Генетический полиморфизм природных популяций можжевельника (Juniperus communis L. и J. sibirica Burgsd. ) Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 575.174.015.3:582.477.6

СУРСО Михаил Вальдемарович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории экологической биологии Института экологических проблем Севера Уральского отделения РАН. Автор 39 научных публикаций, в т.ч. монографии

БАРЗУТ Оксана Степановна, старший преподаватель кафедры географии и геоэкологии Поморского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Автор 11 научных публикаций

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ МОЖЖЕВЕЛЬНИКА (Juniperus communis L. и J. sibirica Burgsd.)

Генетический полиморфизм, популяция, можжевельник

На севере европейской части России естественно произрастают два вида можжевельника (Juniperus L.): можжевельник обыкновенный (J. communis L.) и можжевельник сибирский (J. sibirica Burgsd.). Морфологически оба вида незначительно отличаются друг от друга [1], поэтому в ранних сводках можжевельник сибирский часто рассматривается как низкорослая форма можжевельника европейского [2]. При совместном произрастании эти виды, судя по всему, склонны к гибридизации [3]. Оба они являются типичными двудомными видами и, хотя указывается на возможность их однодомности [2], фактических доказательств в пользу этого не приводится. Пыльцевые зерна можжевельника ли-

шены воздушных мешков, поэтому обмен мужскими гаметами между географически изолированными популяциями маловероятен (ничтожен). Внутривидовая дифференциация обоих видов на уровне морфологобиометрических признаков изучена слабо. Наибольший интерес вызывают древовидные формы можжевельника [4, 5].

Целью настоящего исследования являлось сравнительное изучение генетического полиморфизма природных северотаежных популяций можжевельника. Под генетическим полиморфизмом понимаются индивидуальные вариации белковых молекул, наследуемые в строгом соответствии с менделев-скими закономерностями, в большинстве

случаев кодоминантно, когда в гетерозиготе активны оба аллеля. Другими словами, полиморфизм — это наличие в популяции двух или более аллелей одного локуса, встречающихся с ощутимой частотой [6]. В данной

работе на основе результатов изоферментно-го анализа приведена сравнительная характеристика аллельного состава генов географически изолированных популяций можжевельника.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

В качестве анализируемого материала для электрофореза использовались гаплоидные ткани (эндоспермы) можжевельника. Использование для анализа мегагаметофи-тов заметно упрощает последующую дешифровку электрофореграмм по сравнению с соматическими тканями, т.к. в этом случае исключается проявление многочисленных внутри- и межлокусных гетеродимеров, хотя объемы рутинных лабораторных исследований при этом существенно возрастают. Поскольку можжевельник является двудомным видом, в данном исследовании речь идет об изучении аллозимного полиморфизма женских субпопуляций.

Исходный материал (шишкоягоды) был собран в пяти природных популяциях Архангельской области. Объем выборки в каж-

дой из этих популяций составлял 30—40 особей. Краткое лесоводственно-геоботани-ческое описание пробных площадей, на которых были собраны шишкоягоды, и их местоположение приведены в табл. 1.

Для анализа каждой ген-ферментной системы по мегагаметофитам у каждого индивидуума бралось по 12—20 выполненных семян. В этом случае вероятность правильной диагностики генотипа по данному локусу была значительно больше 0,99 при условии, что у большинства гетерозигот отсутствовали существенные нарушения в сегрегации аллелей [7]. Для удобства препарирования и с целью активации ферментов семена перед гомогенизацией инкубировались во влажных камерах при комнатной температуре в течение суток. Затем при помощи бритвы и

Краткая характеристика пробных площадей

Таблица 1

№ Популяция Географические координаты Преобладающий вид Краткое лесоводственно-геоботаническое описание

с.ш. в.д.

1 Плесецк 62° 58' 40° 25' J. соттипів Средневозрастные сосняки черничный и брусничный

2 Онега 64° 05' 38° 20' J. еоттипів Средневозрастные сосняки черничный и лишайниковый

3 Соловецкие о-ва 65° 02' 35° 30' J. еоттипів Прибрежные участки смешанных сосновоберезовых насаждений

4 Ижма 64° 43' 40° 48' J. соттипів Опушка разновозрастного сосново-березового насаждения

5 Сев.-зап. часть Беломорско-Кулойского плато 65° 15' 40° 18' J. віЬігіса Граница между верховым сфагновым болотом и ельником зеленомошной группы

препаровальной иглы у них удалялась кожура, разделялись зародыши и эндоспермы. От эндоспермов отделялась пленка нуцеллу-са и остатки суспензора. Для электрофореза использовались эндоспермы, имеющие гаплоидный набор хромосом. Заметим, однако, что, хотя теоретически эндоспермы голосеменных считаются гаплоидными тканями, поскольку являются продуктом митозов функциональной мегаспоры, в них всегда присутствуют клетки, имеющие плоид-ность, отличную от единицы. Тем не менее, гаплотипы мегагаметофитов в сумме всегда дают материнский генотип, что подтверждается многочисленными описаниями электрофоретических спектров ген-ферментных систем этих тканей.

Гомогенизацию производили в пластиковых гомогенизаторах в охлажденном буфере. Состав экстрагирующего буфера представлял собой гелевый буфер, в который добавлялись 0,00363М дитиотрейтола, 0,00318М аскорбиновой кислоты, 0,5814М сахарозы [8]. Гелевый буфер готовили путем 10-кратного разбавления ^Н2О электродного трис-ЭДТА—боратного, pH 8,4, буфера [9]. Для нейтрализации фенолов в состав экстрагирующего буфера вводилось также небольшое количество поливинилпирролидона. Объем экстрагирующего буфера на один эндосперм — 10 мкл. Гомогенаты оставляли на ночную экстракцию в холодильнике. Для электрофореза использовали супернатанты, полученные в результате двукратного центрифугирования при 8 тыс. об./мин в течение 20 минут. Перед электрофорезом супернатанты разбавляли равным количеством 60%-ного забуференного раствора сахарозы, слегка подкрашенного БФС.

Электрофорез проводили в камере с вертикальной ориентацией пластин полиакриламидного геля (далее — ПААГ). Нами исполь-

зовалась методика формирования однослойного 8%-ного ПААГ, составленная на основе прописи C.R. Shieldes, T.J. Orton и

S.W. Stuber [9]. Инкубирующие растворы для окрашивания гелевых пластин на соответствующие ферменты готовили с использованием общеизвестных прописей [9, 10, 11 и др.]. Для приготовления компонентов гелей, буферных систем и инкубирующих растворов использовались свежие сертифицированные, хорошо зарекомендовавшие себя реактивы и препараты производства AppliChem, ICN, Sigma-Aldridge. Всего изучены электрофоретические спектры пяти ген-ферментных систем: малик-энзима (ME, 1.1.1.40), неспецифичных эсте-раз (EST, 3.1.1.1), супероксиддисмутазы (SOD,

1.1.1.14), лейцинаминопептидазы (LAP,

3.4.11.1) и аспартатаминотрансферазы (AAT,

2.6.1.1). Значительное количество ген-фер-ментных систем было исключено из анализа вследствие чрезвычайно низкой активности изоферментных фракций, что, отчасти, объясняется очень малыми объемами исследуемых тканей. Для анализа генетического полиморфизма популяций использовано восемь полиморфных локусов.

При дешифровке электрофореграмм использовали цифровую символику [10, 11]. Математическую обработку результатов проводили по методике Л.А. Животовско-го [12]. Генетический полиморфизм популяций оценивали на основе следующих показателей: фактическая (наблюдаемая) гете-розиготность (g), теоретическая (ожидаемая из соотношения Харди-Вайнберга) гетеро-зиготность (h), коэффициент инбридинга (индекс фиксации Райта) популяции (F), среднее число аллелей на локус (^). Для оценки генетического сходства популяций, т.е. их близости по частотам аллелей изученных локусов, использовали стандартные генетические дистанции М. Nei [13].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Малик-энзим (МЕ, 1.1.1.40) контролируется одним полиморфным локусом, который кодируется двумя аллелями. На гелевой пластине, окрашенной на малик-энзим, после ее световой экспозиции проявляется су-пероксиддисмутаза (SOD, 1.1.1.14) в виде белых ахроматических пятен на более темном фоне геля. Супероксиддисмутаза контролируется тремя полиморфными локусами. Sod-1 кодируется тремя, Sod-2 и Sod-3 — двумя аллелями. При окрашивании геля на неспецифичные эстеразы (EST, 3.1.1.1) проявляется не менее трех зон активности (см. рисунок),

+

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Электрофоретические спектры неспецифичных эстераз (EST, 3.1.1.1) можжевельника ижемской популяции: локус Est-3 — мономорфный, Est-2 — слабополиморфный; по локусу Est-А гетерозиготны особи № 3, 5, 8, 13, 14, 15, 17, остальные — гомозиготны.

Примечание. Электрофоретический спектр для каждого дерева построен на основе суммирования 12 гаплотипов.

из которых только локус Est-1 проявляет полиморфизм; Est-2 и Est-3, по-видимому, мо-номорфны и кодируют малоактивные фракции, проявляющиеся в виде минорных полос, поэтому два последних локуса в анализ не включены. Est-1 является, по-видимому, продуктом деятельности эстеразы А, поскольку проявляется при введении в инкубирующий раствор □-нафтилацетата, поэтому при последующем анализе Est-1 обозначался как Est-A. Данный локус кодируется

четырьмя аллелями. Лейцинаминопептида-за (LAP, 3.4.11.1) контролируется двумя полиморфными локусами, насчитывающими до 5—6 аллелей. Аспартатаминотрансфераза (ААТ, 2.6.1.1) имеет два локуса, из которых только Аа^1 является полиморфным и насчитывает до пяти аллелей; для Аа^2 полиморфизма выявлено не было. Частоты аллелей по изученным полиморфным локусам гаплоидных тканей можжевельника приведены в табл. 2. Основные показатели генетической изменчивости можжевельника в природных популяциях, полученные на основе частот встречаемости генотипов и частот аллелей, приведены в табл. 3.

Частоты аллелей по малик-энзиму близки для всех изученных популяций. По локусу Est-A частоты встречаемости аллелей близки по распределению в Ижемской, Плесецкой и Онежской популяциях можжевельника. В островной Соловецкой популяции локус Est-A близок к мономорфному. В самой северной из всех изученных популяций можжевельника — в северо-западной части Беломорско-Кулойского плато, где преобладает сибирский морфотип — в локусе Est-A доминирует Est-A115. Распределение частот аллелей по локусу Sod-1 примерно одинаково для всех популяций, кроме островной Соловецкой, где аллели Sod-1080 и Sod-1100 практически равнозначны. В локусе Sod-2 во всех популяциях доминирует Sod-2100, кроме Беломорско-Кулойской, где встречаемость обоих аллелей почти одинакова. У этой же популяции можжевельника наблюдается замена доминирующего аллеля в Sod-3. Распределение частот аллелей по локусам Lap-1, Lap-2 и Aat-1 в целом во всех популяциях достаточно близко. Наибольшее число аллелей в локусе Lap-1 выявлено для Ижемской (5 аллелей) и Плесецкой (4 аллеля) популяций, наименьшее — для Бело-

Таблица 2

Частоты аллелей в природных популяциях можжевельника по генам, кодирующим изоферменты

Локус Аллель Популяция

Ижма Плесецк Соловецкие о-ва Онега Сев.-зап. часть Беломорско-Кулойского плато

Ме 1,00 0,839 0,903 0,833 0,939 0,967

1,05 0,161 0,097 0,167 0,061 0,033

Е^-А 0,80 0,018 0,014 0,000 0,000 0,067

1,00 0,593 0,569 0,933 0,625 0,133

1,15 0,389 0,361 0,067 0,347 0,800

1,25 0,000 0,056 0,000 0,028 0,000

0,80 0,300 0,300 0,550 0,056 0,000

0,90 0,000 0,050 0,000 0,111 0,167

1,00 0,700 0,650 0,450 0,833 0,833

Sod-2 0,75 0,185 0,067 0,071 0,200 0,455

1,00 0,815 0,933 0,929 0,800 0,545

Sod-3 1,00 0,673 0,667 0,714 0,375 0,389

1,10 0,327 0,333 0,286 0,625 0,611

Lap-1 0,88 0,059 0,000 0,000 0,000 0,000

0,94 0,147 0,237 0,375 0,214 0,033

1,00 0,618 0,500 0,500 0,572 0,967

1,06 0,147 0,237 0,125 0,214 0,000

1,12 0,029 0,026 0,000 0,000 0,000

Lap-2 0,88 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

0,94 0,077 0,125 0,143 0,000 0,100

1,00 0,596 0,708 0,750 0,583 0,800

1,03 0,000 0,000 0,000 0,167 0,000

1,06 0,327 0,167 0,107 0,208 0,100

1,09 0,000 0,000 0,000 0,042 0,000

АаМ 0,80 0,023 0,063 0,033 0,000 0,000

0,95 0,023 0,041 0,000 0,067 0,100

1,00 0,613 0,812 0,567 0,767 0,900

1,05 0,250 0,063 0,233 0,133 0,000

1,10 0,091 0,021 0,167 0,033 0,000

Таблица 3

Некоторые показатели генетической изменчивости можжевельника в природных популяциях

Популяция Показатели

к,% к, % Д р

Ижма 25,0 44,8 3,0 0,44

Плесецк 31,0 39,9 3,1 0,30

Окончание табл. 3

Популяция Показатели

£ ,% Н, % Д Р

Соловецкие о-ва 17,2 37,9 2,5 0,48

Онега 27,5 40,5 2,9 0,48

Сев.-зап. часть Беломорско-Кулойского плато 30,4 28,0 2,3 0,13

Условные обозначения: g — среднее значение наблюдаемой гетерозиготности; Н — среднее значение ожидаемой гетерозиготности; ц — среднее число аллелей на локус; F — коэффициент инбридинга (индекс фиксации Райта).

морско-Кулойского плато (всего 2 аллеля). В локусе Lap-2 в Онежской популяции обнаружены два аллеля, отсутствующие в других популяциях. Наибольшее количество аллелей в локусе Аа1-1 (по 5) также выявлено для Ижемской и Плесецкой популяций, наименьшее (два) — для Беломорско-Кулойского плато.

Средние значения наблюдаемой гетеро-зиготности во всех изученных популяциях можжевельника довольно близки и колеблются в пределах 25,0—31,0%, кроме Соловецкой, где среднее значение наблюдаемой гетерозиготности почти в два раза ниже и составляет всего 17,2%. Отклонения средних значений ожидаемой гетерозиготности от средних значений наблюдаемой, т.е. фактической гетерозиготности во всех популяциях, кроме Беломорско-Кулойской, существенны. Это хорошо видно при анализе коэффициентов инбридинга (Б) популяций. Как известно, ожидаемая гетерозиготность определяется из соотношения Харди-Вайн-берга и показывает, каковой должна была бы быть гетерозиготность популяции, если бы данная популяция находилась в равновесном состоянии, т.е. не испытывала бы давления отбора. Высокие значения коэффициентов инбридинга могут свидетельствовать о таком давлении, однако могут быть и следствием смешения разных субпопуляций, морфотипов и видов (т.н. эффект Ва-лунда), при этом во всех популяциях наблю-

дается снижение уровня гетерозиготности. Исключение составляет лишь Беломорско-Кулойская популяция, где средние значения наблюдаемой ( g ) и ожидаемой (Н) гетеро-зиготности примерно равны и, как следствие этого, коэффициент инбридинга невысок. Следовательно, данная популяция находится в состоянии, близком к генетическому равновесию. Отметим, что в этой популяции выявлено произрастание исключительно можжевельника сибирского.

Генетические различия между популяциями на основе изученных аллельных частот количественно оценивали с помощью стандартных генетических дистанций М. (табл. 4).

Из приведенных данных видно, что более близки по аллельному составу генов Плесецкая, Онежская и Ижемская популяции можжевельника. Для этих же популяций характерен более высокий генетический полиморфизм (среднее число аллелей на ло-кус ц = 2,9-=-3,1). Островная Соловецкая популяция, кроме более низкого генетического полиморфизма (ц = 2,5), характеризуется также почти двукратным снижением уровня гетерозиготности. Беломорско-Кулойская популяция можжевельника, несмотря на более низкую генетическую изменчивость (в среднем 2,3 аллеля на один полиморфный локус), по количеству гетерозигот близка к Плесецкой, Онежской и Ижемской.

Таблица 4

Матрица генетических дистанций М. Nei

Популяция Онега Ижма Соловецкие о-ва Сев.-зап. часть Беломорско-Кулойского плато

Плесецк 0,042 0,021 0,051 0,131

Онега - 0,045 0,115 0,091

Ижма - - 0,057 0,124

Соловецкие о-ва - - - 0,294

Таким образом, выявлены существенные различия в генетической структуре материковых и островной популяций можжевельника. Еще большие различия наблюдаются

между популяциями, где доминируют раз ные морфотипы можжевельника. Генетичес ки более стабильны монотипные популя ции.

Список литературы

1. Флора европейской части СССР. Т. 1: Плаунообразные, хвощеобразные, папоротникообразные, голосеменные, покрытосеменные. Л., 1974.

2. Флора СССР / АН СССР. Л., 1934. Т. 1.

3. Козубов Г.М., Евдокимов А.М. Можжевельник в лесах Севера // Лесное хозяйство. 1965. № 1. С. 57.

4. Arnborg H.G. Eneboken. Uddevalla, 1994.

5. H0eg O.A. Eineren i norsk natur og tradisjon. Elverum (Норвегия), 1996.

6. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях. М., 1983.

7. Крутовский К.В., Политов Д.В., Алтухов Ю.П. Генетическая изменчивость сибирской кедровой сосны Pinus sibirica Du Tour. Сообщение 1: Механизмы генного контроля изоферментных систем // Генетика. 1987. Т. 23. № 12. С. 2216-2228.

8. Генетическая изменчивость сосны обыкновенной в возрастных группах / Н.В. Старова и др. // Генетика. 1990. Т. 26. № 3. С. 498-505.

9. Isozymes in Plant Genetics and Breeding. Pt. A / Ed. S.D. Tanksley, T.J. Orton. Amst., Oxf., N.Y., 1983.

10. Гончаренко Г.Г., Падутов В.Е., Потенко В.В. Руководство по исследованию хвойных видов методом электрофоретического анализа изоферментов. Гомель, 1989.

11. Левитес Е.В. Генетика изоферментов растений. Новосибирск, 1986.

12. Животовский Л.А. Статистические методы анализа частот генов в природных популяциях // Итоги науки и техники. Общая генетика / ВИНИТИ. М., 1983. № 8. С. 76-104.

13. Nei M. Genetics Distance between Population / Amer. Nat. 1972. Vol. 106. № 949. P. 283-292.

Surso Mikhail, Barzut Oksana

GENETIC POLIMORPHISM OF JUNIPER NATURAL POPULATIONS (Juniperus communis L. and J. sibirica Burgsd.)

The results of juniper genetic polymorphism study in five natural populations in the North-European part of Russia are stated. The differences in the allele composition of genes between the mainland and island populations as well as the populations with predominant European and Siberian «morphotypes» are discovered.

Рецензент — Беляев В.В., доктор сельскохозяйственных наук, профессор кафедры географии и геоэкологии Поморского государственного университета имени М.В. Ломоносова