CC BY
101
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 2
12. Урнова Е.С., Аль-Ради Л.С., Кузьмина Л.А., Карякина А.А., Ковригина А.М., Двирнык В.Н. и др. Успешное применение вемурафениба у больного с резистентной формой волосатоклеточного лейкоза. Тер. арх. 2013; 7: 76-8.
[Umova E.S., Al’-Radi L.S., Kuz’mina L.A., Kariakina A.A., Kovrigina A.M., Dvirnyk V.N., et al. Successful use of vemu-rafenib in a patient with resistant hairy cell leukemia. Terapev-ticheskiy arkhiv. 2013; 85(7): 76-8]. (in Russian)
13. Morandi L., de Biase D., Visani M., Cesari V, De Maglio G., Pizzolitto S., et al. Allele specific locked nucleic acid quantitative PCR (ASLNAqPCR): an accurate and cost-effective assay
to diagnose and quantify KRAS and BRAF mutation. PLoS One. 2012; 7(4): e36084.
14. Xi L., Arons E., Navarro W., Calvo K.R., Stetler-Stevenson M., Raffeld M., et al. Both variant and IGHV4-34-expressing hairy cell leukemia lack the BRAF V600E mutation. Blood. 2012; 119 (14): 3330-2.
15. Langabeer S.E., O’Brien D., McElligott A.M., Lavin M., Browne P.V. BRAF V600E-negative hairy cell leukaemia. Case Rep. Hematol. 2013; 2013: 513049. doi: 10.1155/2013/513049.
Поступила 30.12.13 Received 30.12.13
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 616.155.194.7:575.17.015.3]-07
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ АНТИГЕНОВ СИСТЕМЫ HLA ПРИ ПРИОБРЕТЕННОЙ АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ
Чумак А.А.1, Астрелина Т.А.1, Лебедева Л.Л.1, Азова М.М.2, Пухликова Т.В.1, Ставцев Д.С.1,
Дышлевая З.М.3, Архипова А.Н.3
1ГБУЗ Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения города Москвы, Москва, Россия; 2 ФГБУ ВПО
Российский университет дружбы народов, Москва; 3 ФГБУ Российская детская клиническая больница
Минздрава России, Москва
Резюме. Известно, что при возникновении приобретенной апластической анемии (ПАА) важную роль играет наличие конкретных групп аллелей генов HLA. Цель исследования - изучение особенностей HLA-антигенов при ПАА у детей славянской популяции в зависимости от клинической формы, степени тяжести и ответа на иммуносупрессивную терапию (ИСТ). В исследование были включены 147 детей с ПАА, контрольная группа - 1700 образцов пуповинной крови новорожденных условно здоровых детей. Проводили HLA-генотипирование. Показано, что общими маркерами предрасположенности к развитию идиопатической апластической анемии для мальчиков старше 14 лет и девочек младше 14 лет являются DRB1*15 и В*51; характерным маркером - для девочек младше 14 лет - DQB1*06, для мальчиков младше 14 лет - В*08, В*40, DRB1*03. Общим маркером предрасположенности к ПАА сверхтяжелой формы у мальчиков и тяжелой формы ПАА, в том числе чувствительной к применению комбинированной ИСТ, у детей является HLA-DRB1*15; характерными маркерами предрасположенности к развитию сверхтяжелой формы ПАА у мальчиков - В*08, В*14 и DRB1*03. Полученные результаты позволяют по-новому рассматривать уже имеющиеся модели патогенеза ПАА.
Ключевые слова: антигены системы HLA; приобретенная апластическая анемия; маркеры предрасположенности и протекции к развитию заболевания.
GENETIC POLYMORPHISM OF HLA ANTIGENS IN ACQUIRED APLASTIC ANEMIA
ChumakA.A.1, Astrelina T.A.1, Lebedeva L.L.1, Azova M.M.2, Pukhlikova T.V.1, Stavtsev D.S.1, Dyshlevaya Z.M.3, Arkhipova A.N.3
1Stem Cell Bank, 115541, Moscow, Russia; 2Russian University of Peoples' Friendship, 117198, Moscow, Russia; 3Russian
Pediatric Clinical Hospital, 117513, Moscow, Russia
Summary. Certain groups of HLA gene alleles play an important role in emergence of acquired aplastic anemia (AAA). We studied HLA antigens in Slavic children with AAA of different clinical forms, severity, and response to immunosuppressive therapy (1ST). The study was carried out in 147 children with AAA. The reference group was formed from 1700 specimens of umbilical blood from healthy newborns. HLA genotyping showed that DRB1*15 and B*51 were common markers of liability to idiopathic aplastic anemia for boys from the age of 14 years and girls aged under 14 years; characteristic markers were dQB1*06 for girls aged under 14 years and B*08, B*40, DRB1*03 for boys aged under 14 years. A common marker of liability to extremely severe AAA in boys and to severe AAA, including the disease sensitive to combined 1ST, was hLa-DRB1*15; characteristic markers of liability to extremely severe AAA in boys were B*08, B*14, and DRB1*03. These results suggested a novel view on the available models of AAA pathogenesis.
Key words: HLA antigens; acquired aplastic anemia; markers of predisposition to and protection from disease.
Приобретенная апластическая анемия (ПАА) относится к группе тяжелых патологий кроветворной системы, сопровождающихся угнетением костномозгового кроветворения. Заболеваемость ПАА составляет 2-3 случая на 1 млн населения в год в европейских странах и 3-5 случаев на 1 млн населения в год в странах Азии [1, 2]. Первые результаты исследований распределения антигенов HLA-системы у больных ПАА появились 40 лет назад
[3, 4]. В 1983 г. было обнаружено [5], что в разных этнических группах развитие данного заболевания связано с разными антигенами HLA-системы. К настоящему времени накоплено значительное количество данных о том, что при возникновении ПАА важную роль играет наличие конкретных групп аллелей генов HLA. Показано, что HLA-DREH^ является маркером предрасположенности к развитию ПАА и ассоциируется с благоприятным ответом на
19
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 2
иммуносупрессивную терапию (ИСТ) [6-15]. Также установлена взаимосвязь ПАА с конкретными аллелями. Например, HLA-DRB1*1501 ассоциирован с тяжелой и нетяжелой формами ПАА, а DRB1*1302 встречается статистически значимо реже у больных с тяжелой формой ПАА [16]. Выявлено, что определенные HLA-гаплотипы имеют более выраженную ассоциацию с ПАА [17, 18]. Имеются также данные об ассоциации циклоспоринзависимой ПАА с гаплотипом DRB1*1501-DQA1*0102-DQB1*0602, однако они несколько противоречивы [17]. На сегодняшний день нет единого мнения о роли антигенов HLA в патогенезе ПАА, что требует дальнейшего изучения данного вопроса.
Цель исследования - изучение генетического полиморфизма HLA-антигенов при ПАА у детей славянской популяции в зависимости от клинической формы, степени тяжести и ответа на ИСТ.
Материалы и методы
В исследование были включены 147 детей, больных ПАА, в возрасте от 1 года до 18 лет (62 девочки и 85 мальчиков), средний возраст 11,33 ± 5,6 года, с установленным диагнозом ПАА. Диагноз ПАА был поставлен согласно международным стандартам British Committee for Standards in Haematology (BCSH) [19]. Диагноз идиопатической ПАА установлен у 135 детей (76 мальчиков и 59 девочек), средний возраст 11,3 ± 5,68 года. Диагноз гепатитассоциированной ПАА установлен у 12 больных (9 мальчиков и 3 девочки), средний возраст 9 ± 4,8 года. Группу с гепатитассоциированной ПАА не изучали из-за ее малочисленности, но пациенты с гепатитассоцииро-ванной ПАА были включены в общую группу ПАА.
Степень тяжести ПАА у больных устанавливали по классическим модифицированным критериям Camitta/ ЕВМТ (1976, 1988 г.) [20, 21]. Больных в зависимости от формы тяжести ПАА разделили на 3 группы: 1-я группа (тяжелая форма ПАА) - 41 ребенок (25 мальчиков и 16 девочек), средний возраст 11,36 ± 4,03 года; 2-я группа (сверхтяжелая форма ПАА) - 71 ребенок, средний возраст составил 9,44 ± 4,61 года, из них 38 мальчиков (средний возраст 9,3 ± 4,73 года) и 33 девочки (средний возраст 9,6 ± 4,54 года); 3-я группа (среднетяжелая форма ПАА) -5 детей (3 мальчика и 2 девочки), средний возраст 13,8 ± 4,32 года. У остальных 30 больных степень тяжести ПАА не была определена.
Сведения об ответе на комбинированную ИСТ препаратами антитимоцитарного глобулина (АТГ) и циклоспорина А (ЦсА) были получены у 58 детей. У 39 детей (16 мальчиков и 23 девочки), средний возраст 10,07 ± 4,34 года, был получен ответ на ИСТ (полный, парциальный и минимальный), а у 19 детей (13 мальчиков и 9 девочек), средний
Для корреспонденции:
Астрелина Татьяна Алексеевна, доктор медицинских наук, и.о. директора ГБУЗ Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения города Москвы.
Адрес: 115541, Москва, ул. Бакинская, д. 31.
Телефон/факс: +7(495)327-18-53.
E-mail: t_astrelina@mail.ru, crlpv@mail.ru;
Corresponding author:
Astrelina Tatiyana, MD, PhD (t_astrelina@mail.ru).
20
возраст 8,23 ± 4,57 года, установлено рефрактерное течение ПАА. У остальных 89 детей ответ на ИСТ оценить не представлялось возможным, так как у 41 ребенка была проведена или запланирована трансплантация костного мозга, у остальных 45 детей либо период наблюдения не был достаточен для оценки, либо не было сведений о проводимой ИСТ. У 3 детей был отмечен рецидив ПАА.
Контрольная группа была представлена 1700 образцами пуповинной крови новорожденных условно здоровых детей, родившихся на 37-41-й неделе гестации, прошедших тестирование на вирусную и микробную контаминацию и внесенных в реестр неродственных доноров в Москве за период 2004-2009 гг. Образцы пуповинной крови и результаты HLA-типирования находятся на хранении в ГБУЗ Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения города Москвы.
Периферическую кровь у больных ПАА собирали в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА. Пуповинная кровь была собрана при физиологических и оперативных родах доношенных новорожденных (37-41 нед гестации, медиана 40 нед) при наличии информированного согласия матери и отсутствии стандартных противопоказаний к донорству.
Геномную ДНК выделяли из свежих или замороженных образцов крови методом сепарации на магнитных частицах, основанным на способности магнитных частиц адсорбировать высвобожденную из клеток ДНК. Концентрацию и чистоту ДНК измеряли с помощью спектрофотометра ("Biorad", США).
Проводили генотипирование методом гибридизации с помощью олигонуклеотидных зондов (SSO) с использованием автоматического процессора Dynal AutoRELI™ 48 M на сертифицированных реагентах RELI™ SSO ("Invitrogen", США) и методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью аллельспецифических праймеров (SSP) для разрешения двойных интерпретаций результатов, возникающих при использовании метода SSO. Методом SSO выявляли генотип HLA по всем исследуемым локусам на уровне групп аллелей. Интерпретацию результатов осуществляли с помощью гельдокументирующей системы ДиДжиДок (США) и компьютерной программы UPV.
Статистическую обработку результатов и оценку взаимосвязи между группами аллелей HLA и развитием ПАА проводили с помощью показателя f - частота встречаемости групп аллелей HLA в долях, z - критерия с поправкой Йейтса на непрерывность, точного двустороннего критерия Фишера, р. Если различия долей групп аллелей HLA в опытной и контрольной группах оказывались статистически значимыми, вычисляли показатель отношения шансов - OR (odds ratio) с 95% доверительным интервалом (ДИ). При OR выше 1 наступление заболевания более вероятно для пациентов с исследуемой группой аллелей и предполагаемый фактор риска является значимым. С использованием показателя OR были выявлены общие и характерные маркеры предрасположенности и протекции к развитию ПАА в различных группах детей; было установлено, во сколько раз риск заболеть ПАА в группе риска (т.е. у детей - носителей конкретной группы аллелей HLA) выше, чем в группе без факторов риска (т.е. у детей, не несущих в генотипе данную группу аллелей HLA).
Статистическую обработку данных выполняли с помощью программ Microsoft Excel, Statistica for Windows v. 6.0, StatSoft Inc. (США) и с использованием двуполь-
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 2
ной таблицы при помощи программы Open Epi (Open Source Epidemiologic Statistics for Public Health), версия 2.3 (2009/20/05).
Результаты и обсуждение
Особенности генетического полиморфизма антигенов HLA-системы у детей, больных ПАА Были исследованы HLA-гены класса I (А*, В*, C*) и класса II (DRB1* и DQB1*). У больных ПАА и в контрольной группе выявлены следующие группы анти-
генов: А*23, А*30, А*68, В*15, В*38, В*47, В*52, C*02, C*14, DRb1*04 DRB1*11
А*01,
А*24,
А*31,
В*07,
В*18,
В*39,
В*48,
В*55,
C*03,
C*15,
А*03,
А*26,
А*33,
В*13,
В*35,
В*41,
В*50,
В*57,
А*11,
А*29,
А*66,
В*14,
В*37,
В*44,
В*51,
C*01,
А*02 А*25 А*32 В*08 В*27 В*40.
В*49 В*56
C*04, C*05, C*06, C*07, C*08, C*12, C*16, C*17, DRB1*01, DRB1*03, DRB1*07, DRB1*08, DRB1*09, DRB1*10, DRB1*12, DRB1*13, DRB1*14, DRB1*15, DRB1*16, DQB1*02, DQB1*03, DQB1*04, DQB1*05, DQB1*06.
Анализ полученных результатов показал, что характер распределения групп антигенов HLA классов I и II в исследованных группах в целом соответствовал таковому в славянской популяции - восточнославянских европеоидов [22, 23].
Распределение групп антигенов HLA у детей, больных ПАА, в зависимости от клинической формы заболевания
В связи с возможной ролью иммуногенетических факторов в формировании предрасположенности к разным клиническим формам ПАА исследовали группу детей, больных идиопатической апластической анемией (ИАА). В группе больных ИАА отмечено увеличение частоты встречаемости HLA-8*14, HLA-8*51, HLA-DRB1*03, HLA-DRB1*15 и HLA-DQB1* 06 и снижение частоты встречаемости HLA-8*38, HLA-DRB1*04 (рис. 1). На популяционном уровне риск развития ИАА у детей - носителей В*14, DRB1*15 либо DQB1*06 возрастал в 2 раза и более по сравнению с таковым у детей, у которых эти аллели отсутствовали. Маркерами протекции к развитию ИАА были В*38 и DRB1*04.
Принимая во внимание то, что на развитие ПАА у детей разного пола и возраста влияют разные иммуногенетические факторы, дальнейшие исследования в группе детей, больных ИАА, проводили с учетом данных критериев (табл. 1). Установлено, что в группах девочек и мальчиков, больных ИАА, распределение частоты аллелей HLA было подобно аналогичному показателю в соответствующих группах больных ПАА [24]. Маркерами предрасположенности к развитию ИАА у девочек были DRB1*15 и DQB1* 06, а маркерами протекции к развитию данной формы заболевания - В*38 и DRB1*01. Специ-
Контрольная группа (л=1700)
Дети с ИАА (л=135)
Рис. 1. Частота встречаемости групп антигенов HLA у детей, больных ИАА, и в контрольной группе.
фическими маркерами предрасположенности к ИАА для мальчиков являются В*08, В*40, DRB1*03 и общими с девочками - маркеры DRB1*15 и DQB1*06.
На рис. 2 представлено распределение частоты встречаемости групп антигенов HLA у мальчиков и девочек, больных ИАА, младше 14 лет и в контрольной группе. В группе девочек, больных ИАА, младше 14 лет отмечены статистически значимые различия - увеличение частоты встречаемости HLA^*51, HLA-DRB1*15, HLA-DQB1*06. В группе мальчиков, больных ИАА, младше 14 лет отмечено статистически значимое увеличение частоты встречаемости HLA^*08, HLA^*40, HLA-DRB1*03 и снижение HLA-DRB1*07. Необходимо отметить, что риск заболеть ИАА у девочек младше 14 лет - носителей DRB1*15 возрастал по сравнению с не носителями более чем в 3,5 раза.
В группе девочек, больных ИАА, старше 14 лет отмечались статистически значимые различия -снижение частоты встречаемости HLA-DRB1*04, при этом в группе мальчиков, больных ИАА, старше 14 лет отмечалось значимое увеличение частоты встречаемости В*51 и DRB1*15 и снижение HLA-DRB1*04 по сравнению с контролем. Следовательно, наличие DRB1*04 у детей этой возрастной группы ассоциировано с протекцией к развитию заболевания ИАА независимо от пола, в то время как наличие В*51 и DRB1*15 в генотипе мальчиков ассоциировано с предрасположенностью к данной форме заболевания. Наличие в генотипе HLA-DRB1*15 увеличивает риск развития заболевания у мальчиков старше 14 лет в 5 раз.
В связи с тем, что ИАА является преобладающей формой в диагнозе ПАА, распределение частоты встречаемости групп антигенов HLA у больных ПАА формируется преимущественно таковыми показателями в группе больных ИАА детей. Следовательно, вполне предсказуем тот факт, что существенных отличий в спектре иммуногенетических маркеров ПАА и ее идиопатической формы у детей не выяв-
21
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 2
Таблица 1
Различия иммуногенетических факторов предрасположенности и протекции к развитию ИАА в зависимости от пола и возраста
Группа аллелей HLA Дети, больные ИАА (n = 135) Девочки Мальчики
всего (n = 59) младше 14 лет (n = 38) старше 14 лет (n = 21) всего (n = 76) младше 14 лет (n = 44) старше 14 лет (n = 32)
OR ДИ OR ДИ OR ДИ OR ДИ OR ДИ OR ДИ OR ДИ
В*08 - - - - - - - - 2,22 1,233,88 2,42 1,114,99 - -
В*14 2 1,02-3,69 - - - - - - - - - - - -
В*38 0,18 0,03-0,62 0 0,00-10,64 - - - - - - - - - -
В*40 - - - - - - - - 2,28 1,15-4,28 3,36 1,48-7,12 - -
В*44 - - - - - - - - 0,4 0,16-0,9 - - - -
В*51 1,99 1,12-3,37 - - 2,96 1,08-7,09 - - - - - - 3,73 1,19-9,94
DRB1*01 - - 0,21 0,05-0,62 - - - - - - - -
DRB1*03 1,62 1,03-2,48 - - - - - - 2,35 1,38-3,93 2,88 1,48-5,6 - -
DRB1*04 0,31 0,15-0,59 - - - - 0 0,001-0,70 0,27 0,09-0,64 - - - 0-0,47
DRB1*07 - - - - - - - - 0,4 0,19-0,78 0,28 0,09-0,79 - -
DRB1*15 2,81 1,94-4,07 3,06 1,76-5,35 3,79 1,86-7,86 2,64 1,63-4,26 - - - 2,28-11,48
DQB1*06 2,15 1,43-3,27 2,77 1,48-5,34 2,48 1,17-5,42 н/д н/д 1,77 1,04-3,07 - - н/д н/д
Примечание. Здесь и в табл.2: н/д - нет данных.
лено. Однако для большинства иммуногенетических маркеров предрасположенности к ИАА у детей показатели OR были больше, чем рассчитанные для маркеров ПАА. Например, OR у маркера DRB1*15, полученный при статистической обработке в группах девочек (OR = 3,06) и мальчиков (OR = 2,64) с ИАА в сравнении с таковым в группах девочек (OR = 2,74) и мальчиков (OR = 2,29) с ПАА [24]. Это обусловлено тем, что статистическая обработка результатов типирования детей с ИАА была проведена без учета результатов детей с гепатитассоцииро-ванной АА. Можно предположить, что выявленные иммуногенетические маркеры являются значимыми для ИАА, а возникновение гепатитассоциированной
0.35-,
§ ct
о о 2 Ш
CD а.
S3
щ I P-.S 0 с
CD С ч
CD
0,3-
0,25-
0,2-
0,15-
0,1 -
0,05-
DRB1
| Девочки с ИАА младше 14 лет (л=38)
DRB1*07 DRB1
[ | Мальчики с ИАА младше 14 лет (л=44)
Рис. 2. Частота встречаемости групп антигенов HLA у мальчиков и девочек, больных ИАА, младше 14 лет и в контрольной группе.
АА обусловлено отличным от ИАА патогенезом с вовлечением иных иммуногенетических маркеров. Следовательно, у носителей DRB1*15 существует высокий риск заболеть именно ИАА.
Особенности распределения групп антигенов HLA у детей, больных ПАА, в зависимости от тяжести заболевания
Интенсивность иммунного ответа напрямую зависит от того, насколько эффективно HLA-антигены презентируют антиген Т-лимфоцитам. Следовательно, можно полагать, что интенсивность возникающих патологических реакций в патогенезе ПАА связана с индивидуальным профилем HLA-системы и детерминирует различную степень тяжести этого заболевания. Для проверки данной гипотезы было проведено исследование частоты встречаемости групп антигенов HLA в группах со сверхтяжелой и тяжелой формой ПАА. В группе больных сверхтяжелой формой ПАА отмечаются статистически значимые различия - увеличение частоты встречаемости HLA-B*14, DRB1*03, DRB1*15, DQB1*06 по сравнению с контрольной группой (0,065 и 0,027, p = 0,021; 0,138 и 0,08, p = 0,036; 0,223 и 0,133, p = 0,002; 0,327 и 0,222, p = 0,008 соответственно), при этом на популяционном уровне наибольший риск развития ассоциирован с группами антигенов HlA В*14, DrB1*15 и DQB1*06 (табл. 2).
При оценке маркеров предрасположенности к развитию сверхтяжелой формы ПАА было показано, что в отличие от девочек, в группе мальчиков со сверх-
DQB1*
Контрольная группа (л=1700)
22
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 2
Таблица 2 Различия иммуногенетических факторов предрасположенности и протекции к развитию ПАА в зависимости от формы тяжести ПАА
Группа аллелей HLA Форма ПАА
сверхтяжелая тяжелая, мальчики и девочки (п = 41)
мальчики и девочки (п = 71) мальчики (п = 38) девочки (п = 33)
OR ДИ OR ДИ OR ДИ OR ДИ
В*08 - - 3,12 1,45-6,45 - - - -
В*14 2,67 1,15-5,60 3,05 1,03-7,67 - - - -
DRB1*03 1,89 1,05-3,32 2,9 1,41-5,74 - - - -
DRB1*04 - - - - - - 0,19 0,03-0,7
DRB1*15 2,23 1,34-3,7 2,25 1,14-4,36 - - 2,28 1,18-4,35
DQB1*06 2,15 1,24-3,77 н/д н/д н/д н/д н/д н/д
тяжелой ПАА было отмечено статистически значимое увеличение частоты встречаемости таких групп антигенов, как HLA-B*08 (0,161; p = 0,003), В*14 (0,073; p = 0,04), DRB1*03 (0,175; p = 0,003), DRB1*15 (0,215; p = 0,02). Согласно полученным данным, вышеуказанные группы антигенов представляют собой характерные маркеры предрасположенности к заболеванию сверхтяжелой ПАА у мальчиков, причем у носителей HLA-B*14 или DRB1*03 риск заболеть сверхтяжелой формой ПАА повышается почти в 3 раза.
В группе детей с тяжелой формой ПАА были отмечены статистически значимые различия - увеличение частоты встречаемости групп антигенов HLA-DRB1*15 и снижение DRB1*04 по сравнению с контрольной группой (0,23 и 0,133, p = 0,016; 0,025 и 0,11, p = 0,02 соответственно). Группу пациентов с тяжелой формой ПАА разделить по полу не представлялось возможным из-за малочисленности. Таким образом, общим маркером предрасположенности к развитию тяжелой формы ПАА у детей и сверхтяжелой формы ПАА у мальчиков является группа антигенов HLA-DRB1*15, и риск заболеть этими формами у детей -носителей DRB1*15 по сравнению с не носителями примерно одинаковый. Маркером протекции к развитию тяжелой формы ПАА у детей являлся DRB1*04.
Особенности распределения групп антигенов HLA у детей, больных ПАА, в зависимости от ответа на ИСТ
Одной из актуальных задач при планировании проведения ИСТ при ПАА является прогнозирование ответа на терапию [25]. В этой связи значительный интерес с практической точки зрения представляло изучение иммуногенетических факторов, позволяющих прогнозировать благоприятный ответ на комбинированную ИСТ, применяемую при ПАА. Наличие специфического индивидуального профиля HLA-системы для каждого пациента детерминирует ответ на лекарственную терапию, которая в свою очередь тесно взаимосвязана с патогенезом заболевания ПАА.
Единственной группой антигенов, частота встречаемости которой в группе детей с ПАА, ответивших на ИСТ, отличалась от таковой в контрольной группе, была DRB1*15 f = 0,285; OR = 3,94; ДИ = 1,99-7,9; p = 0,0004).
Наличие маркера HLA-DRB1*15 в генотипе ребенка повышает риск заболеть ПАА почти в 2,5 раза (OR = 2,47, ДИ = 1,73-3,53, p = 00001) по сравнению с детьми, у которых отсутствует эта группа аллелей. В то же время риск заболеть ПАА, чувствительной к применению ИСТ, у носителей HLA-DRB1*15 возрастает в 4 раза.
Таким образом, у детей - носителей DRB1*15 наряду с высоким риском развития ПАА имеется больше шансов выздороветь в результате применения ИСТ.
Кроме того, было проведено сравнение частоты встречаемости антигенов HLA в группах детей, ответивших на ИСТ и рефрактерных к ИСТ (п = 19).
В группе больных детей, ответивших на ИСТ, частота встречаемости HLA^*24 и DRB1*15 была соответственно в 1,67 и 2,7 раза выше (p = 0,02 и p = 0,02 соответственно), чем в группе детей, рефрактерных к ИСТ, что позволило считать данные маркеры факторами благоприятного ответа на ИСТ при ПАА.
Особенности распределения групп антигенов HLA у детей в общей группе с ПАА
После того как частота встречаемости антигенов HLA была изучена у больных ПАА, разделенных на группы, исследование этого показателя было прове-
Контрольная группа (п=1700)
Дети с ПАА (л=147)
Рис. 3. Частота встречаемости групп антигенов HLA у детей, больных ПАА, и в контрольной группе.
23
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 2
дено в общей когорте детей с ПАА. Таким образом, можно было оценить, насколько увеличение частоты встречаемости определенного HLA-антигена в отдельной группе больных влияет на частоту его встречаемости в общей группе.
У 147 детей с ПАА по сравнению с контрольной группой были выявлены статистически значимые различия - увеличение частоты встречаемости HLA-B*14, HLA-B*51, HLA-DRB1*03, HLA-DRB1*15, HLA-DQB1*06 и снижение частоты встречаемости HLA-B*38, HLA-DRB1*04 (рис. 3).
При сравнении полученных результатов показано, что профиль антигенов HLA в группе детей с ПАА практически совпадает с таковым в группе детей с ИАА. Обращает на себя внимание тот факт, что частота встречаемости группы антигенов HLA-DRB1*15 увеличена в изученных подгруппах детей с ПАА, за исключением мальчиков младше 14 лет, девочек старше 14 лет и девочек со сверхтяжелой формой ПАА. Следовательно, этот маркер можно рассматривать в качестве общего маркера предрасположенности к развитию ПАА и, в частности, ИАА у мальчиков старше 14 лет и девочек младше 14 лет. Однако степень его влияния на риск развития ПАА варьирует. При наличии DRB1*15 риск развития ПАА увеличивается по сравнению с неносителями в 2-5 раз у детей при различных формах ПАА, причем наиболее значителен риск развития идиопатической формы ПАА у девочек младше 14 лет и мальчиков старше 14 лет.
Что касается групп антигенов HLA-B*14, HLA-B*51, HLA-DRB1*03, HLA-DQB1*06, то возрастание частоты их встречаемости в группе детей с ПАА обусловлено увеличением данного показателя в отдельных группах детей. Например, появление HLA-B*14, по-видимому, связано с накоплением данного маркера в группе мальчиков со сверхтяжелой формой ПАА. При изучении общей группы больных ПАА детей наблюдается достаточно высокая частота встречаемости В*51. Высокая частота встречаемости группы аллелей HLA-DRB1*03 отмечалась в группе мальчиков со сверхтяжелой формой ПАА. Возрастание частоты встречаемости группы антигенов HLA-DQB1*06 у больных ПАА, вероятно, обусловлено существованием феномена неравновесного сцепления и формированием устойчивого гаплотипа DRB1*15-DQB1*o6.
Полученные результаты подтверждают необходимость изучения генетического полиморфизма HLA-системы не только в отношении заболевания в целом, но и в группах больных в зависимости от пола, возраста, клинической формы и других факторов. Это связано с тем, что выявленные HLA-маркеры предрасположенности могут, например, увеличивать риск заболевания у детей определенного возраста и пола и не оказывать влияния на остальных. Различие в факторах иммуногенетической предрасположенности позволяет говорить об участии отличающихся механизмов в развитии заболевания у разных популяционных групп и по-новому рассматривать уже имеющиеся модели патогенеза ПАА.
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]
1. Issaragrisil S., Kaufman D., Anderson T., Chansung K., Leaver-ton P.E., Shapiro S., Young N.S. The epidemiology of aplastic anemia in Thailand. Blood. 2006; 107(4): 1299-307.
2. Young N.S., Kaufman D.W. The epidemiology of acquired aplastic anemia. Haematologica. 2008; 93(4): 489-92.
3. Albert E., Thomas E.D., Nisperos B., Storb R., Camitta B.M., Parkman R. HLA antigens and haplotypes in 200 patients with aplastic anemia. Transplantation. 1976; 22 (5): 528-31.
4. Dausset J., Svejgaard A. HLA and disease. Copenhagen: Munks-gaard; 1977: 84-93.
5. D’Amaro J., van Rood J.J., Rimm A.A., Bortin M.M. HLA associations in Italian and non-Italian Caucasoid aplastic anaemia patients. Tissue Antigens. 1983; 21(3): 184-91.
6. Oguz F.S., Yalman N., Diler A.S., Oguz R., Anak S., Dorak M.T. HLA-DRB1*15 and pediatric aplastic anemia. Haematologica. 2002; 87(7): 772-4.
7. Saunthararajah Y, Nakamura R., Nam J.M., Robyn J., Loberi-za F., Maciejewski J.P, et al. HLA-DR15 (DR2) is overrepresented in myelodysplastic syndrome and aplastic anemia and predicts a response to immunosuppression in myelodysplastic syndrome. Blood. 2002; 100: 1570-4.
8. Nakao S. Physiopathology of and therapy for aplastic anemia. Nihon Naika Gakkai Zasshi. 2006; 95(9): 1851-7.
9. Heim D., Tichelli A., Gratwohl A., Nissen-Druey C. Human leukocyte antigen DR15 is associated with reduced relapse rate and improved survival after human leukocyte antigen-identical sibling hematopoietic stem cell transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 2006; 12(11): 1169-75.
10. Sugimori C., Yamazaki H., Feng X., Mochizuki K., Kondo Y, Taka-mi A., et al. Roles of DRB1 *1501 and DRB1 *1502 in the pathogenesis of aplastic anemia. Exp. Hematol. 2007; 35(1): 13-20.
11. Huang YL., Huang S.L., Huang K., Bao R. Expression of HLA-DRB1*15 genotype in children with acquired aplastic anemia and its relation to effect of immunosuppressive therapy. Zhong-guo Shi YanXue YeXue Za Zhi. 2007; 15(6): 1212-5.
12. Yoshida N., Yagasaki H., Takahashi Y, Yamamoto T., Liang J., Wang Y, et al. Clinical impact of HLA-DR15, a minor population of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria-type cells, and an aplastic anaemia-associated autoantibody in children with acquired aplastic anaemia. Br. J. Haematol. 2008; 142(3): 427-35.
13. Cui J.X., Pei M.F., Zhang G.S., Xu M. Changes of HLA-DR15 and immunoglobulin, T lymphocyte subsets in patients with aplastic anemia, myelodysplastic syndrome and their significance. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2010; 18(1): 111-5.
14. Dhaliwal J.S., Wong L., Kamaluddin M.A., Yin L.Y, Murad S. Susceptibility to aplastic anemia is associated with HLA-DRB1*1501 in an aboriginal population in Sabah, Malaysia. Hum. Immunol. 2011; 72(10): 889-92.
15. Lu S.Y, Xiao L.L., Luo M., Zhang B.H., Chen C. Relationship between polymorphism of HLA-A, -B, -DRB1 alleles and susceptibility of children to acquired aplastic anemia. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2012; 20(1): 120-4.
16. Song E.Y., Park S., Lee D.S., Cho H.I., Park M.H. Association of human leukocyte antigen-DRB1 alleles with disease susceptibility and severity of aplastic anemia in Korean patients. Hum. Immunol. 2008; 69(6): 354-9.
17. Nakao S., Takamatsu H., Chuhjo T., Ueda M., Shiobara S., Mat-suda T., Kaneshige T., Mizoguchi H. Identification of a specific HLA class II haplotype strongly associated with susceptibility to cyclosporine-dependent aplastic anemia. Blood. 1994; 84(12): 4257-61.
18. Капустин С.И. Особенности аллельного полиморфизма генов HLA II класса в здоровой популяции Санкт-Петербурга и у больных тяжелой апластической анемией. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. СПб.; 1998.
[Kapustin S.I. Features allelic polymorphism of HLA class II in the healthy population of St. Petersburg and in patients with severe aplastic anemia. Dis. St. Petersburg; 1998]. (in Russian)
19. Borowitz M.J., Vardiman J.W., Thiele J., Arber D.A., Brun-ning R.D., Porwit A.,., et al. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes. Blood. 2009; 114(5): 937-51.
24
Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 2
20. Camitta B.M., Thomas E.D., Nathan D.G., Santos G., Gordon-Smith E.C., Gale R.P., et al. Severe aplastic anaemia a prospective study of the effect of early marrow transplantation on acute mortality. Blood. 1976; 48(1): 63-9.
21. Bacigalupo A., Hows J., Gluckman E., Nissen C., Marsh J., Van Lint M.T., et al. Bone marrow transplantation (BMT) versus immunosuppression (IS) for the treatment of severe aplastic anemia (SAA): a report of the EBMT SAA working party. Br. J. Haematol. 1988; 70(2): 177-82.
22. Болдырева М.Н. HLA (класс II) и естественный отбор. "Функциональный"генотип, гипотеза преимущества "функциональной" гетерозиготности: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М.; 2007.
[Boldyreva M.N. HLA class II and natural selection. "Functional" genotype hypothesis benefits "functional" heterozygosity. Dis. Moscow; 2007]. (in Russian)
23. Болдырева М.Н., Алексеев Л.П., Хаитов Р.М., Гуськова И.А., Богатова О.В., Янкевич Т.Э. и др. HLA-генетическое разнообразие населения России и СНГ. I. Русские. Иммунология. 2005; 26(5): 260-3.
[Boldyreva M.N., Alekseev L.P., Khaitov R.M., Guskova I.A.,
Bogatova O.V, Yankevich T.E., et al. HLA-genetic diversity of the population of Russia and the CIS. I. Russians. Immunologiya. 2005; 26(5): 260-3]. (in Russian)
24. Чумак А.А., Астрелина Т.А., Яковлева М.В., Лебедева Л.Л., Пухликова Т.В., Дышлевая З.М. и др. Особенности генетического полиморфизма HLA-антигенов при приобретенной апластической анемии у детей. Вестник Российского университета дружбы народов. 2013; 1: 15-9.
[Chumak A.A., Astrelina T.A., Yakovleva M.V., Lebedeva L.L., Pukhlikova T.V., Dyshlevaya Z.M., et al. Peculiarities of genetic polymorphism of HLA-antigens with acquired aplastic anemia in children. Vestnik Rossiyskogo universiteta druzhby narodov. 2013; 1: 15-9]. (in Russian)
25. Кулагин А.Д. Апластическая анемия: иммунопатогенез, клиника диагностика, лечение. Новосибирск: Наука; 2008. [Kulagin A.D. Aplastic anemia: immunopathogenesis of clinic, diagnostics, treatment (Aplasticheskaya anemiya: immunopa-togenez, klinika diagnostika, lechenie). Novosibirsk: Nauka; 2008]. (in Russian)
Поступила 05.11.13 Received 05.11.13
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 615.382.03:616.151.514].012
ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМЕННОГО ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ IX ВЫСОКОЙ
СТЕПЕНИ ОЧИСТКИ
Дереза Т.Л., Скрылева И.А., Кутюрова О.Г., Берковский А.Л.
ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, Москва
Резюме. Разработан лабораторный метод выделения концентрата фактора IX (OIX) высокой степени очистки, включающий последовательные ступени ионообменной, аффинной и металл-хелатной хроматографии. Оптимизированные условия проведения стадий аффинной и металл-хелатной хроматографии позволяют обеспечить выход фактора свертывания крови IX (OIX) не менее 83 ± 10 и 82 ± 7% соответственно. Получаемый концентрат с удельной активностью OIX 19,6 ± 5,5 МЕ/мг содержит не более 0,0001; 0 и 0,0004 МЕ ФИ, OVII и OX на 1 МЕ OIX. Полученные результаты могут быть положены в основу технологии получения антигемофильного препарата ФЖ высокой степени очистки из плазмы донорской крови.
Ключевые слова: свежезамороженная плазма; криосупернатант; фактор IX системы свертывания крови; ионообменная хроматография; аффинная хроматография; металлхелатная хроматография.
ISOLATION OF HIGHLY PURIFIED PLASMA FACTOR IX
Dereza T.L., Skryleva I.A., Kutyurova O.G., BerkovskyA.L.
Hematology Research Center, 125167, Moscow, Russia
Summary. The new laboratory method for isolation of highly purified concentrated factor IX (FIX) includes a series of stages - ion exchange, affinity, and immobilized metal ion affinity chromatographies. Optimal conditions for affinity and immobilized metal ion affinity chromatography have resulted in FIX output of 83±10 and 82±7%, respectively. The resultant concentrate with FIX specific activity of 19.6±5.5 U/ml contains no more than 0.0001,0, and 0.0004 U FII, FVII, and FX per unit of FIX. The results can be used for developing a technology for obtaining highly purified concentrated FIX from human plasma.
Key words: fresh frozen plasma; cryosupernatant; factor IX; ion exchange chromatography; affinity chromatography; immobilized metal ion affinity chromatography.
Фактор IX (ФГХ) системы свертывания крови, или фактор Кристмаса, представляет собой витамин
Для корреспонденции:
Дереза Татьяна Леонидовна, кандидат технических наук, старший научный сотрудник лаборатории фракционирования белков крови и стандартизации методов контроля препаратов плазмы ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России.
Адрес: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4а.
Телефон: + 7 (495) 612-85-72.
E-mail: dereza@blood.ru, drztata@gmail.com
Corresponding author:
Dereza Tatiyana, PhD (drztata@gmail.com).
К-зависимый глобулярный одноцепочечный гликопротеин, синтезируемый печенью. Концентрация ФК в плазме составляет 5 мкг/мл [1]. ФК входит в состав так называемого протромбинового комплекса (ПК), который включает в себя протромбин, или фактор II, проконвертин, или фактор VII, фактор Стюарта, или фактор X, и антигемофильный глобулин В, или фактор IX).
Недостаточность ФК приводит к тяжелому наследственному заболеванию - гемофилии В. Распространенность гемофилии В составляет 2,61 ± 1,61 на 100 000 человек мужского населения [2].
25
