CC BY
23
27. Van Loo I.H.M., van der Heide G.J., Nagelkerke N.J.D. et al. Temporal trends in the population structure of Bordetella pertussis during 1949 - 1996 in a highly vaccinated population // J. Infect. Dis. 1999. V. 179. P. 915 - 923.
28. Van Rie A., Hethcote H.W. Adolescent and adult pertussis vaccination: computer simulations of five new strategies // Vaccine. 2004. V. 22. P. 3154 - 3165.
29. Wardlaw B.C., Parton R., Hooker M.J. Loss of protective antigen, histamine-sensitizing factor and envelope polypeptides in cultural variants of Bordetella pertussis // J. Med. Microbiol. 1976. V. 9. P 89 - 100.
30. Weber C., Boursaux-Eude C., Coralie G. et al. Polymorphism of Bordetella pertussis isolates circulating for the last 10 years in France, where a single effective whole-cell vaccine has been used for more than 30 years // J. Clin. Microbiol. 2001. P. 4396 - 4403.
31. Zhang L., Xu Y., Zhao J. et al. Effect of vaccination on Bordetella pertussis strains, China // Emerg. Infect. Dis. 2010. V. 16 (11). P. 1695 - 1701.
32. http://www.who.int/immunization/sage/meetings/2012/-November/en/index.html.
Генетические основы аттенуации холодоадаптированного штамма А(Н2N2)/ Краснодар/101/35/59 - донора для живых гриппозных вакцин
А.В. Терехов (tor4911@yandex.ru), Т.М. Цфасман (tanya.tsfasman@gmail.com), С.Г. Маркушин (s.g.markushin@rambler.ru), И.Б. Коптяева, К.В. Лисовская, Н.В. Кост
ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, Москва (instmech@iitp.ru)
Резюме
Исследовали ts- и са-фенотипы одногенных и полигенных реассортантов, полученных с помощью методов обратной генетики между холодоадаптированным (ХА) вакцинным штаммом А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59 вируса гриппа и вирулентным штаммом вируса гриппа A(H1N1)/WSN/33. Показано, что полученные реассортанты различались по своему ts-фенотипу. В этой связи появляется возможность распределения их в несколько групп. В группу I попадают реассортанты, не отличающиеся по своему ts-фенотипу от вирулентного штамма. В группу II можно включить реассортанты, по своему ts-фенотипу тождественные ХА-вакцинному штамму. В группу III попадают реассортанты с промежуточными характеристиками. Анализ одногенных и полигенных реассортантов позволяет сделать вывод, что РВ1-ген и NS-ген ХА-штамма А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59 содержат ключевые детерминанты, определяющие ts-фенотип данного вакцинного штамма. Полученные данные также позволяют выдвинуть предположение о том, что для активного размножения ХА-штамма при 25 0С (са-фенотип) необходимо, по-видимому, участие большей части, если не всей совокупности, мутантных вирусных белков.
Ключевые слова: вирус гриппа типа А, одногенные и полигенные реассортанты, ts-фенотип, са-фенотип, обратная генетика
Genetic Basis of Attenuation of Cold-Adapted Strain A(N2N2)/Krasnodar/101/35/59 - Donor for Living Influenza Vaccines
АМ. Terekhov (tor4911@yandex.ru), Т.М. Tsfasman (tanya.tsfasman@gmail.com), S.G. Маrkushin (s.g.markushin@rambler.ru), I.B. Коptayeva, K.V. Lisovskaya, N.V. Коst
Federal State Budgetary Institution «I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera» of Russian Academy of Medical Sciences,
Moscow (instmech@iitp.ru)
Abstract
We have investigated the ts- and ca-phenotypes of single- and polygenic reassortants between the cold-adapted (CA) vaccine A(H2N2)/Krasnodar/101/35/59 strain and the virulent A(H1N1)/WSN/33 strain, obtained with the help of plasmids technology. It was shown, that the ts-phenotype of reassortants was different. This permits us to assign these reassortants to several groups. Group I contains viruses which exhibited wild type traits. Group II is composed of reassortants, which displayed the ts-phenotype. Group III consists of reassortants with intermediated characteristics of ts-phenotype.
The analysis of single- and polygenic reassortants allowed us to make the conclusion that PBl-gene and NS-gene of the СА A(H2N2)/ Krasnodar/101/35/59 contain crucial determinants, responsible for the ts-phenotype of this vaccine strain. The data obtained allow us to make a suggestion, that the combination of all the mutant virus-specific proteins is responsible for active reproduction of cold-adapted vaccine strain at 25 0C (ca-phenotype).
Key words: influenza virus A, single- and polygenic reassortants, ts-phenotype, ca-phenotype, reverse genetics
Введение
Создание живых гриппозных вакцин связано с разработкой холодоадаптированных (ХА) штам-
мов - доноров аттенуации A(H2N2)^hh Арбор /6/60 и А(Н2N2)/Ленинград/134/17/57 [5, 9, 11]. Аттенуационный фенотип этих штаммов обусловлен
наличием мутаций в шести РНК-сегментах генома вируса, кодирующих «внутренние» белки и ответственных за {э-фенотип (температурочувствитель-ный маркер), са- (способность к холодоадаптации) и аН-признак (авирулентность), которые определяют в целом аттенуацию вируса.
Отдельные недостатки ХА-штамма-донора А(Н2N2)/Ленинград/134/17/57 [2] (гетерогенность популяции, реактогенность для детей младшего возраста) вызвали необходимость в создании нового штамма-донора. В НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (Москва) был получен новый штамм-донор А(Н2N2)/Крас-нодар/101/35/59. Кроме того, были выявлены мутации в РНК-сегментах его генома, кодирующих «внутренние» белки [1, 4]. Данный штамм приобрел 13 нуклеотидных замен во всех внутренних генах, кроме гена, кодирующего белки NS1 и NS2, восемь из которых привели к изменению аминокислот в белках РВ2, РВ1, РА, NP, М1 и М2 (табл. 1).
При этом все предсказанные по нуклеотидной последовательности ХА-штамма аминокислотные замены уникальны для данного штамма среди всех последовательностей нуклеотидов всех штаммов вируса гриппа типа А человека, представленных в базе данных GenBank. Вместе с тем ответственность отдельных кодирующих мутаций в геноме штамма А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59 за проявление {е-, са-, аН-фенотипов штамма остается неизученной.
Цель данной работы - попытаться на модели одногенных и полигенных реассортан-тов между штаммом-донором А(Н2N2)/Крас-нодар/101/35/59 и вирулентным штаммом А(H1N1)/WSN/33, полученных с помощью методов обратной генетики, определить роль отдельных мутаций в РНК-сегментах генома штамма-до-
нора, кодирующих отвечающих за формирование ts- и са-фенотипов «внутренние» белки вируса.
Материалы и методы
Вирусы
В работе были использованы холодоадаптирован-ный штамм-донор аттенуации для живых гриппозных вакцин А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59 (получен методом серийных пассажей в куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK при постепенно снижающейся температуре инкубации с последующим трехкратным клонированием методом бляшек в культуре клеток MDCK [4]) и вирулентный штамм A(H1N1)/WSN/33, а также реассортанты, полученные с помощью плаз-мидной технологии между этими двумя штаммами в лаборатории генетики РНК-содержащих вирусов НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.
Все использованные в работе вирусы поддерживали путем пассажей в 10 - 11-дневных куриных эмбрионах. Активность репродукции вирусов гриппа при разной температуре инкубации оценивали по результатам титрования в куриных эмбрионах, инкубированных при 34, 38 и 25 0С, и выражали в RCT (reproductive capacity at different temperatures - репродуктивная способность при различных температурах). RCT25 = lg ЭИД50/0,2 мл при 34 0С - lg ЭИД50/0,2 мл при 25 0С; RCT38 = lg ЭИД50/0,2 мл при 344 0С - lg ЭИД50/0,2 мл при 38 0С. В куриных эмбрионах инкубировали в течение 48 часов при 34 и 38 0С и в течение пяти суток - при 25 0С. Вирусы считали температурочувстви-тельными (ts-фенотип), если RCT38была не менее 5,0 lg ЭИД50/0,2 мл, и холодоадаптированными, если их RCT25 не превышала 3,0 lg ЭИД50/0,2 мл (са-фенотип).
Культуры клеток
В опытах по трансфекции использовали клетки 293Т и линию клеток MDCK, полученную из Инсти-
Таблица 1.
Мутационные изменения холодоадаптированного штамма А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59
Ген (длина) Белок Нуклеотидные замены Замены аминокислот
позиция дикий тип ХА-штамм позиция дикий тип ХА-штамм
1 (2341) РВ2 841 1494 1500 GUA UUC GCG UUA UCU GCA 290 Val Leu
2 (2341) PB1 464 1983 AUA AAA ACA AAG 147 Ile Thr
3 (2233) PA 597 927 2145 UUU GGG UUC UUC GGA UUA 707 Phe Leu
5 (1565) NP 1151 1343 GAA UGC GUA UGU 369 433 Glu Ala Val Val
7 (1027) M1 M2 332 413 837 CUU CUC AUU AUU AUC GUU 103 130 42 Leu Leu Ile Ile Ile Val
8 (890) NS1 NS2 - - - - - -
тута Пастера (Франция). Все клетки выращивались при 37 0С в СО2-инкубаторе. Клеточные культуры пассировались на среде МЕМ (производства «ПанЭко», Москва), содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки.
Накопление и концентрирование вирусов
В экспериментах использовали плазмиду pHW2000 [7], разработанную для получения вируса гриппа методом обратной генетики. Плазмида pHW2000, а также плазмиды со вставками генов штамма вируса гриппа A(H1N1)/WSN/33 были любезно предоставлены доктором Р.Г. Вебстером (г. Мемфис, США). Для накопления плазмид использовали штамм E. coli DH5-alpha.
Вирусы накапливали в куриных эмбрионах по стандартной методике. Для последующего выделения РНК вирусы концентрировали центрифугированием. Вначале аллантоисную жидкость осаждали в центрифуге Beckman J2-21 (ротор JA-14) при 6000 об./мин в течение 30 мин для осаждения клеточного дебриса. Вирус осаждали из надосадочной жидкости в высокоскоростной центрифуге Beckman J2-21 c использованием ротора JA-14 (14 000 об./мин, 2,5 часа). Осадок вири-онов ресуспендировали в буфере STE (10 мМ TrisHCL, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA; pH 7,4) в гомогенизаторе Даунса.
Выделение РНК
Для последующей постановки ПЦР выделяли вирусную РНК при помощи Набора для выделения РНК из плазмы и сыворотки крови (ООО «Лаборатория Изоген», Москва). ПЦР ставили с высокоточной полимеразой Tersus (ЗАО «Евроген», Москва) в соответствии с рекомендациями производителя. Очистку полученных ПЦР-продуктов из легкоплавкой агарозы осуществляли при помощи набора компании Fermentas (Канада).
ОТ-ПЦР
Обратную транскрипцию ставили отдельно от ПЦР, при помощи ревертазы M-MuLV («СибЭнзим», г. Новосибирск) в соответствии с рекомендациями производителя.
Клонирование в E. coli
Опыты по клонированию (работа с бактериями, рестрикция, лигирование и т.п.) проводились по стандартным методикам [3] или в соответствии с рекомендациями производителя для соответствующих ферментов (Т4-лигаза, рестриктазы Esp3I и Eco31I).
Секвенирование
Секвенирование вставок в полученных плазми-дах проводилось в ЗАО «Евроген» на автоматическом секвенаторе MegaBACE-500.
Трансфекция
Трансфекцию осуществляли при помощи реагента Lipofectamine LTX (корпорация Invitrogen,
США) либо в кокультуре клеток 293Т и MDCK по методике, описанной ранее [7], либо в однодневном монослое клеток 293Т (плотность клеточного монослоя - около 70%) в соответствии с методикой, прилагаемой к реагенту Lipofectamine LTX.
В качестве отрицательного контроля использовали монослой клеток с добавлением липофектамина и без добавления плазмид. В качестве положительного контроля к культуре клеток добавляли восемь плазмид, содержащих все гены исходного штамма A(H1N1)/WSN/33. В ряде экспериментов через 48 часов после трансфекции материал вводили в куриные эмбрионы. Клетки снимали трипсином, после чего вводили по 0,5 мл неразведенной суспензии в куриные эмбрионы, в которых через 48 часов определяли гемагглютинирующий титр вируса.
Получение реассортантов между вирулентным штаммом A(H1N1)/WSN/33 и ХА-штаммом А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59
Реассортанты были получены методом трансфекции кокультуры клеток 293Т и MDCK-плазмидами, содержавшими различные наборы восьми генов двух штаммов. Все реассортанты имели гены, кодирующие поверхностные белки, от штамма A(H1N1)/ WSN/33. Через 18 часов после трансфекции среду Опти-МЕМ в лунках заменяли на среду МЕМ с добавлением трипсина Sigma (2 мкг/мл). Через 48 часов после трансфекции определяли цитопатический эффект в клеточной культуре и гемагглютинирующий титр вируса в культуральной жидкости. В ряде случаев клетки снимали трипсином, после чего вводили по 0,5 мл суспензии клеток в куриные эмбрионы, в которых через 48 часов определяли гемагглютинирующий титр вируса в куриных эмбрионах. Для получения панели одногенных и полигенных реассортантов, которые содержали различные комбинации РНК-сегментов, полученных от штаммов A(H1N1)/ WSN/33 и А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59, были использованы методы обратной генетики.
Результаты и обсуждение
На рисунке 1 представлены результаты электрофореза плазмид pHW2000 со вставленными «внутренними» генами (PB2, PB1, PA, NP, M, NS), а также генами, кодирующими поверхностные белки ви-риона, ХА-штамма А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59 в 1,5%-ном агарозном геле. Гены, включенные в плазмиды, были подвергнуты секвенированию с целью подтверждения присутствия выявленных ts-мутаций и обнаружения посторонних мутаций. Все полученные одногенные и полигенные реас-сортанты активно реплицировались в куриных эмбрионах, что дало возможность исследовать различные характеристики этих реассортантов.
Изучение ts- и са-фенотипа одногенных реассортантов
Ts-фенотип является одной из главных генетических детерминант ХА-штаммов-доноров
Рисунок 1.
Электрофорез плазмид pHW2000 с включением генов ХА-вакцинного штамма А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59 в 1,5%-ном агарозном геле
1
12 34 567 8 9 10
Обозначения: 1, 2 - маркеры молекулярного веса ДНК; плазмиды pHW2000 с включением генов, кодирующих белки: 3- РВ2,
4- РВ1, 5- РА, 6- NP, 7- М1/М2, 8- NS1/NS2, 9-- НА, 10- NA
аттенуации, которая ограничивает размножение и распространение вакцинного вируса за пределы верхних отделов респираторного тракта [11]. Исходный вирулентный штамм А(H1N1)/WSN/33 обладал одинаковой репродуктивностью в куриных эмбрионах при 34 и 38 0С и не размножался при 25 0С. С другой стороны, вакцинный штамм - донор аттенуации А(Н2N2)/Красно-дар/101/35/59 достаточно хорошо размножался в куриных эмбрионах при 34 и 25 0С, но не размножался при 38 0С. Как видно из таблицы 2, включение единичных РНК-сегментов из генома ХА-штамма А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59, кодирующих белки РВ1 и NS1/NS2, в геном штамма А(Н2N2)/WSN/33 приводило к появлению реассортантов, не способных размножаться при 38 0С (реассортант 6) либо обладающих в этих условиях очень слабым размножением (реассор-тант 2). Включение единичных РНК-сегментов из генома вакцинного штамма, кодирующих белки РВ2, NP и РА, в геном штамма А(H1N1)/WSN/33
приводило к появлению вирусов, не отличающихся по {э-фенотипу от вирулентного штамма. Включение единичного РНК-сегмента из генома штамма А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59, кодирующего белки М1/М2, приводило к появлению реассортантов с промежуточными характеристиками.
При изучении са-признака исследуемых вирусов было установлено, что вирулентный штамм А(H1N1)/WSN/33 практически не размножался при 25 0С, в то время как ХА-штамм А(Н2N2)/Крас-нодар/101/35/59 активно размножался при данной температуре до титров 105,5 - 106 ЭИД50/0,2 мл. Как видно из таблицы 2, все полученные одно-генные реассортанты характеризовались слабым размножением при 25 0С, не превышая титров 101 - 1015 ЭИД50/0,2 мл. Полученные факты позволяют предположить, что формирование са-признака ХА-штаммов зависит от активности целой группы генов, а может быть, от активности всего их генома.
Таблица 2.
Изучение ts- и са-фенотипов одногенных реассортантов между штаммами вируса гриппа А(Н1N1)/WSN/33 и ХА-А(Н2^)/Краснодар/101/35/59
Исходные вирусы и реассортанты Генотип реассортанта Титр вируса lg ЭИД50/0,2 мл
34 0С 38 0С 25 0С фенотип
А(Н1Ш)^^33 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 6,5 ± 0,5 6,25 ± 0,4 1,0 -
А(H2N2)/Краснодар/101/35/59 PB2* PB1 PA HA NP NA M NS 6,0 ± 0,5 < 1,0 5,5 ± 1,0 ts, ca
1 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 5,0 ± 0,5 4,5 ± 0,5 < 1,0 -
2 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 6,5 ± 0,32 1,5 ± 0,4 1,5 ± 0,4 ts
3 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 6,25 ± 0,25 6,5 ± 0,28 1,5 ± 0,4 -
4 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 5,75 ± 0,74 6,0 ± 0,86 < 1,0 -
5 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 4,75 ± 0,25 3,75 ± 0,2 < 1,0 -
6 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 5,5 ± 0,4 < 1,0 1,5 ± 0,57 ts
"РНК-сегменты генома А(H1N1)/WSN/33 - выделены черным шрифтом, РНК-сегменты генома А(Н2Ш)/Краснодар/101/35/101 - зеленым шрифтом.
Изучение ts- и са-фенотипов полигенных реассортантов
Включение большего количества РНК-сегментов из генома ХА-штамма А(Н2N2)/Красно-дар/101/35/59 в геном штамма А(H1N1)/WSN/33 приводило к появлению большего числа реассор-тантов, обладавших ts-фенотипом, а также его большей выраженностью. Так, как видно из таблицы 2, одногенный реассортант 2 с включением РВ1-гена от ХА-штамма имел титр при непермис-сивных условиях 101,5 ЭИД50/0,2 мл. Дополнительное включение РВ2-гена и РА-гена от ХА-штамма в геном этого реассортанта, как видно из таблицы 3, полностью прекращало размножение реассортанта при 38 0С. Изучение полигенных реассортантов позволило лучше выявить вклад каждого РНК-сегмента генома ХА-штамма А(Н2N2)/Красно-дар/101/35/59 в формирование ts-фенотипа.
В таблице 3 показано, что дополнительное включение РВ1-гена из генома ХА-штамма А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59 в состав генома полигенных реассортантов 7, 9, 15 (РВ2 - РВ1 -РА, РВ1 - РА, РВ2 - РВ1) имело следствием формирование у данных реассортантов выраженного ts-фенотипа. К аналогичному эффекту (см. табл. 3) приводило дополнительное включение NS-гена из генома ХА-штамма в состав полигенных реассортантов 10, 12, 13 ^Р - NS, М - NS, РА - NS). При изучении одногенных реассортантов нами было показано, что включение РНК-сегментов, кодирующих белки РВ2 и NP, не приводит к формированию ts-фенотипа у данных реассортантов (реассортанты 1, 4). Отсутствие ts-фенотипа у полигенного реассортанта 8 (РВ2 - NP) подтверждает наш вывод об отсутствии мутаций, ответственных за ts-фенотип, в РНК-сегментах генома ХА-штамма
А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59, кодирующих белки РВ2 и NP.
Одногенный реассортант (см. табл. 2), имеющий М-ген от ХА-штамма, обладал несколько сниженным размножением при 38 оС. Полигенный реассортант 11 с включением М-гена и NP-гена от ХА-штамма также обладал сниженным размножением при непермиссивной температуре. Можно предположить, что конформационные изменения мутантного М-белка ХА-штамма влияют на стабильность NP-белка у реассортанта 11, приводя к снижению его репродуктивной активности при 38 оС. Мы попытаемся исследовать влияние мутантного М-белка ХА-штамма на ts-фенотип других полигенных реассортантов в ближайшем будущем.
7в- и са-фенотипы ХА-штамма А(Н2N2)/Красно-дар/101/35/59 могут быть обусловлены мутациями в генах, кодирующих поверхностные белки ви-риона - гемагглютинин и нейраминидазу. С целью выяснения этого вопроса нами были получены реассортанты между штаммами А(H1N1)/WSN/33 и А(H2N2)/Краснодар/101/35/59, которые включали единичные гены, кодирующие НА- или NA-белки ХА-штамма. Как видно из таблицы 4, оба реассор-танта по ts- и са-фенотипам не отличались от вирулентного штамма А(H1N1)/WSN/33. Из этого факта можно сделать вывод, что ts- и са-фенотипы ХА-штамма А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59 обусловлены только мутациями, локализованными в генах, кодирующих «внутренние» белки вириона данного штамма.
Данное изучение было проведено с целью выявить генетические основы аттенуации ХА-штамма А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59. Ранее сходные исследования были проведены на модели ХА-штаммов A(H2N2)/Энн Арбор/6/60, А(Н2N2)/Ленин-
Таблица 3.
Изучение ts- и са-фенотипов полигенных реассортантов между штаммами вируса гриппа А(Н1N1)/WSN/33 и А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59
Исходные вирусы и реассортанты Титр вируса (lg ЭИД50/0,2 мл)
генотип реассортанта* 34 0С 38 0С 25 0С фенотип
А(Н1Ш)^^33 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 6,5 ± 0,5 6,25 ± 0,4 < 1,0 -
А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 6,0 ± 0,5 < 1,0 5,5 ± 1,0 ts
7 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 6,5 ± 0,24 < 1,0 2,5 ± 1,0 ts
8 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 6,0 ± 0,56 4,25 ± 1,0 < 1,0 -
9 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 6,0 ± 0,5 1,0 1,5 ± 0,4 ts
10 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 5,5 ± 0,75 < 1,0 < 1,0 ts
11 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 5,0 ± 1,0 3,75 ± 0,75 < 1,0 -
12 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 5,5 ± 0,78 < 1,0 < 1,0 ts
13 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 5,5 ± 0,75 < 1,0 < 1,0 ts
14 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 5,25 ± 0,2 < 1,0 1,5 ± 0,4 ts
15 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 5,5 ± 0,75 < 1,0 < 1,0 ts
*РНК-сегменты генома А(H1N1)/WSN/33 - черным шрифтом, РНК-сегменты генома А(Н2Ы2)/Краснодар/101/35/101 - зеленым шрифтом
Таблица 4.
Изучение ^- и са-фенотипов реассортантов между штаммами вируса гриппа А(H1N1)/WSN/33 и ХА-А(Н2N2)/ Краснодар/101/35/59, унаследовавших единичные гены, кодирующие НА- и NA-белки ХА-штамма А(Н2N2)/ Краснодар/101/35/59
Исходные вирусы и реассортанты Генотип реассортанта Титр вируса (lg ЭИД50/0,2 мл)
34 0С 38 0С 25 0С фенотип
A(H1N1)/WSN/33 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 6,5 ± 0,5 6,25 ± 0,4 1,0 -
А(H2N2)/Краснодар/101/35/59 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 6,0 ± 0,5 < 1,0 5,5 ± 1,0 ts, ca
16 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 6,0 ± 0,5 6,0 ± 0,5 1,0 -
17 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 5,0 ± 0,4 5,5 ± 0,5 1,0 -
РНК-сегменты генома А(H1N1)/WSN/33 - выделены черным шрифтом, РНК-сегменты генома А(Н2N2)/Краснодар/101/35/101 - зеленым шрифтом
град/134/17/57, A(H3N2)/Сидней/5/97, ^1682-TS1(H1N1), ^1682^2 [2, 6, 10, 14]. При этом было показано, что гены, кодирующие белки РВ2, РВ1 и NP, являются ключевыми детерминантами для формирования {э-, са- и а{{-фенотипов. Однако в отношении роли других «внутренних» генов ХА-штаммов имеются значительные разногласия. Так, мнения авторов о роли NS-гена в атте-нуации ХА-реассортантов вируса гриппа А являются далеко не однозначными [2, 7, 8, 14, 15]. Изучение характеристик одногенных по NS-гену реассортантов между ХА-штаммом А(Н2N2)/Ле-нинград/134/17/57 и вирулентными штаммами А(Н3N2)/Панама/2007/99 и А(Н3N2)/Аиши/2/69 продемонстрировало, что включение в геном вирулентного штамма NS-гена от ХА-штамма - донора аттенуации не изменяло его фенотипические характеристики [2]. С другой стороны, имеются веские доказательства в пользу важного значения NS-гена в проявлении вирулентности штаммов вируса гриппа [8]. Вклад М-гена, унаследованного от ХА-вакцинного штамма, в формирование аттенуи-рующего фенотипа реассортантов также не является однозначным [12, 14].
Анализ одногенных реассортантов (см. табл. 2) показал, что перенос РВ1-гена или NS-гена ХА-штамма в геном вируса A(H1N1)/WSN/33 приводил к значительному снижению репродукции соответствующих одногенных реассортантов при 38 0С ({э-фенотип). Включение РВ1-гена и NS-гена из генома ХА-штамма в состав полигенных реассортантов также приводило к снижению репродукции этих реассортантов при непермис-сивных условиях (см. табл. 3).
Обзор характеристик полигенных реассортан-тов показывает, что любое включение комбинации генов ХА-штамма - донора аттенуации, в состав которой входят РВ1-ген или NS-ген, вызывает повышение экспрессии {э-фенотипа.
Полученные результаты позволяют сделать вывод, что РВ1-ген и NS-ген ХА-штамма А(Н2N2)/ Краснодар/101/35/59 содержат ключевые детерминанты, определяющие {э-фенотип данного ХА-штамма. В этом отношении штамм отличается от хорошо изученных штаммов - доноров аттену-
ации A(H3N2)^hh Арбор/6/60 и А(Н2N2)/Ленин-град/134/17/57, у которых детерминанты, определяющие ts-фенотип и са-фенотип, связаны с генами, кодирующими РВ1- и РВ2-белки. Можно предположить, что это различие обусловлено дополнительным пассированием ХА-штамма в клеточной культуре MDCK.
Поскольку полученные нами реассортанты значительно различались по своему ts-фенотипу, возникала возможность их распределения в несколько групп. В группу I попадали реассортанты, не отличающиеся по своему ts-фенотипу от вирулентного штамма. Реассортанты, по своему ts-фенотипу тождественные ХА-вакцинному штамму, были отнесены в группу II. Реассортанты с промежуточными характеристиками вошли в группу III. Большой интерес представляет изучение att-фенотипа реассортантов, входящих в каждую группу.
Следует отметить, что Ch.L. Parks с соавт. [14] при анализе реассортантов между вирулентным штаммом A(H3N2)/Сидней/5/97 и полученным из него ХА-аттенуированным вакцинным штаммом обнаружили, что перенос единичного гена от вакцинного штамма в геном вирулентного штамма ни в одном случае не приводил к превращению дикого вируса в штамм, обладающий ts-фенотипом. Такой эффект достигался только включением по крайней мере двух генов ХА-вакцинного штамма в геном дикого вируса. Можно предположить, что эти различия с нашими данными обусловлены тем, что мы использовали систему получения реассортан-тов между генетически удаленными друг от друга штаммами вируса гриппа. Это обстоятельство, по-видимому, объясняет и сравнительно невысокую степень размножения некоторых наших реассор-тантов в куриных эмбрионах и назальном эпителии мышей.
Штамм А(H1N1)/WSN/33 крайне слабо размножался при 25 0С, в то время как ХА-штамм - донор аттенуации активно реплицировался при данной температуре, достигая титров в КЭ 1055 - 106 ЭИД50/0,2 мл. Одногенные реассор-танты либо совсем не размножались при данной температуре, как видно из таблицы 2, либо размножались крайне слабо. Слабым размножени-
ем при 25 0С характеризовались и все полигенные реассортанты, унаследовавшие любые два гена от вакцинного штамма. Только полигенный реассортант 7, унаследовавший РВ1-, РВ2- и РА-гены от вакцинного штамма, размножался при 25 0С до титров 1025 ЭИД50/0,2 мл. Полученные данные позволяют предположить, что для активного размножения ХА-штамма при 25 0С необходима, по-видимому, вся совокупность мутантных вирусных белков вириона.
Выводы
1. Анализ одногенных и полигенных реассортан-тов позволяет сделать вывод, что РВ1-ген и NS-
ген ХА-штамма А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59 содержат ключевые детерминанты, определяющие его ts-фенотип.
2. Исходя из полученных данных, можно предположить, что для активного размножения ХА-штамма при 25 0С (са-фенотип) необходима функциональная активность большей части, если не всей совокупности, мутантных белков ХА-штамма.
3. Полученные факты свидетельствуют об отсутствии мутаций, ответственных за формирование ts-фенотипа, в генах ХА-штамма А(Н2N2)/ Краснодар/101/35/59, кодирующих поверхностные белки НА и NA. Ш
Литература
10.
11. 12.
13.
14.
15.
Гендон Ю.З., Маркушин С.Г., Цфасман Т.М. и др. Новые холодоадаптированные штаммы - доноры аттенуации для живых вакцин против гриппа // Вопр. вирусол. 2013. № 1. С. 11 - 17.
Киселева И.В. Основы аттенуации вируса гриппа: Дис. ... д.б.н. - СПб., 2001.
Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984. - 479 с.
Патент РФ № 2 354 695 «Аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа А(Н2Ы2)/Краснодар/101/35/59 для получения штаммов
живой интраназальной гриппозной вакцины». Опубликовано 10.07.2007 года.
Alexandrova G.I., Smorodintsev A.A. Obtaining of an additionally attenuated vaccinating cryophil influenza strain // Rew. Roum. D'Inframicrobiol. 1965. V. 40. R 179 - 186.
Bin Zhou, Yan Li, Speer S.D. et al. Engineering temperature sensitive live attenuated influenza vaccines from emerging viruses // Vaccine. 2012. V. 30. P. 6341 - 6349.
Egorov A., Brandt S., Sereinig S. et al. Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells // Virol. 1998. V. 72. P. 6437 - 6441.
Garcia-Sastre A., Egorov A., Matassov D. et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems // Virol. 1998. V. 252. P. 324 - 330.
Hoffmann E., Krauss S., Perez D. et al. Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines // Vaccine. 2002. V. 20. R. 3165 - 3170. Jin H., Lu B., Zhou H. et al. Multiple aminoacid residue confer temperature sensitivity to human influenza virus strains (Flumist) derived from cold-adapted A/Ann Arbor/6/60 // Virol. 2003. V. 306 (1). R. 18 - 24.
Maassab H.F. Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees // C. Nature. 1967. V. 213 (76). R. 612 - 614.
Medvedeva T.E., Romanova J.R., Gushchina M.I. et al. The ts-phenotype of reisolates from children inoculated with live cold-adapted influenza vaccine
type A // Вопросы вирусологии. 1990. № 2. С. 101 - 105.
Murphy B.R., Coelingh K. Principles underlying the development and use of live cold-adapted influenza A and B virus vaccines // Viral Immunol. 2002. V. 15 (2). R. 295 - 323.
Parks Ch.L., Latham Th., Cahill A. et al. Phenotypic properties resulting from directed gene segment reassortment between wild-type A/Sydney/5/97 influenza virus and the live attenuated vaccine strain // Virol. 2007. V. 367. P. 275 - 287.
Snyder M.H., Betts R.F., DeBorde D. et al. Four viral genes independently contribute to attenuation of live influenza A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) cold-adapted reassortant virus vaccines // Virol. 1988. V. 62 (2). P. 488 - 495.
ИНФОРМАЦИЯ РОСПОТРЕБНАДЗОРА
О дополнительных мероприятиях по профилактике распространения кори
Письмо от 07.06.2013 № 01/6510-13-32 (с сокращениями)
< ... > В апреле - начале июня 2013 г. в ряде регионов страны отмечается активизация эпидемического процесса кори, о чем свидетельствует регистрация групповых очагов заболеваний.
В частности, в г. Рязани 1-6 июня зарегистрирован очаг среди непривитого цыганского населения (18 случаев, в т.ч. 16 детей), мигрирующего между городами Москва, Рязань, Бронницы Московской области и Рыбинск Ярославской области. Сформировано 2 семейных очага и очаг в общежитии с числом контактных 93 человека.
В Саратовской области в апреле-мае выявлено 39 больных корью, в т.ч. 14 - завозных (из Франции, Москвы, Санкт-Петербурга, Грузии, Азербайджана) и 5 случаев - среди цыганского населения, прибывшего в область из Москвы.
В Московской области 2 групповых очага в 2-х ЛПО с общим числом заболевших 20 человек, из них, непривитые дети - 15 человек (в т.ч. до 1 года - 9 детей и 5 взрослых). В одном случае источник инфекции ребенок из семьи цыган, в другом - из семьи иностранных рабочих.
В целях профилактики кори, в том числе предотвращения завоза и распространения случаев кори в учреждениях отдыха и оздоровления детей, предлагаю обеспечить:
1. Своевременное выполнение полного комплекса сани-тарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий по каждому случаю кори.
2. Организацию иммунизации труднодоступных и кочующих групп населения.
3. Выявление и иммунизацию лиц, подвергшихся риску заражения, обратив особое внимание на детей, медицинских работников, работников сферы обслуживания, торговли, общественного питания.
4. Ограничение (до завершения инкубационного периода и в случае отсутствия документального подтверждения сведений о прививках) выезда в летние оздоровительные учреждения для работы вышеуказанных контингентов. < . >
Руководитель
Г.Г. Онищенко
