. Возможно, это связано с относительно небольшим размером группы пациентов с SRY-негатив-ной формой 46,ХХ-инверсии пола (5 пациентов). Среди научных публикаций нами не обнаружено работ, в которых бы проводили сравнительный анализ спер-матологических показателей у пациентов с ХХ-инвер-сией пола в зависимости от генотипа, в частности от наличия гена SRY. При обследовании наиболее крупной выборки из 144 пациентов мужского пола с карио-типом 46,ХХ спермиологическое исследование было выполнено у 128 мужчин, при этом во всех обследованных образцах эякулята обнаружена азооспермия, а средний объем эякулята составил 2,7 ± 1,7 мл (близко к показателю в исследованной нами выборке — 2,2 ± 1,2 мл), нормальная кислотность эякулята выявлена в 95,7 % образцов, сниженный показатель рН отмечен в 4,3 % образцов [14]. Авторы не проводили сравнительный анализ спермиологических параметров у SRY-позитивных и SRY-негативных пациентов. Примечательно, что в столь крупной выборке ни у одного 46,ХХ-мужчины не было обнаружено сперматозоидов. Наличие криптозооспермии и присутствие НПК в эякуляте не указано ни в одном из исследованных образцов, что, вероятно, свидетельствует о том, что осадок эякулята не был детально проанализирован. В исследовании также не указано, выполняли ли гистологическое исследование биоптата яичка или эпидидимиса. По данным гистологического исследования тестикулярной ткани у взрослых мужчин с ХХ-ин-версией пола обнаруживают гиалинизацию семенных канальцев с аплазией герминативного эпителия, а у плодов, пациентов детского и подросткового возраста картина поражения герминативного эпителия в извитых семенных канальцах напоминает синдром «только клетки Сертоли» [5, 6]. Это свидетельствует о прогрессировании поражения тестикулярной ткани
у 46,ХХ-мужчин с возрастом. У одного из обследованных нами пациентов (код пациента 25) спермиологические исследования выполняли в динамике, отмечено снижение концентрации сперматозоидов с возрастом (с олигозоо-спермии до азооспермии/криптозооспермии).
Одним из наиболее значимых результатов представленного исследования являются сперматологические признаки, свидетельствующие о частичном сохранении сперматогенеза у некоторых мужчин с ХХ-инверсией пола, в том числе не имеющих гена SRY. Этот факт противоречит общепринятому научному мнению об отсутствии каких-либо возможностей сохранения сперматогенеза у пациентов с данной формой нарушения формирования пола и/или получения у них сперматозоидов, пригодных для процедуры ЭКО/ICSI. Поэтому 46,ХХ-мужчинам рекомендовано не проводить тестикулярную биопсию, а использовать донорские гаметы в программах вспомогательных репродуктивных технологий. В отличие от 46,ХХ-мужчин, у некоторых мужчин с кариотипом 46,ХХ/46,ХУ обнаруживают олигозооспермию и/или удается получить сперматозоиды, пригодные для процедуры ЭКО/ICSI, в том числе описаны успешные программы [28]. Пациенты с мозаицизмом (или химеризмом) 46,ХХ/46,ХУ характеризуются выраженной фенотипической вариабельностью в отношении развития половой системы (от мужского с нормальной или недостаточной маскулинизацией, двойственного развития гениталий до женского), что обусловлено выраженностью ХУ-не-сущей клеточной линии в гонадах [29]. У некоторых 46,ХХ/46,ХУ-пациентов мужского пола, имеющих овотестикулярную форму НФП, удаление овариальной ткани позволяет существенно улучшить сперматогенез благодаря наличию в ХУ-несущем клоне генов локуса AZF. Мужчины с кариотипом 46,ХХ, являющиеся скрытыми мозаиками по У-хромосоме, частично генетически и фенотипически (клинически) перекрываются с 46,ХХ/46,ХУ-пациентами и некоторыми ци-тогенетическими мозаичными вариантами синдрома Клайнфельтера (46,ХХ/47,ХХУ).
Частичное сохранение сперматогенеза при ХХ-инверсии пола свидетельствует о возможном прохождении всех стадий развития мужских половых клеток при отсутствии генов У-хромосомы, в частности генов локуса AZF (У^11.2), что неоднократно было показано нами ранее у мужчин с протяженными делециями длинного плеча У-хромосомы. Гены У-хромосомы играют важную роль в дифференцировке бипотенциаль-ных гонад в тестикулы, развитии половых органов по мужскому типу, контроле и регуляции сперматогенеза. Однако следует отметить, что в эти процессы вовлечено множество генов, расположенных как на половых хромосомах, так и на аутосомах. Согласно современным представлениям, гены локуса AZF являются регуляторами процессов деления, дифференцировки
АНДРОЛОГИЯ
И ГЕНИТАЛЬНАЯ ХИРУРГИЯ
ANDROLOGY
AND GENITAL SURGERY
1
и развития мужских половых клеток, определяя количество созревающих гамет. Вероятно, на возможность и выраженность частичной сохранности сперматогенеза у пациентов с ХХ-инверсией пола влияют различные генетические (генотип) и фенотипические факторы (возраст, выраженность гипоплазии тестикул и гипого-надизма, наличие каких-либо других заболеваний и др.). В исследованной выборке нами не обнаружено значимого влияния наличия гена SRY на степень спер-матологических нарушений у пациентов с ХХ-ин-версией пола, однако частичная сохранность сперматогенеза чаще отмечена у SRY-позитивных мужчин, а также у ХХ/ХУ-мозаиков. Возможно, это обусловлено относительно небольшим размером выборки и небольшой долей SRY-негативных пациентов. Кроме того, нами не отмечено существенного влияния возраста, что, вероятно, обусловлено тем, что сперматогенез первично нарушен, а с возрастом прекращает созревать то небольшое количество половых клеток, которое проходит мейоти-ческое деление. Предполагают, что, помимо мозаицизма по У-хромосоме, генетическими факторами частичного сохранения сперматогенеза у пациентов с ХХ-инверсией пола могут быть различные генные и эпигенетические факторы (варианты числа копий и генные мутации, характер инактивации Х-хромосомы и др.) [22].
Помимо сперматологических признаков нарушения сперматогенеза, примерно у трети пациентов отмечен сниженный объем эякулята, в единичных случаях — в сочетании с низким рН, на что также указывают и другие авторы [14]. Сниженный объем эякулята отмечают у некоторых пациентов с НФП, в том числе с 46,ХХ-тестикулярной формой НФП. Основной объем эякулята составляет секрет семенных пузырьков, которые являются производными семявы-носящего протока и развиваются под действием андро-генов из вольфова (мезонефрального) протока. Выраженная олигоспермия в сочетании с азооспермией или криптозооспермией характерна для пациентов с аплазией и гипоплазией семенных пузырьков и обструкцией семявыносящих путей, например мужчин с му-ковисцидозом/двусторонней аплазией семявыносящих протоков [30]. У данных пациентов изменения
обусловлены двусторонней непроходимостью семявы-носящих путей на уровне придатка яичка и/или семявы-носящих протоков. Сперматологическими признаками, отличающими пациентов с обструктивной азооспермией, являются низкие показатели рН (<7,0), фруктозы и а-гликозидазы семенной жидкости и существенно меньший объем эякулята [30]. В отличие от них, у пациентов с 46,ХХ-тестикулярной формой НФП средний объем эякулята, как правило, не ниже нормативных значений, а частота и выраженность олигоспермии существенно ниже. Следует отметить, что экстремально низкий объем эякулята (менее 0,2 мл) с выраженно сниженным показателем рН при наличии азооспермии может свидетельствовать о том, что представленный образец фактически представляет собой в основном секрет придаточных половых желез, в частности предстательной железы. Это требуется учитывать при оценке результатов спермиологического исследования.
Заключение
Пациенты с 46,ХХ-тестикулярной формой НФП характеризуются тяжелой формой мужского бесплодия вследствие выраженного нарушения сперматогенеза. Необструктивная азооспермия или экстремально тяжелая форма олигозооспермии у данных пациентов обусловлены отсутствием генов У-хромосомы, в частности всех генов локуса AZF. Выявленная криптозооспермия и наличие НПК в осадке эякулята, а в единичных случаях и олигозооспермия тяжелой степени, указывают на частичную сохранность сперматогенеза при данных генетических заболеваниях, в том числе при SRY-негатив-ном варианте 46,ХХ-тестикулярной формы НФП. Однако успешных случаев получения сперматозоидов, пригодных для ЭКО, и использования их в программах ЭКО/ICSI у пациентов с ХХ-инверсией пола, не являющихся мозаиками по хромосоме У, не описано. Частичное сохранение сперматогенеза и мейоза при 46,ХХ-те-стикулярной форме НФП требует дальнейшего изучения, что позволит разработать новые и оптимизировать имеющиеся подходы к возможному улучшению сперматогенеза и решению проблемы деторождения у пациентов с тяжелыми формами мужского бесплодия.
о а
<и
га с
ъ! О
к .о I-
га
I-
u
к га г .о
га
a О
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
о tt
<u
IB
с
'5 o
к .0
к
re
I .0
re
о
1. Krausz C., Escamilla A.R. Genetics of male infertility. Nat Rev Urol 2018;15(6):369—84. DOI: 10.1038/s41585-018-0003-3
2. Курило Л.Ф. Хромосомные заболевания органов половой системы. Клиническая и экспериментальная морфология 2015;1:48-59.
Kurilo L.F. Chromosomal diseases of the organs of the sexual system. Klinicheskaya i eksperimentalnaya morfologiya = Clinical and Experimental Morphology 2015;1:48-59. (In Russ.).
3. Сорокина Т.М., Соловова О.А., Черных В.Б. Современные возможности генетической диагностики мужского бесплодия. Медицинская генетика 2019;18(12):3—15.
DOI: 10.25557/2073-7998.2019.12.3-15
Sorokina T.M., Solovova O.A., Chernykh V.B. Modern opportunities and indications for genetic diagnosis of male infertility. Medit-sinskaya genetika = Medical genetics 2019;18(12):3—15. (In Russ.). DOI: 10.25557/2073-7998.2019.12.3-15
4. De la Chapelle A., Hortling H., Niemi M., Wennstrom J. XX sex chromosomes in a human male. First Case. Acta Med Scand 1964;175(suppl 412):25—8.
DOI: 10.1111/j.0954-6820.1964.tb04630.x
5. De la Chapelle A. Analytic review: nature and origin of males with XX sex chromosomes. Am J Hum Genet 1972;24(1):71—105.
6. De la Chapelle A. The etiology of maleness in XX men. Hum Genet 1981;58(1):105—16. DOI: 10.1007/BF00284157
7. Lee P.A., Houk C.P., Ahmed S.F. et al. Consensus statement on management of intersex disorders. International Consensus Conference on Intersex. Pediatrics 2006;118(2):e488—500. DOI: 10.1542/peds.2006-0738
8. Калинченко С.Ю., Тишова Ю.А., Асанов А.Ю. и др. Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика синдрома
де ля Шапелля (синдром ХХ-mak): обзор литературы и описание одного случая заболевания. Проблемы репродукции 2003;9(5):58—65.
Kalinchenko S.Yu., Tishova Yu.A., Asanov A.Yu. et al. Clinical and molacular characteristics of De la Chapelle syndrome (XX male syndrome). Problemy reproduktsii = Reproduction Problems 2003;9(5):58—65. (In Russ.).
9. Санникова Е.С., Латышев О.Ю., Самсонова Л.Н. и др. Синдром де ля Шапелля: клинико-лабораторная характеристика четырех пациентов. Проблемы эндокринологии 2017;63(2):124—6. DOI: 10.14341/probl2017632124-126 Sannikova E.S., Latyshev O.Yu., Samsonova L.N. et al.
De la Chapelle syndrome: clinical and laboratory characteristics of 4 patients. Problemy endokrinologii = Problems of Endocrinology 2017;63(2):124—6. (In Russ.). DOI: 10.14341/probl2017632124-126
10. Boucekkine C., Toublanc J.E., Abbas N. et al. Clinical and anatomical spectrum in XX sex reversed patients. Relationship to the presence of Y specific DNA-sequences. Clin Endocrinol (Oxf) 1994;40(6):733—42. DOI: 10.1111/j.1365-2265.1994.tb02506.x
11. Délot E.C., Vilain E.J. Nonsyndromic 46,XX testicular disorders of sex development. In: GeneReviews® [Internet]. Ed. by M.P. Adam, H.H. Ardinger, R.A. Pagon et al. Seattle (WA): University
of Washington, Seattle, 1993—2022. [Initial Posting: October 30, 2003; Last Update: May 26, 2022.]. Available at: https://www.ncbi. nlm.nih.gov/books/NBK1416/
12. Ergun-Longmire B., Vinci G., Alonso L. et al. Clinical, hormonal and cytogenetic evaluation of 46,XX males and review of the literature. J Pediatr Endocrinol Metab 2005;18(8):739—48.
DOI: 10.1515/jpem.2005.18.8.739
13. Черных В.Б., Чухрова А.Л., Вассерман Н.Н. и др. Молекулярный анализ Y-хромосомы у пациентов с ХХ-инверсией пола. Генетика 2008;44(2):236—41.
Chernykh V.B., Chukhrova A.L., Vasserman N.N. et al. Molecular analysis of the Y chromosome in XX sex-reversed patients. Genetika = Russian Journal of Genetics 2008;44(2):236—41. (In Russ.).
14. Chen T., Tian L., Wu F. et al. Clinical and genetic analysis in males with 46,XX disorders of sex development: a reproductive centre experience of 144 cases. Andrologia 2019;51(4):e13232.
DOI: 10.1111/and.13232
15. Terribile М., Stizzo М., Manfredi С. et al. 46,XX testicular disorder of sex development (DSD): a case report and systematic review. Medicina 2019;55(7):371. DOI: 10.3390/medicina55070371
16. Yue F., Zhang H., Xi Q. et al. Molecular cytogenetic analysis and genetic counseling: a case report of eight 46,XX males and a literature review. Mol Cytogenet 2019;12:44.
DOI: 10.1186/s13039-019-0456-y
17. Grinspon R.P., Rey R.A. Molecular characterization of XX maleness. Int Mol Sci 2019;20(23):6089. DOI: 10.3390/ijms20236089
18. Adriao M., Ferreira S., Santos Silva R. et al. 46,XX male disorder of sexual development. Clin Pediatr Endocrinol 2020;29(1):43-5. DOI: 10.1297/cpe.29.43
19. Sinclair A.H., Berta P., Palmer M.S. et al. A gene from the human sex-determining region encodes a protein with homology to a conserved DNA-binding motif. Nature 1990;346(6281):240-4. DOI: 10.1038/346240a0
20. Ferguson-Smith M.A., Cooke A., Affara N.A. et al. Genotype-phenotype correlations in XX males and their bearing on current theories of sex determination. Hum Genet 1990;84(2):198-202. DOI: 10.1007/BF00208942
21. Queipo G., Zenteno J.C., Peña R. et al. Molecular analysis in true hermaphroditism: demonstration of low-level hidden mosaicism for Y-derived sequences in 46,XX cases. Hum Genet 2002;111(3):278-83. DOI: 10.1007/s00439-002-0772-9
22. Vorona E., Zitzmann Z., Gromoll J. et al. Clinical, endocrinological, and epigenetic features of the 46,XX male syndrome, compared with 47,XXY Klinefelter patients. J Clin Endocrinol Metab 2007;92(9):3458-65. DOI: 10.1210/jc.2007-0447
23. Chernykh V.B., Kurilo L.F., Shilova N.V. et al. Hidden X chromosomal mosaicism in a 46,XX male. Sex Dev 2009;3(4):183-7. DOI: 10.1159/000228718
24. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen, 5th edn. Geneva: WHO, 2010. 287 p.
25. Андреева М.В., Хаят С.Ш., Шилейко Л.В. и др. Количественный кариологический анализ незрелых половых клеток
из эякулята как часть протокола обследования мужчин с бесплодием в браке. Андрология и генитальная хирургия 2017;18(1):62-9. DOI: 10.17650/2070-9781-2017-18-1-62-69 Andreeva M.V., Khayat S.S., Schileiko L.V. et al. Quantitative karyological analysis of immature germ cells from ejaculate as part of examination of patients with infertility in marriage. Andrologiya i genital'naya khirurgiya = Andrology and Genital Surgery 2017;18(1): 62-9. (In Russ.). DOI: 10.17650/2070-9781-2017-18-1-62-69
26. Ogata T., Matsuo M., Muroya K. et al. 47,XXX male: A clinical and molecular study. Am J Med Genet 2001;98(4):353-6.
DOI: 10.1002/1096-8628(20010201)98:4<353::aid-ajmg1110>3.0.co;2-d
27. Chernykh V.B., Vyatkina S.V., Antonenko V.G. et al. Unique mosaic X/Y translocation/insertion in infant 45,X male. Am J Med Genet A 2008;146A(24):3195-7. DOI: 10.1002/ajmg.a.32578
28. Laursen R.J., Alsbjerg B., Vogel I. et al. Case of successful IVF treatment of an oligospermic male with 46,XX/46,XY chimerism. J Assist Reprod Genet 2018;35(7):1325-8.
DOI: 10.1007/s10815-018-1194-5
29. Hercent A., Amar E., Valent A. et al. Various genital and reproductive phenotypes in 46,XX/46,XY chimeras. Sex Dev 2019;13(5-6):271-7. DOI: 10.1159/000510532
30. Штаут М.И., Сорокина Т.М., Курило Л.Ф. и др. Сравнительный анализ результатов спермиологического исследования у пациентов с азооспермией, вызванной муковисцидозом и синдромом врожденной двусторонней аплазии семявыносящих протоков. Андрология
и генитальная хирургия 2019;20(1):82—90.
DOI:10.17650/2070-9781-2019-20-1-82-90
Shtaut M.I., Sorokina T.M., Kurilo L.F. et al. Comparative analysis
of the results semen evaluation in patients with azoospermia caused
by cystic fibrosis and congenital bilateral aplasia of vas deferens syndrome. Andrologiya i genital'naya khirurgiya = Andrology and Genital Surgery 2019;20(1):82-90. (In Russ.). DOI: 10.17650/2070-9781-2019-20-1-82-90
Вклад авторов
М.И. Штаут: получение данных для анализа (спермиологическое исследование), анализ полученных данных, написание текста статьи; Т.М. Сорокина: клиническое обследование пациентов;
Л.Ф. Курило: разработка метода количественного кариологического анализа незрелых половых клеток, редактирование текста статьи; Н.В. Опарина, Н.В. Шилова: цитогенетическое обследование пациентов; М.В. Андреева: анализ полученных данных;
A.В. Поляков: разработка и проведение молекулярно-генетического исследования;
B.Б. Черных: разработка дизайна исследования, клиническое обследование пациентов, анализ полученных данных, обзор публикаций по теме статьи, написание и редактирование текста статьи.
Authors' contributions
M.I. Shtaut: obtaining data for analysis (semen analysis), analysis of the data obtained, article writing; T.M. Sorokina: clinical examination of patients;
L.F. Kurilo: development of methods of quantitative karyological analysis of immature germ cells, editing of the article; N.V. Oparina, N.V. Shilova: obtaining data for analysis (cytogenetic examination); M.V. Andreeva: analysis of the data obtained;
A.V. Polyakov: development and implementation of methods of DNA analysis;
V.B. Chernykh: developing the research design, obtaining data for analysis (clinical examination), analysis of the obtained data, reviewing of publications on the topic of the article, article writing and edidting.
ORCID авторов / ORCID of authors
М.И. Штаут / M.I. Shtaut: https://orcid.org/0000-0002-0580-5575 Т.М. Сорокина / T.M. Sorokina: https://orcid.org/0000-0002-4618-2466 Л.Ф. Курило / L.F. Kurilo: https://orcid.org/0000-0003-3603-4838 Н.В. Опарина / N.V. Oparina: https://orcid.org/0000-0001-8662-4794 М.В. Андреева / M.V. Andreeva: https://orcid.org/0000-0002-5048-5486
A.В. Поляков / A.V. Polyakov: https://orcid.org/0000-0002-0105-1833 Н.В. Шилова / N.V. Shilova: https://orcid.org/0000-0002-0641-1084
B.Б. Черных / V.B. Chernykh: https://orcid.org/0000-0002-7615-8512
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства образования и науки России. Funding. The study was performed within work of the state task of the Ministry of education and science of Russia.
Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. акад. Н.П. Бочкова». Все пациенты или их родственники (законные представители) дали письменное информирование согласие на участие в исследовании. ^
Compliance with patient rights and principles ofbioethics. The study was approved by the Ethics Committee of the Research Centre for Medical Genetics. a All patients or their relatives (legal representatives) have given written consent to participate in the study >-
re с
О
к .о i-
<0 I-
u
к re x
.0 ^
re x s i_ s a о
Статья поступила: 11.11.2022. Принята к публикации: 27.12.2022. Article submitted: 11.11.2022. Accepted for publication: 27.12.2022.
