CC BY
30
14. Ageyenko P.D. Fishing areas and fishing water rat in the Khanty-Mansiysk Autonomous Okrug. In: Eds. A.P. Kuzyakin. Water rat and the fight against it in Western Siberia. Novosibirsk book publishing house; 1959: 11 - 15 (in Russian).
15. Shutko O.D., Kuznetsova T.S., Kozlova I.I., Popov V.P. Natural foci of tularemia in the Khanty-Mansi Autonomous District. In: Proceedings of the International Conference «Mammals of North Eurasia: life in the northern latitudes». Surgut; 2014: 1 - 32 (in Russian).
16. Olsufiev N.G. Dunaeva T.N. Natural focality, epidemiology and prevention of tularemia. Moscow; Medicine, 1970 (in Russian).
17. Sanitary Regulations SP 3.1.7.2642-10. Prevention of tularemia (Appendix). Federal Centre of hygiene and epidemiology; Moscow; 2010 (in Russian).
Генетические типы инвазивных пневмококков в Москве
Г.В. Белошицкий, К.О. Миронов, И.С. Королева (irina-korol@yandex.ru), Г.А. Шипулин ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва
Резюме
Рост устойчивости пневмококков к пенициллину и другим антибактериальным препаратам является глобальной проблемой, которую связывают преимущественно с широким распространением высокорезистентных клонов данного патогена. Это результат циркуляции в популяции резистентных клонов, потери или приобретения генов резистентности внутри клонов и распространения генов резистентности в новых генетических линиях возбудителя. Целью представленной работы было определение у инвазивных пневмококков антибактериальной чувствительности, серотиповой характеристики и принадлежности к международным клонам. Мы исследовали 100 штаммов пневмококков, выделенных от больных пневмококковым менингитом в 1980 - 2011 годах в Москве. Среди них 40 культур обладали генетическим родством с международными клонами. Из 30 штаммов пневмококка, проявляющих устойчивость хотя бы к одному антибиотику (пенициллин, цефотаксим, хлорамфени-кол, эритромицин, клиндомицин, тетрациклин, ципрофлоксацин), 14 штаммов принадлежали к международным генетическим клонам, которые характеризовались резистентностью к антибактериальным препаратам, или имели генетическое родство с данными клонами (по одному локусу - SLV или по двум - DLV).
Ключевые слова: пневмококк, резистентность, международные генетические клоны
Genetic Types of Invasive pneumococcal Disease in Moscow
G.V. Beloshitsky, K.O. Mironov, I.S. Koroleva (irina-korol@yandex.ru), G.A. Shipulin
Federal Budget Institution of Science Central Research Institute of Epidemiology of Federal Service on Customers' Rights Protection
and Human Well-Being Surveillance, Moscow
Abstract
The increase of pneumococcal resistance to penicillin and multiple other drugs is a global concern, in large p art, to result from the wide spread of individual highly resistant clones. That resistance is a combination of the spread resistant clones, the acquisition and loss of resistance genes within those clonal lineages, and the spread of resistance genes to new lineages. The aim of the present study was to determine the antibiotic susceptibility and serotype distribution strains of Streptococcus pneumoniae, its belonging to pandemic clones. We investigated 100 invasive pneumococcal isolates from patients of bacterial meningitis during the 1980 - 2011 period in Moscow, among which 40 strains belonged to the common clones. Fourteen of the 30 isolates showed resistance at least to one antibiotic (penicillin, cefotaxim, erythromycin, clindamycin, tetracycline, ciprofloxacin, chloramphenicol) referred to the global resistant clones or had genetic relationship (SLV or DLV) with them. Key words: pneumococcal, drag resistant, global clones
Введение
Быстрый подъем и широкое распространение в мире резистентных и мультирезистентных пневмококков стали серьезной проблемой практического здравоохранения [1]. Если в середине 60-х годов XX века сообщения о выявлении устойчивости пневмококка к антибиотикам носили единичный характер [2], то начиная с конца 70-х и начала 80-х годов ситуация начала стремительно меняться, становясь в некоторых странах критической. Особое беспокойство вызвали случаи клинической неэффектив-
ности пенициллина при лечении пневмококкового менингита, вызванного резистентными штаммами Streptococcus pneumoniae [3]. Отмечена связь между некоторыми серогруппами пневмококка (серогруппы 6, 9, 14, 19 и 23) и устойчивостью к пенициллину [4]. После внедрения в практику по-лимеразной цепной реакции (ПЦР) появилась возможность генетического типирования возбудителя. В 1997 году была организована Международная сеть по изучению молекулярной эпидемиологии пневмококка (Pneumococcal Molecular Epidemiology
Network - PMEN) под эгидой Международного союза микробиологических сообществ (International Union of Microbiological Societies - IUMS) с целью стандартизации номенклатуры и классификации наиболее распространенных антибиотикорези-стентных клонов пневмококка. Задачами PMEN стали:
а) организация взаимодействия между лабораториями и институтами, включая развитие международного сотрудничества по исследованию пневмококка;
б) накопление знаний о распространенности в мире пневмококков, устойчивых к антибиотикам;
в) стандартизация номенклатуры национальных и международных клонов;
г) выявление опасных клонов пневмококка с помощью генетического типирования методами электрофореза в пульсирующем поле (Pulsed-field gel electrophoresis - PFGE), фингерпринта BOX-элементов ДНК (ВОХ-PCR) и мультилокус-ного секвенирования типирования (Multilocus sequence typing - MLST);
д) получение референсных изолятов каждого клона для включения в Американскую коллекцию стандартных культур;
е) обмен информацией между исследователями через Интернет [5].
Наибольшее распространение в рамках проекта PMEN приобрела технология генетического типирования пневмококка методом MLST, предложенная в 1998 году M.C. Enright и B.G. Spratt [6]. Ее использование позволило характеризовать молекулярный тип исследуемого штамма, сравнивать полученные результаты с характеристиками других штаммов, внесенных в международную базу данных MLST, определять генетически наиболее близкие типы, отслеживать эволюционные процессы и распространение опасных генетических клонов.
В России генетическое типирование пневмококков не получило широкого распространения; к тому же исследователи, как правило, ограничиваются небольшим количеством штаммов. До настоящего времени типирование наибольшего числа пневмококков (63 штамма), выполненное методом MLST с внесением результатов в интернет-базу (www.spneumoniae.mlst.net), было проведено Т.А. Савиновой (2011 г.). Исследовались преимущественно изоляты, выделенные при локализованных формах пневмококковой инфекции (отит, синусит, пневмония) и полученные от назофарингеальных носителей пневмококка в Москве, Владивостоке, Иркутске и Санкт-Петербурге [7, 8]. В нашей работе, проведенной в Москве, приведены результаты генетического типирования 100 инвазивных штаммов пневмококка, которые были выделены от больных пневмококковым менингитом на протяжении 1980 - 2011 годов с определением серотиповой принадлежности и чувствительности к антибактери-
альным препаратам. Предварительные результаты работы были ранее опубликованы в статье «Фе-нотипическая и генотипическая характеристика штаммов пневмококков, выделенных от больных пневмококковым менингитом» [9].
Цель настоящей работы - определить генетические типы инвазивных пневмококков, выделенных при пневмококковом менингите в Москве, их серотиповую принадлежность и устойчивость к антибиотикам для выявления наиболее опасных генетических клонов.
Материалы и методы
Всего изучено 100 штаммов пневмококков, выделенных от больных пневмококковым менингитом в 1980 - 2011 годах в Москве. Штаммы возбудителя хранились при -70 0С и перед проведением исследования высевались на питательный агар с добавлением бараньей крови. Жизнеспособными оказались 89 штаммов. Их принадлежность к виду Streptococcus pneumoniae подтверждалась типичным ростом колоний с a-гемолизом на кровяном агаре, положительными тестами с оп-тохином и желчными кислотами. Идентификация 11-ти нежизнеспособных штаммов пневмококка устанавливалась методом ПЦР одновременно с определением серотипа.
Серотипирование культур проводилось с использованием коммерческого набора Pneumotest-latex kit (Statens Serum Institut, Дания) согласно инструкции производителя [10]. В случае отсутствия определяемого серотипа в панели данной тест-системы или получения сомнительного результата реакции латекс-агглютинации дополнительно ставилась классическая реакция набухания капсулы (Quellung reaction) c полным набором специфических типирующих кроличьих антипневмококковых сывороток (Statens Serum Institut, Дания). Определение серотипа у нежизнеспособных культур проводилось методом ПЦР по оригинальной методике, предложенной К.О. Мироновым и соавт. [11, 12]. Для повышения достоверности результатов серологического типирования живых культур все штаммы дополнительно исследовались методом ПЦР.
Определение антибиотикоустойчивости выполнялось с помощью тест-системы ATB STREP 5 ref 14 355 (BioMerieux, Франция) согласно инструкции производителя. Система позволяла тестировать штаммы пневмококка на чувствительность к антибактериальным препаратам в пограничных концентрациях: к пенициллину - в диапазоне от 0,031 до 4 мг/л, к амоксициллину - от 2 до 4 мг/л, к цефотаксиму - от 0,5 до 4 мг/л, к эритромицину - 0,25 мг/л, к клиндамицину - 0,25 мг/л, к тетрациклину - 2 мг/л, к левофлоксаци-ну - от 2 до 4 мг/л, к хлорамфениколу - 4 мг/л, к ванкомицину - 1 мг/л, к ко-тримоксазолу - от 0,5/9,5 до 2/38 мг/л. Результаты исследования оценивались согласно требованиям CLSI (Институт клинических и лабораторных стандартов - Clinical
and Laboratory Standards Institute) [13]. Устойчивость к антибактериальным препаратам определена у 89 штаммов пневмококков.
Генетическое типирование проводилось методом MLST по семи фрагментам генов (aroE, gdh, gki, recP, spi, xpt, ddl) согласно международным требованиям [6]. Обозначения аллелей и сиквенс-тип (ST) пневмококка определяли в соответствии с международной номенклатурой, используя интернет-ресурс (www. spneumoniae.mlst.net). Для выявления эволюционных связей в популяции и установления клональных комплексов, то есть групп сиквенс-типов, объединенных общим происхождением, использовалась программа eBUST. Штаммы с идентичным аллельным профилем или различающиеся по одному локусу (single locus variants - SLV) определялись как генетически родственные, при несовпадении в двух локусах из семи (double locus variants - DLV) оценивались как вероятно генетически близкие. Название клонального комплекса присваивалось по номеру сиквенс-типа, имеющего наибольшее количество SLV.
Результаты и обсуждение
Из 100 штаммов пневмококков, выделенных от больных пневмококковым менингитом в 1980 -2011 годах, 57 культур принадлежали к 36-ти известным сиквенс-типам, а 43 штамма относились к 40-ка новым аллельным профилям, отсутствующим в международной базе данных (www.spneumoniae. mlst.net). Из штаммов с новым аллельным профилем 34 культуры имели различные комбинации уже известных аллелей, у шести культур выявлены новые локусы аллелей (aroE-225; gdh-322, gdh-332; gdh-333; recP-197; ddl-472). Большое число сиквенс-типов в исследованной популяции пневмококка свидетельствует о значительном генетическом разнообразии возбудителя.
Характеристика штаммов пневмококка, принадлежащих к сиквенс-типам, зарегистрированных в международной интернет-базе данных, показана в таблице 1.
Как следует из таблицы 1, наиболее часто в популяции инвазивных пневмококков встречались культуры, относящиеся к сиквенс-типам ST2296 (10 штаммов), ST505 (5 штаммов), ST1527 (4 штамма) и ST180 (3 штамма). В структуре штаммов с известным сиквенс-типом доминировали следующие серотипы (по убыванию значимости): 1 (10 штаммов), 3 (9 штаммов), 12F и 19F (по 4 штамма), 11А, 15А, 2, 7F, 6B, 14, 23A - по два штамма. Остальные серотипы (18С, 35, 21, 15B, 34, 9AV, 22A, 6A, 9N, 19A, 4, 23F) представлены единичными культурами. Среди инвазивных пневмококков обнаружено восемь культур, принадлежащих к базовым сиквенс-типам шести международных генетических клонов: Spain23F-1, Sweden15A-25, Greece21-30, Netherlands3-31, Netherlands15B-37, Netherlands7F-39, из которых клоны Sweden15A-25, Greece21-30, Netherlands3-31 и Netherlands15B-37 выявлены в России впервые.
Характеристика штаммов пневмококка с новым аллельным профилем, данные о которых ранее отсутствовали в международной базе данных, представлена в таблице 2.
Пневмококки, имеющие новый аллельный профиль, преимущественно представлены единичными штаммами, за исключением сиквенс-типов ST6948 (2 штамма) и ST6949 (2 штамма). Среди них доминировали серогруппы/серотипы: 3 (4 штамма), 6АВ (4 штамма), 18АВС (4 штамма), 18С (3 штамма), 19F (3 штамма), 7F (2 штамма), 6А (2 штамма), 4 (2 штамма), 1 (2 штамма), 20 (2 штамма). Серотипы 5, 6В, 7С, 8, 9АЧ 9К 14, 15А, 22^ 23^ 23В, 25, 34 обнаруживались в единичных случаях.
Изучение антибиотикоустойчивости 89 штаммов пневмококка выявило 30 культур, резистентных к одному и более антибактериальным препаратам (табл. 3). Из них 17 (57%) резистентных штаммов принадлежали к серогруппам (6, 9, 14, 19, 23), ассоциированным с устойчивостью к антибиотикам [4]. Доля штаммов, устойчивых к пенициллину, составила 15%, к цефотаксиму - 5%, к эритромицину - 17%, к тетрациклину - 23%.
Наиболее высокий уровень устойчивости к пенициллину (МПК > 1 мкг/мл) и мультирезистент-ности отмечался у четырех культур, принадлежащих к ST6863, ST81 ^рат23р-1), ST6955, ST7840.
По результатам мультилокусного секвениро-вания типирования инвазивных пневмококков можно выделить девять групп штаммов, имеющих аллельный профиль, сходный с международными генетическими клонами ^рат23р-1, Sweden15A-25, Netherlands15B -37, Netherlands7F-39, Greece21-30, Netherlands3-31) или отличающийся от них только по одному локусу ^А*-29, Taiwan19F-14, Со1итЫа5-19). Кроме того, семь групп штаммов пневмококка можно объединить по признаку вероятного генетического родства с международными клонами (Netherlands3-31, Hungary19A-6, Poland6B-20, Tennessee23F-4, Greece6B-22, Finland6B-12, Netherlands8-33, Columbia23F-26), различие с которыми наблюдается по двум локусам из семи.
Международные клоны Spain23F-1, Sweden15A-25, Netherlands15B-37, Netherlands7F-39, Greece21-30, представленные в исследуемой популяции единичными культурами, не имели близких генетических связей с другими исследуемыми штаммами. При этом:
штамм клона Spain23F -1 ^Т81) относился к базовому серотипу 23^ обладал резистентностью к пенициллину (МПК > 1 < 2 мкг/мл), к цефотаксиму (МПК > 1 < 2 мкг/мл), к эритромицину (МПК > 0,25 мкг/мл), к тетрациклину (МПК > 2 мкг/мл) и хлорамфениколу (МПК > 4 мкг/мл). Его свойства соответствуют характеристике клона Spain23F-1 в международной базе данных; • штамм клона Sweden15A-25 ^Т63) принадлежал к варианту клона с серотипом 14. В отличие от других штаммов клона Sweden15A-25 с серо-
Таблица 1.
Штаммы пневмококка, относящиеся к известным сиквенс-типам
Число штаммов Серотип Сиквенс-тип Международные клоны
2 11A 1012 -
1 18C 102 -
1 ND 123 -
1 15A 1252 -
1 35 1475 -
2 2 1504 -
4 12F 1527 -
3 3 180 Netherlands3-31
1 15A 1816 -
1 7F 191 Netherlands7F-39
1 21 193 вгеесе21-30
1 15B 199 Netherlands15B-37
1 7F 203 -
1 6B 2138 -
10 1 2296 -
1 7F 2331 -
1 ND 2337 -
1 34 2337 -
1 9AV* 239 -
1 22A 239 -
1 14 2997 -
23A 42 -
1 19F 423 -
1 19F 4311 -
1 3 447 -
1 9N 4811 -
3 505 -
1 14 63 Sweden15A-25
1 19F 654 -
1 19A 663 -
1 23A 673 -
1 6A 675 -
1 4 800 -
1 23F 81 Spain23F-1
1 19F 925 -
1 6B 948 -
Примечание: ND - нежизнеспособный штамм, серотип которого не входит в панель генетической системы типирования; *нежизнеспособ-ный штамм, серотип которого определялся генетическим методом.
Таблица 2.
Штаммы пневмококка, которым присвоен новый сиквенс-тип
Число штаммов Серотип Сиквенс-тип
1 25 4843
1 5 5088
1 7C 5089
1 18C 5090
1 8 5091
1 6B 6863
1 6АВ* 6867
1 6B 6947
2 3 6948
2 3 6949
1 6AB* 6950
1 6A 6951
1 19F 6952
1 18ABC* 6953
1 18ABC* 6954
1 19F 6955
1 4 6956
1 18ABC* 6957
1 18С 7143
1 23F 7144
1 6A 7145
1 19F 7146
1 1 7147
1 1 7148
1 18C 7153
1 14 7840
1 20 7841
1 34 7842
1 20 7844
1 22F 9274**
1 9N 9275**
1 15A 9276**
1 7F 9277**
1 4 9278**
1 7F 9279**
1 18C 9280**
1 9AV* 9281**
1 6AB* 9282**
Число штаммов Серотип Сиквенс-тип
1 23B 9283**
1 18ABC* 9284**
1 11A 9324**
Примечание: *Нежизнеспособный штамм, серотип которого определялся генетическим методом;
**штамм с новым аллельным профилем, сведения о котором отправлены в международную интернет-базу данных (www.spneumoniae.mlst.net).
Таблица 3.
Характеристика штаммов с повышенной устойчивостью к антибиотикам
Число штаммов ST Stype МПК (мкг/мл)
Pen Cef Ery Tet Clor
1 6863 6B > 1 < 2 > 1 < 2 > 0,25 > 2 > 4
1 81 23F > 1 < 2 > 1 < 2 > 0,25 > 2 > 4
1 7840 14 > 1 < 2 > 1 < 2 > 0,25 > 2 < 4
1 6955 19F > 1 < 2 > 0,5 < 1 > 0,25 > 2 < 4
1 675 6A > 0,5 < 1 < 0,5 > 0,25 > 2 < 4
1 9276 15A > 0,25 < 0,5 < 0,5 < 0,25 > 2 < 4
1 63 14 > 0,25 < 0,5 < 0,5 < 0,25 > 2 < 4
1 663 19A > 0,25 < 0,5 < 0,5 < 0,25 > 2 < 4
1 925 19F > 0,25 < 0,5 < 0,5 > 0,25 < 2 < 4
1 9275 9N > 0,25 < 0,5 < 0,5 > 0,25 < 2 < 4
1 7144 23F > 0,13 < 0,25 < 0,5 < 0,25 > 2 < 4
1 800 4 > 0,13 < 0,25 < 0,5 < 0,25 < 2 < 4
1 6956 4 > 0,13 < 0,25 < 0,5 > 0,25 > 2 < 4
1 2337 34 > 0,06 < 0,13 < 0,5 > 0,25 < 2 < 4
1 7842 34 > 0,06 < 0,13 < 0,5 < 0,25 < 2 < 4
1 193 21 > 0,06 < 0,13 < 0,5 > 0,25 > 2 < 4
1 1475 35 > 0,06 < 0,13 < 0,5 > 0,25 > 2 < 4
1 9274 22F > 0,06 < 0,13 < 0,5 > 0,25 < 2 < 4
1 5088 5 < 0,06 < 0,5 < 0,25 > 2 < 4
1 42 23A < 0,06 < 0,5 < 0,25 > 2 < 4
1 7145 6A < 0,06 < 0,5 < 0,25 > 2 < 4
1 7148 1 < 0,06 < 0,5 > 0,25 > 2 < 4
1 1816 15A < 0,06 < 0,5 > 0,25 < 2 < 4
1 7146 19F < 0,06 < 0,5 < 0,25 > 2 < 4
1 423 19F < 0,06 < 0,5 < 0,25 > 2 < 4
1 7844 20 < 0,06 < 0,5 < 0,25 > 2 < 4
1 4311 19F < 0,06 < 0,5 < 0,25 > 2 < 4
1 6947 6B < 0,06 < 0,5 > 0,25 > 2 < 4
1 505 3 < 0,06 < 0,5 < 0,25 > 2 < 4
1 203 7F < 0,06 < 0,5 < 0,25 > 2 < 4
Примечание: ST - сиквенс-тип, Stype - серотип. Антибиотики: Pen - пенициллин, Cef - цефотаксим, Ery - эритромицин, Tet - тетрациклин, Clor - хлорамфеникол.
типом 14, включенных в международную базу данных, наш штамм сохранял чувствительность к эритромицину (МПК < 0,25 мкг/мл) и клинда-мицину (МПК < 0,25 мкг/мл), обладал небольшой устойчивостью к пенициллину (МПК > 0,25 < 0,5 мкг/мл); • штаммы клонов Netherlands15B-37 ^Т199), Netherlands7F-39 ^Т191) и Greece21-30 ^Т193) принадлежали к базовым серотипам и по своим
свойствам совпадали с характеристикой соответствующих клонов.
Генетические связи международных клонов и близких к ним сиквенс-типов показаны на рисунке 1. • Наиболее многочисленные группы штаммов -А и Г - образованы культурами, генетически близкими к клонам Netherlands3-31 и USA1-29. Группа А включала три штамма пневмококка с сиквенс-типом ST180 (базовый сиквенс-тип клона
Рисунок 1.
Международные генетические клоны и генетические близкие к ним сиквенс-типы пневмококков
Б
В.
Г.
Д.
Е.
Ж.
З.
И.
Netherlands 3-31 ST180 (7,15,2,10,6,1,22)
ST505 (46,8,2,10,6,1,22)
ST6949 (7,15,22,10,6,1,2)
ST6948 (46,8,22,10,6,1,2)
Hungary 19a-6 ST268 (7,13,42,6,10,6,56)
ST7144 (7,13,2,6,10,6,14)
Poland 6b-20 ST315 (20,28,1,1,15,14,14)
ST6947 (20,28,14,1,15,14,1)
USA 1-29 ST615 (10,31,4,1,6,4,94)
ST7147 (10,333,4,34,6,4,94) ST7148 (225,31,4,34,6,4,94) ST2296 (10,31,4,34,6,4,94)
Taiwan 19f-14 ST236 (15,16,19,15,6,20,26)
ST4311 (15,16,19,6,6,20,26) ST925 (15,16,19,15,6,20,19) ST6955 (15,16,26,15,6,20,19)
Tennessee 23f-4 ST37 (1,8,6,2,6,4,6)
ST42 (1,8,9,9,6,4,6)
Greece 6b-22 ST273 (5,6,1,2,6,1,14)
Finland 6b-12 ST270 (5,6,43,2,6,1,28)
ST6863 (2,6,1,2,6,1,28)
Columbia 5-19 ST289 (16,12,9,1,41,33,33)
ST5088 (16,12,9,1,41,31,33)
Netherlands 8-33 ST53 (2,5,1,11,16,3,14)
ST5090 (2,5,1,11,190,3,216)
Columbia 23F-26 ST338 (7,13,8,6,1,6,8)
ST663 (7,13,8,6,6,6,99)
Netherlands3-31) и девять генетически родственных штаммов других сиквенс-типов (ST505, ST6949, 6948). Сиквенс-типы ST505, ST6949 имели вероятное генетическое родство (DLV) с ST180, различаясь по локусам aroE, gdh и gki, ddl. Вероятное родство DLV также отмечалось между ST6948 и ST505, ST6949. Все 12 штаммов, входящие в группу А, принадлежали к одному серотипу 3 и были чувствительны ко всем антибактериальным препаратам, однако различие между ST180, ST505, ST6949 и 6948 по двум локусам из семи не позволяет говорить о формировании клонального комплекса СС180.
Группа Г включала 12 штаммов пневмококка, генетически близких к клону USA1-29. Отличие базового сиквенс-типа ST615 клона USA1-29 от ST2296 составляло один локус (recP), от ST7147, ST7148 - два локуса (gdh, recP и aroE, recP). В то же время ST7147, ST7148 являлись SLV-вариантом для ST2296 по локусам gdh и aroE. Таким образом, ST2296 можно считать основателем подгруппы клонального комплекса СС615. Все культуры исследованной группы штаммов относились к серотипу 1. Штаммы, принадлежащие к сиквенс-типам ST7147 и ST2296, были чувствительны ко всей панели антибиотиков, тогда как штамм ST7148 проявлял устойчивость к эритромицину (МПК > 0,25 мкг/мл) и тетрациклину (МПК > 2 мкг/мл).
Группа из трех штаммов, генетически близких к клону Taiwan19F-14(ST236), состояла из сиквенс-типов ST4311 и ST925, отличающихся от базового сиквенс-типа ST236 по одному локусу (recP), а также из сиквенс-типа ST6955, варианта SLV для ST925 (по локусу ddl) и варианта DLV (по локусам gki и ddl) для базового сиквенс-типа ST236. Это позволяет отнести культуры ST4311, ST925 и ST6955 к одному клональному комплексу СС236. Все исследованные штаммы принадлежат к одному серотипу 19F, однако по отношению к антибиотикам их свойства различаются. Если штамм ST4311 был чувствителен ко всем исследуемым антибактериальным препаратам, а штамм ST925 проявлял умеренную устойчивость к пенициллину (МПК > 0,25 < 0,5 мкг/мл) и был резистентен к эритромицину (МПК > 0,25 мкг/мл), то штамм ST6955 обладал мультирезистентными свойствами. Этот штамм был устойчив к пенициллину (МПК > 1 < 2 мкг/мл), цефо-таксиму (МПК > 0,5 < 1 мкг/мл), эритромицину (МПК > 0,25 мкг/мл) и тетрациклину (МПК > 2 мкг/мл), что совпадает с характеристикой штаммов базового сиквенс-типа ST236 клона Taiwan19F-14.
Как генетически близкий вариант (SLV) клона Columbia5-19 определен ST5088, отличающийся от базового сиквенс-типа ST289 по одному локусу xpt. Штамм сиквенс-типа ST5088 относится к базовому серотипу 5 и был чувствителен к антибиотикам, за исключением тетрациклина (МПК > 2 мкг/мл), что совпадает со свойствами штаммов клона Columbia 5-19, внесенных в международную базу данных.
Ряд штаммов можно считать только вероятными генетическими родственниками международных
генетических клонов, поскольку их отличие друг от друга составляет два локуса из семи. Некоторые из них имели близкие характеристики относительно родственного клона, другие значительно различались. Так, штамм ST6947, DLV-вариант клона Poland6В-20 по локусам gki и ddl, имел серотип и ан-тибиотикограмму, аналогичные базовому сиквенс-типу ST315. Подобное сходство свойств выявлено у штамма ST6863, DLV-варианта клонов Greece6B-22 (по локусам агоЕ, ddl) и Finland6B-12 (по локусам агоЕ, gki). В то же время штамм ST7144, DLV-вариант клона Hungary19A-6 ^Т268) с различием по локусам gki и ddl, не совпадал с ним как по серотипу (у исследуемого штамма серотип 23F), так и по чувствительности к антибиотикам. Он проявлял слабую устойчивость к пенициллину (МПК > 0,13 < 0,25 мкг/мл) и резистентность к тетрациклину (МПК > 2 мкг/мл) при сохранении чувствительности к эритромицину и хлорамфениколу (штаммы клона Hungary19A-6 имеют выраженную мультирезистент-ность). Расхождения в свойствах с родственным клоном выявлены также у штамма ST42, относящегося к DLV-варианту клона Tennessee23F-4 ^Т37) по локусам gki и гесР. Наш штамм сиквенс-типа ST42 (серотип 23А) обладал устойчивостью к тетрациклину (МПК > 2 мкг/мл) при сохранении чувствительности к пенициллину, цефотаксиму и эритромицину, тогда как для штаммов базового сик-венс-типа ST37 клона Tennessee23F-4 (серотип 23F) характерна устойчивость к цефалоспоринам при сохранении чувствительности к пенициллину и тетрациклину. В ряде случаев относительно генетически близкие штаммы, не совпадающие по серотипу, имели чувствительность к антибиотикам, сходную с чувствительностью базовых сиквенс-типов. Такие свойства проявляли штамм ST663 серотипа 19А, DLV-вариант клона Со!итЫа23|:-26 ^Т338) и штамм ST5090 серотипа 18С, DLV-вариант клона Netherlands8-33 ^Т53).
Таким образом, из 100 исследованных штаммов, выделенных от больных пневмококковым менингитом, 35 штаммов состояли в близком (SLV) или относительно близком (DLV) генетическом родстве с 17-ю международными клонами. Из 30 культур, устойчивых хотя бы к одному антибиотику, 14 штаммов были родственны 13-ти международным клонам ^рат23!-1, Tennessee23F-4, Hungary19A-6, Sweden15A-25, Taiwan19F-14, Finland6B-12, Greece6B-22, Poland6B-20, Со1итЫа5-19, Со!итЫа23!-26, Greece21-30, USA1-29, Netherlands3-31).
Группы генетически родственных сиквенс-типов пневмококка, не связанных с международными генетическими клонами, представлены на рисунке 2.
Самую большую группу (группа Б) составили штаммы, объединяющие ST102, ST5090, ST9280, ST7143, ST6954. Наименьшие генетические различия выявлены между ST102 и ST5090 (локус гесР) и между ST102 и ST9280 (локус ddl), тогда как ST7143 и ST5090, ST7143 и ST102 различались
Рисунок 2.
Близкородственные сиквенс-типы пневмококка, не связанные с международными генетическими клонами
А)
Б)
В)
Г)
Д)
Ж)
ST9324 (2,5,29,18,400,3,18) ST1012 (2,5,29,18,42,3,18) ST673 (2,5,29,16,42,3,18)
ST102 (5,13,11,4,15,12,19) ST5090 (5,13,11,16,15,12,19) ST9280 (5,13,11,4,15,12,17)
ST7143 (5,13,11,1,15,79,19) ST6954 (5,322,11,4,15,1,19)
ST239 (15,17,4,16,6,19,17) ST9281(15,12,4,16,6,19,17)
ST2997 (7,5,4,18,5,3,8) ST423 (1,5,4,12,5,3,8) ST9282 (1,2,19,66,15,3,11) ST9274 (1,2,19,66,15,1,18) ST2337 (1,9,53,10,10,28,18) ST7842 (1,9,18,10,10,28,4) ST2331 (10,16,150,1,17,1,29) ST9277 (10,16,29,1,17,1,150)
по двум локусам из семи (гесР и хр^. Сиквенс-тип ST6954 являлся родственным (DLV) для ST102 с отличием по двум локусам - gdh, xpt. Таким образом, можно говорить о формировании генетического комплекса на базе ST102. Все штаммы группы принадлежат к серотипу 18С и были чувствительны ко всем антибиотикам.
Близкое генетическое родство (SLV-вариант) проявляли штаммы, включенные в группу А и В, которые различались между собой по одному локусу.
Группа А объединяла сиквенс-типы ST9324, ST1012 и ST673. Различались ST9324 и ST1012 по локусу spi, а ST1012 и ST673 - по локусу гесР. Штаммы ST9324 и ST1012 принадлежали к сероти-
пу 11А, тогда как штамм ST673 - к серотипу 23А. Все культуры были чувствительны к антибактериальным препаратам.
В группу В входили ST239, ST9281, различающиеся по одному локусу - gdh. Штаммы этой группы принадлежали к серогруппе 9, данных об антибиотикоустойчивости получить не удалось, поскольку культуры были нежизнеспособными.
Штаммы, не совпадающие по двум локусам ал-лельного профиля (DLV-вариант), входили в группы Г, Д, Ж, З. При этом только штаммы группы З ^Т2331, ST9277) принадлежали к одному серотипу 7F и имели сходную антибиотикограмму. В группе Г ^Т2997, ST423) штаммы относились к разным се-
ротипам (14 и 19F) и отличались антибиотикоустойчи-востью (штамм ST423 был устойчив к тетрациклину с МПК > 2 мкг/мл, тогда как ST2997 проявлял чувствительность ко всем препаратам). В группе Д ^Т9282, ST9274) штаммы принадлежали к разным серогру-пам/серотипам (22F и 6АВ), но сравнить антибиоти-кограммы не удалось, поскольку штамм ST9274 был нежизнеспособен. Сходная ситуация наблюдадась в группе Ж ^Т2337 и ST7842), где не удалось определить серотип и чувствительность к антибиотикам у штамма ST2337, так как штамм оказался нежизнеспособен, а его серотип не входил в панель системы генетического определения серотипа.
Среди культур, у которых не обнаруживалось генетических «родственников» и которые были представлены единичными культурами, выявлено 16 резистентных штаммов, из которых ST7840, ST675, ST6956 характеризовались мультирезистентностью.
Наибольшую устойчивость проявлял штамм ST7840 (серотип 14), устойчивый к пенициллину (МПК > 1 < 2 мкг/мл), цефотаксиму (МПК > 0,5 < 1 мкг/мл), эритромицину (МПК > 0,25 мкг/мл) и тетрациклину (МПК >2 мкг/мл). По генетическим характеристикам и отношению к антибиотикам ST7840 близок (вариант SLV) к ST143, получившему широкое распространение в Польше, Германии и Франции. Штаммы ST675 (серотип 6А) и ST6956 (серотип 4) имели менее выраженную резистентность к пенициллину (МПК > 0,5 < 1 мкг/мл и МПК > 0,13 < 0,25 мкг/мл соответственно), оставаясь
чувствительными к цефотаксиму, с устойчивостью к эритромицину (МПК > 0,25 мкг/мл) и тетрациклину (МПК > 2 мкг/мл).
Выводы
1. В популяции инвазивных пневмококков, выделенных от больных при пневмококковом менингите в Москве, наблюдается значительная генетическая гетерогенность.
2. Выявлено пять штаммов пневмококков, принадлежащих к международным генетическим клонам ^рат23р-1, Sweden15A-25, Netherlands15B -37, Netherlands7F-39, Greece21-30) и 35 штаммов, имеющих генетическое родство (SLV или DLV) с международными генетическими клонами Tennessee23F-4, Hungary19A-6, Taiwan19F-14, Finland6B-12, Greece6B-22, Poland6B-20, Со1итЫа5-19, Со1итЫа23|:-26, Sweden15A-25, Netherlands3-31, USA1-29.
3. Из 30 культур, проявляющих устойчивость хотя бы к одному антибиотику (пенициллин, цефо-таксим, эритромицин, хлорамфеникол, тетрациклин), 14 штаммов пневмококков принадлежали или имели генетическое родство (SLV или DLV) с международными генетическими клонами, характеризующимся резистентностью.
4. В популяции выявлены признаки формирования клональных комплексов на базе международных клонов Taiwan19F-4 ^Т236) и USA1-29 ^Т615) с участием сиквенс-типа ST102. Ш
Литература
1. Mera R.M., Miller L.A., Daniels J.J., Well J.G., White A.R. Increasing prevalence of multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae in the United States over a 10-year period: Alexander Project. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2005; 51: 195 - 200.
2. Kislak J.W., Razavi L.M., Daly A.K., Finland M. Susceptibility of pneumococci to nine antibiotics. Am. J. Med. Sci. 1965; 250: 261 - 268.
3. Gartner J.C, Michaels R.H. Meningitis from a pneumococcus moderately resistant to penicillin. JAMA. 1979; 241: 1707.
4. Fenoll A., Jado I., Vicioso D., Perez A., Casal J. Evolution of Streptococcus pneumoniae serotypes and antibiotic resistance in Spain: update (1990 - 1996). J. Clin. Microbiol. 1998; 36: 3447 - 3454.
5. McGee L., McDougal L., Zhou J., Spratt B.J., Tenover F.C., George R. et al. Nomenclature of major antimicrobial-resistant clones of Streptococcus pneumoniae defined by the Pneumococcal Molecular Epidemiology Network. J. Clin. Microbiol, 2001; 39 (7): 2565 - 2571.
6. Enright M.C., Spratt B.G. A multilocus sequence typing scheme for Streptococcus pneumoniae: identification of clones associated with serious invasive disease. Microbiology. 1998; 144: 3049 - 3060.
7. Савинова Т.А., Филимонова О.Ю., Грудинина С.А., Сидоренко С.В. Генетическое разнообразие пенициллинустойчивых Streptococcus pneumoniae. Журнал инфектологии. 2009; 1 (4): 66 - 71.
8. Савинова Т.А. Генетическое разнообразие и молекулярные основы резистентности Streptococcus pneumoniae к ß-лактамным антибиотикам. Дис. ... канд. мед. наук. Москва; 2011: 143.
9. Белошицкий Г.В., Королева И.С., Миронов К.О. Фенотипическая и генотипическая характеристика штаммов пневмококков, выделенных от больных пневмококковым менингитом. КМАХ. 2011; 13 (3): 261 - 266.
10. Slotved H.C., Kaltoft M., Skovsted I.C., Kerrn M.B., Espersen F. Simple rapid latex agglutination test for serotyping of pneumococci (Pneumotest-Latex). J. Clin. Microbiol. 2004; 42 (6): 2518 - 2522.
11. Миронов К.О., Платонов А.Е., Козлов Р.С. Идентификация и серотипирование российских штаммов Streptococcus pneumoniae методом ПЦР. КМАХ; 2011; 13 (4) : 304 - 313.
12. Миронов К.О., Платонов А.Е., Дунаева Е.А., Кусева В.И., Шипулин Г.А. Методика ПЦР в режиме реального времени для определения серотипов Streptococcus pneumoniae. Журн. микробиол. 2014; 1: 41 - 48.
13. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2008, M100 - S18.
References
1. Mera R.M., Miller L.A., Daniels J.J., Well J.G., White A.R. Increasing prevalence of multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae in the United States over a 10-year period: Alexander Project. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2005, 51: 195 - 200.
2. Kislak J.W., Razavi L.M., Daly A.K., Finland M. Susceptibility of pneumococci to nine antibiotics. Am. J. Med. Sci. 1965; 250: 261 - 268.
3. Gartner J.C, Michaels R.H. Meningitis from a pneumococcus moderately resistant to penicillin. JAMA. 1979; 241:1707.
4. Fenoll A., Jado I., Vicioso D., Perez A., Casal J. Evolution of Streptococcus pneumoniae serotypes and antibiotic resistance in Spain: update (1990 - 1996). J. Clin. Microbiol. 1998; 36: 3447 - 3454.
5. McGee L., McDougal L., Zhou J., Spratt B.J., Tenover F.C., George R. et al. Nomenclature of major antimicrobial-resistant clones of Streptococcus pneumoniae defined by the Pneumococcal Molecular Epidemiology Network. J. Clin. Microbiol. 2001; 39 (7): 2565 - 2571
6. Enright M.C., Spratt B.G.. A multilocus sequence typing scheme for Streptococcus pneumoniae: identification of clones associated with serious invasive disease. Microbiology. 1998; 144: 3049 - 3060.
7. Savinova T.A, Filimonov O.J., Grudinina S.A., Sidorenko S.V. Genetic diversity penitsillin resistant Streptococcus pneumoniae. Journal infektologi. 2009; 1 (4): 66 - 71 (in Russian).
8. Savinova T.A. Genetic diversity and molecular basis of resistance of Streptococcus pneumoniae to ß-lactam antibiotics. Doctorate of med. sci. diss. Moscow; 2011: 143 (in Russian).
9. Beloshitsky G.V., Koroleva I.S. Mironov K.O. Phenotypic and genotypic characterization of strains of pneumococci isolated from patients with pneumococcal meningitis. KMAX. 2011; 13 (3): 261 - 266 (in Russian).
10. Slotved H.C., Kaltoft M., Skovsted I.C., Kerrn M.B., Espersen F. Simple rapid latex agglutination test for serotyping of pneumococci (Pneumotest-Latex). J. Clin. Microbiol. 2004; 42 (6): 2518 - 2522.
11. Mironov K.O., Platonov A.E., Kozlov R.S. Identification and serotyping Russian strains of Streptococcus pneumoniae by PCR. KMAX; 2011; 13 (4): 304 - 313 (in Russian).
12. Mironov K.O., Platonov A.E., Dunaeva E.A., Kuseva V.l., Shipulin G.A. Methods PCR in real time opreedelniya serotypes of Streptococcus pneumoniae. Zhurn. mikrobiol. 2014; 1: 41 - 48 (in Russian).
13. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2008: M100 - S18.
Эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика клещевых трансмиссивных инфекций человека на территориях с различной степенью риска заражения населения
Н.В. Рудаков, В.К. Ястребов, С.А. Рудакова (rickettsia@mail.ru) ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора
Резюме
Проведен анализ эпидемиологической ситуации по клещевым трансмиссивным инфекциям человека в Российской Федерации. Наличие общих переносчиков различных патогенов обусловливает широкую распространенность сочетанных природных очагов клещевых инфекций. Обоснован комплексный подход к эпидемиологическому надзору, лабораторной диагностике и профилактике клещевых инфекций с учетом степени риска заражения населения.
Ключевые слова: природно-очаговые инфекции, иксодовые клещи, эпидемиология, профилактика, лабораторная диагностика
Epidemiology, Laboratory Diagnosis and prevention of Transmissible Tick-Borne Infections in the Areas with Varying Risk of Human infection
N.V. Rudakov, V.K. Yastrebov, S.A. Rudakova (rickettsia@mail.ru)
Federal Budgetary Institution of Science «Omsk Research Institute of Natural Foci Infections» of Federal Service on Customers' Rights
Protection and Human Well-Being Surveillance
Abstract
Analysis of the epidemiology of tick-borne human infections held in the Russian Federation. The presence of common vectors of various pathogens determines the high prevalence combined natural foci of tick-borne infections. Complex approach to surveillance, laboratory diagnosis and prevention of tick-borne infections justified taking into account the degree of risk of infection of the population. Key words: natural focal infections, ticks, epidemiology, prevention, laboratory diagnostics
Введение
С иксодовыми клещами связаны существование и передача человеку возбудителей заболеваний вирусной, риккетсиозной, бактериальной и прото-зойной этиологии. Огромные территории РФ являются ареалом клещей Ixodes persulcatus - основных переносчиков вируса клещевого энцефалита (КЭ), патогенных для человека боррелий, риккетсий (R. tarasevichiae, R. helvetica), анаплазм и эрлихий, бартонелл, бабезий - и характеризуются сочетан-ностью природных очагов трех и более трансмиссивных инфекций [1 - 6].
Основные переносчики R. sibirica и других патогенных риккетсий - клещи родов Dermacentor и Haemaphysalis.
К возбудителям природно-очаговых инфекций трансмиссивной природы, распространенным
в России, относятся: флавивирусы млекопитающих, передаваемые клещами (вызывают клещевой энцефалит - КЭ, омскую геморрагическую лихорадку - ОГЛ и др.), буньявирусы (вызывают Крым-скую-Конго геморрагическую лихорадку), представители порядка Rickettsiales, боррелии (вызывают иксодовый клещевой боррелиоз - ИКБ), возбудители туляремии и протозойных заболеваний.
Цели данной работы - характеристика динамики заболеваемости населения клещевым энцефалитом, иксодовыми клещевыми боррелиозами и клещевым риккетсиозом (КР) в России, территориального распространения этих инфекций, определение критериев эндемичности территорий и степени риска заражения населения; а также совершенствование профилактики.
