ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЛЕВОГО ИЗОЛЯТА ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ, ВЫДЕЛЕННОГО ВО ВРЕМЯ ВСПЫШКИ В НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ В 2005 ГОДУ Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

ПТИЧИЙ ГРИПП

УДК 619:616.98:578.832.1:636.5:616-073 А.В. Аидрнясов, В.В. Дрыгни

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЛЕВОГО ИЗОЛЯТА ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ, ВЫДЕЛЕННОГО ВО ВРЕМЯ ВСПЫШКИ В НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ В 2005 году

Введение

Высокопатогенный грипп птиц (ВПГП) является крайне контагиозным, системным вирусным заболеванием домашней и дикой птицы, вызывает высокую смертность, не-кробиотические повреждения, воспаления, кровотечения во внутренних органах, мозге и коже [1, 2, 4]. Гибель птицы может достигать 100%.

Возбудителем заболевания является вирус семейства ОгШошухоутёае, рода 1пАиешаеу1гш, типа А. Геном вируса представлен отрицательно заряженной РНК, состоящей из восьми сегментов, кодирующих десять вирусных белков [6]. По строению поверхностных гликопротеинов вирусы гриппа птиц (ВГП) можно разделить на 16 подтипов по гемагглютинину (Н1-16) и 9 подтипов по нейраминидазе (N1-9). Изо-ляты вируса гриппа птиц существенно отличаются по патогенности. Использование термина ВПГП подразумевает, что данный вирус высоковирулентен для домашней птицы и соответствует одному или нескольким критериям [4]:

а) любой вирус гриппа, вызывающий гибель 6 или более из 8 (летальность, равная 75 или более процентам) 4-8-неде-льных восприимчивых цыплят, в течение десяти дней после внутривенного введения 0.2 мл инфицированной аллантоисной жидкости в разведении 1:10;

б) любой вирус гриппа подтипа Н5 или Н7, не соответствующий первому критерию, но имеющий последовательность аминокислот на сайте разрезания гемагглюти-нина, схожую с таковой вирусов ВПГП;

в) любой вирус гриппа другого подтипа, способный к размножению на культуре клеток без трипсина и имеющий последовательность аминокислот на сайте разре-

зания гемагглютинина, схожую с таковой вирусов ВПГП.

В настоящее время напряженная ситуация по гриппу птиц наблюдается в странах на юго-востоке Азии. В Российской Федерации с июля по сентябрь 2005 года регистрировались вспышки ВПГП в Сибирском, Уральском федеральных округах и Республике Калмыкия. В 2006 году зарегистрированы вспышки ВПГП в 11 субъектах Южного федерального округа. В сложившейся ситуации быстрая диагностика, детектирование и типирование гриппа птиц (ГП) при вспышке является важным фактором своевременного купирования и ликвидации заболевания. Для диагностики ГП, наряду с классическими реакциями, успешно используется метод индикации и идентификации вируса на основе амплификации в ПЦР и определения первичной структуры фрагмента генома вируса, кодирующего сайт разрезания белка гемагглютинина (НА). Также это позволяет на основе первичной структуры сайта разрезания белка НА делать предположение о вирулентности исследуемого изолята вируса [2, 5].

Цель данной работы заключалась в ти-пировании, анализе первичной структуры сайта разрезания белка НА, филогенетическом анализе изолята ВГП, выделенного во время вспышки в Новосибирской области Сибирского федерального округа в 2005 г.

Материалы и методы

Вирус. В работе был использован изо-лят вируса гриппа птиц — А/ёиск/Ыоуо-в1Ыгек/2/2005 (Н5Ш), выделенный от домашней утки в июле 2005 года в Новосибирской области, Купинского района, с. Копкуль.

ПЦР и секвенирование. Суммарную

РНК выделяли, используя универсальный набор реактивов для пробоподготов-ки Биоком (Москва), в соответствии с инструкцией к набору.

Праймеры. Для индикации генома вируса гриппа птиц в ПЦР использовали универсальные праймеры для М гена - А1"УМ491; AIVM88F, AIVM858R, А1"УМ94Ш. Для штаммовой дифференциации использовали праймеры, универсальные для генов Н5 и N1 и специфические для генетической линии А/^ооБеЮиа^-ёо^/1/96 (Н5Ш): H5gg_125F H5ggJL100R, aivH5_av_667F1, aivH5_av_1065R на ген НА и n1_nov_450f, n1_nov_934r, n1_nov_ 480^ n1_nov_912r на ген NA.

Синтез кДНК. Синтез первой цепи комплементарной ДНК на вирусной РНК проводили с использованием РНК-зависимой ДНК-полимеразы вируса миелоблас-тоза птиц. Для реакции обратной транскрипции к 10 мкл раствора суммарной РНК добавляли реакционную смесь, содержащую 2,5 мкл 10 тМ ё№ГР, 4 мкл 5Х ревертазного буфера, 10 пмоль прайме-ров AIVM49F H5gg_125F n1_nov_450f 5 ед. фермента и воду до конечного объема 20 мкл, перемешивали и инкубировали при 42° С 30 мин. После инкубации инактиви-ровали фермент при 95° С 3 мин. и быстро охлаждали смесь.

Амплификация кДНК. ПЦР проводили в программируемом амплификаторе РТС-100 МШСус1ег ^ Reseаrch 1пс, США).

Индикация (M ген). В 0,5 мл пробирку вносили 3 мкл раствора 1 цепи кДНК, по 10 пмоль праймеров AIVM49F и А1"УМ94Ш, 5 мкл буфера для ПЦР (10Х), 6 тМ MgCI2, 1,5 мкл 10 тМ ёЭТР, 2 ед. Taq ДНК-полиме-разы и воду до конечного объема 50 мкл, сверху наслаивали 50 мкл минерального масла. Проводили 35 циклов амплификации при следующих режимах: 93° С - 0,5 мин., 55° С - 0,5 мин., 72° С - 1 мин.

Для повышения чувствительности реакции, при отсутствии вирусспецифичес-кой полосы после первой ПЦР, использовали «гнездовой» вариант ПЦР с парой внутренних праймеров - AIVM88F и AIVM858R (15-25 циклов).

Дифференциация (Н5 и N1 гены). В 0,5 мл пробирку вносили 3 мкл раствора 1 цепи кДНК, по 10 пмоль праймеров (H5gg_125F, H5gg_1100R, n1_nov_450f, n1_nov_934r), 5 мкл буфера для ПЦР (10Х), 6 тМ MgCI2, 1,5 мкл 10 тМ ёЭТР, 2 ед. Taq ДНК-полиме-разы и воду до конечного объема 50 мкл, сверху наслаивали 50 мкл минерального масла. Проводили 35 циклов амплифика-

ции при следующих режимах: 93° С — 0,5 мин., 55° С — 0,5 мин., 72° С — 1 мин.

При необходимости постановки «гнездового» варианта ПЦР использовали следующие пары внутренних праймеров aivH5_av_667Fl, aivH5_av_1065R, n1_nov_ 480f, n1_nov_912r (15-25 циклов).

Продукты ПЦР очищали с помощью набора реактивов "Wizard PCR Preps DNA Purification Kit" (Promega, США).

Секвенирование кДНК. Нуклеотидную последовательность фрагментов Н и N генов определяли методом прямого секвени-рования амплифицированных фрагментов с помощью набора "fmol DNA Sequencing System" (Promega, США). Анализ нуклео-тидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей проводили, используя пакет прикладных программ SeqProgs (Data handling for molecular epidemiology), версия 1.0 (N.J. Knowles, IFAN, Великобритания). Для сравнения использовали опубликованные ранее последовательности вируса птичьего гриппа (http://www.flu.lanl.gov). Результаты исследований и их обсуждение

Для выявления генома вируса гриппа птиц из патологического материала была выделена РНК, которую использовали для реакций ОТ и ПЦР! Первичную индикацию на М ген проводили с праймерами AIVM49F и AIVM941R. После амплификации был синтезирован вирусспецифи-ческий фрагмент кДНК размером 892 пары нуклеотидов (п.н.). После получения положительного результата в ПЦР на индикацию генома вируса ПГ мы проводили штаммовую дифференциацию. В результате амплификации с праймерами aivH5_ av_667Fl, aivH5_av_1065R, n1_nov_480f, n1_ nov_912r был синтезирован вирусспеци-фический фрагмент кДНК размером 398 п.н.(Н5 ген) и 432 п.н. (N1 ген).

Проведение определения и сравнительный анализ первичной структуры ам-плифицированных фрагментов кДНК показало, что исследованная проба содержала фрагменты генома полевого изо-лята вируса гриппа птиц. Определенная первичная структура сайта разрезания белка НА данного изолята имела вид PQGRERRRKKR*GLF Это позволило нам предположить, что исследуемый изо-лят вируса гриппа птиц может относиться к группе высокопатогенных штаммов вируса ГП.

Далее мы проводили сравнение полученных последовательностей с последовательностями гена гемагглютинина подти-

с

A'GujHUi'ViBUmiri/3a4jG0D1115H1 A/duf,kO_iar£xiC2.2mi H5N1 AS ilky Ch sks mH erg Коп g/f) 17Л 7 H BNJ AC h oka n/Hong Коп 7fV9 7 НДМ1 А/с hickoti/K.iff$an/Q3/2 DOS A/duck/Tumafi/O 2/2005 A/wild duck/OmskM 1/2005 A/swan/AtfntMian/04/Q 5 H5N1 Ayt kick&n/Grkneis/O 5/2005 Д/goose/Ch efyabinsMO 3;2005 JV&jr-ft «acted Goose/OtnghaVSMSHSN1 AJBar-ft eatfeiJ Gaos6/<nngfiai/i2A) 5 H5N1 A/duck/Novosibifskf02e 1/2 005 A/metterd/KelmytoeX) 9/2005 A/goostfAltiMiaOOS A'Goosc/Guangdcrgf 1/3 ь H5N1 A/GWSa/Guangdiir^:3/97 H5N1 AGujsa.Hting Ком0 HEN' A/Silk у Ch nksn.'Hnnq Ко ng/SFI 1 HSN1 A'tl и L^.i'Sh яг^Кэ itfS Д00 1 Ч£М

ADиск;hong KongftvH87/2000H5N1

A^k.Thgiliinil.'I^OO^ H5N1

A/ChidierVThaila-id/73/2004 H5M1

Л/ogrc \i Hon g К cng/757 2ЮЗ H5N1

A'dutkGuangjiiteOffiOOl | |sN1

fiJC к ЛI KjYL 22 :20U 2 I-15N 1

A/Ck.'l ri(ia iiKiiai-1 120Г. A H 541

A lr. hioken ЛЧиЫ=п'327,2^04 H5N1

AC k.'l ndnnR sia/HA 12 ПО 3 HfiN 1

A/c hicten angdoi gl74Л) 4 H EN 1

WGkST/4231i2003H5N1

A'duck/Gua ngdong .'2£'20G2 H bN 1

Afc hicKD n.'Ko nc^ ES/U j.HbM

АЛ: hicks n/Ky3tfl£/2004 H6N1

AAJuck/Guangdung/173£i4 H5N1

A'aastad aagla/Balg iumi" ЕДСИ N¿N1

A/riuokOLja гч* Ю7 Л &3 4 HiiN 1

AC h скяг/Уяпя ,-rV NCVD09 JPfYl 6 H !iN 1

A Agrit syf Englnn cV5 0-92,'91

in

I рсденг^пеогкл-ьдрэялти/! Рисунок 1. Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена Н5 (802-1074 н.) штаммов и изолятов ВГП генетической линии АЮоове^оа^^п^1/96. Жирным шрифтом и курсивом выделены названия изолятов подгруппы Qinghai.

па H5 и гена нейраминидазы подтипа N1 из банка данных "Flu. The Influenza Sequence Database" (http://www.flu.lanl.gov/). Было установлено, что гемагглютинин выделенного изолята принадлежит к подтипу H5, а нейраминидаза к подтипу N1 обшир-

ной линии изолятов ВГП АЮооБеЮиа^-ёо^/1/96 (Н5Ш), выделенных на территории Юго-Восточной Азии (включая Индонезию) и Китая, начиная с 1996 г. и по настоящее время (рис. 1, 2).

Ближайшими аналогами российско-

А/сГгкзг^р^атСбЭДЛ А ,'01 ¡ска1 /ТЬа 1 а гй/ТЗЯО 0^

А'шж'мнтжз

АлС И!ск&п:й Иа пю и-В 10,4)5

А/Шп^иезвнВЬИЭЗ

д.'СкЛпсЩп^э'т^па

А1& скаи'Куа&ЗЯСИ

А'сЬ скеп/НиЬе1|'327/Э004

А/СМ5ТАИ31 /2ППЭ

АУОи сШ й паи /36Л'20(>5

А',ОЮБ™Ю,'2003

А/ОИ^.^епЛТ^ДК)

А/с мсйев/СПтеаАЖ/ЯКЯ

Мдасяе/АМЯШМ

А/йьскМоус&ЫгзкШ б 1/2005

А/Ваг-Йва с/и/ Сооае/01пфэ1/5/05

А/таИагФКй1тукют№

Миск/ТшспЮЯЖЯ

М5 Юн гДЧ/05

А/Вяг-ЬР.З^Е 6 Боояе/ОитдЬа/бЗШ

А/мМ

А/дооз&СЬе/уа Ып^/03/2005 А/сЬкквпЖищапШММВ

сКегЖо-ер.'ЕБШ АМискЛЗ.^ 71,-04 А^Ск.'УЫЛ15/20 А'П-к/Н N/5006/70 03 А.'Ыжкаг^иапдййпдЛ ОШ АО и и [г/:' е1г эппЛ 03.'2006 АЧЗ гм_1 да'Пин! I [XI

А/б^куСИ скйп.'НК/ЗРШМ

А Ми ск/е.1 зпдх 01

АКискафид/ИЯСЮ

А.ЯисМ^ ап'17 ДО 01

А'с1чск/ЗИагс1а^,ОвЗ/2004

А.У исК/УокоГтата/сЩ '0,'200Э

Амис^апдм.в/Лиии

АЧи cK.,'GJ ап; йо пд;22 ,'20 02

А/ШпкЛНипдп/ЖЯЭ

А Ми 122!2й 01

АУискЛ-К/ЖЬ'ЭЭ

А.'ШпЮЧКчИб.'И?

-Г"

12

-Г" 11

"Г

"Г

п

В & -1 2 С

Г^оцен- нуклеотирьш различий

Рисунок 2. Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена N1 (598-849 н.) штаммов и изолятов ВГП генетической линии А^оове^оа^^п^1/96. Жирным шрифтом и курсивом выделены названия изолятов подгруппы Qinghai.

го изолята являются вирусы ГП, выделен- водной птицы (гуси, чайки) [озеро Qinghai ные в мае 2005 г. во время вспышки у дикой в одноименной провинции КНР (северо-

восток Тибета)] [3]. Консенсусные последовательности изолятов Qinghai исследуемого вируса ГП А/duck/Novosibirsk/2/2005 (Н5Ш) и других российских изолятов совпадают полностью. Отдельные изоля-ты (как китайские, так и российские) могут нести 1-2 аминокислотные и 2-3 нук-леотидные замены, причем для российских изолятов можно предполагать корреляцию наличия определенных замен с географическим местом выделения вируса.

Обращает внимание то, что озеро Qin-ghai расположено значительно западней районов Китая, где ВГП Н5Ш регистрировался до этого. Можно предположить, что эта вспышка и случаи заболевания ВПГП на юге Западной Сибири связаны с миграцией из Южного Китая диких перелетных водоплавающих птиц в северо-западном направлении по Центрально-Азиатскому миграционному пути, пересекающему Новосибирскую область. Анализ случаев заражения ГП домашней и дикой птицы в Новосибирской области показывает, что все населенные пункты, в которых ре-

гистрировались вспышки заболевания, находятся около водоемов, озер, водохранилищ, рядом с реками. Именно здесь происходила передача вируса от диких представителей околоводной фауны к домашним водоплавающим птицам.

Выводы

Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что изученный изолят вируса гриппа птиц А/duck/Novosibirsk/2/2005 относится к подтипу Н5Ш, обладает структурой сайта разрезания PQGRERRRKKR*GLF и относится к единой генетической группе штаммов из юго-восточной части Азии. Определенная структура сайта разрезания белка гемагглютинина позволяет нам предположить, что он относится к группе высокопатогенных штаммов вируса ГП. Однако, для постановки окончательного диагноза и определения биологических свойств изученного изолята вируса гриппа птиц необходимо проведение тестов на патогенность с использованием чувствительных систем.

РЕЗЮМЕ

При постановке ПЦР с последующим генетическим анализом нуклеотидных последовательностей фрагментов генов H5 и N1 было установлено, что исследуемый изолят вируса гриппа птиц обладает структурой сайта разрезания PQGRERRRKKR*GLF, характерной для вирусов высокопатогенного гриппа птиц, и относится к генетической группе штаммов вируса гриппа птиц из юго-восточной части Азии.

ABSTRACT

PCR with subsequent genetic analysis of H5 and N1 gene fragment nucleotide sequences showed that the examined isolate had the structure of the PQGRERRRKKR* cleavage site characteristic of highly pathogenic avian influenza viruses and belonged to genetic group of South-Eastern Asia influenza viruses.

Литература

1. В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина. Вирусные болезни животных. М.: ВНИИТиБП, 1998. С. 324-336.

2. D.J. Alexander. Orthomyxovirus infections // Virus infections of birds. Amsterdam etc., 1993. Р. 287-316.

3. H Chen, G.J. Smith, S.Y. Zhang et al. Avian flu: H5N1 virus outbreak in migratory waterfowl // Nature. 2005. V 436, № 7048. P. 191-192.

4. Highly pathogenic avian influenza // O.I.E. Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, adopted 05.2005.

5. D.E. Swayne. Pathobiology of H5N2 Mexican avian influenza viruses for chickens // Vet. Pathol. 1997. V 34. P. 557-567.

6. D.E. Swayne, D.A. Halvorson. Influenza // Diseases of poultry. 11th ed. Ames, Iowa, 2003. P. 135-160.

УДК 619:578.832.1:636.5.004.12 И.А. Чвала, В.В. Дрыгин

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИЗОЛЯТА ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ A/DUCK/ NOVOSIBIRSK/2/2005 H5N1

Введение

Высокопатогенный грипп птиц - острая контагиозная вирусная инфекция домашних и диких птиц, характеризующаяся общим угнетением, отеками, множес-

твенными кровоизлияниями и поражениями внутренних органов, мозга и кожи [2, 4, 6]. Гибель птицы, особенно молодняка, может достигать 100%. Возбудителем заболевания является РНК-содержащий