CC BY
14
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XVII, № 2, 2021
твержден цитогенетическими и молекулярно-генетически-ми методами. Минимальный срок наблюдения 12 месяцев. Эффективность терапии оценивали каждые 3 месяца, согласно критериям ELN2013. Спустя 12 месяцев терапии пациенты были разделены на 3 группы: группа оптимального ответа, в которую вошли 33 пациента; группа предупреждения- 15 пациентов; группа резистентных к терапии- 12 пациентов. Периферическую кровь забирали в пробирки с ЭДТА в момент установления диагноза до начала терапии ИТК. В качестве контрольной ткани было произведено взятие букального эпителия. ДНК выделяли с использованием набора Quick-gDNATM Blood Mini Prep (Zymo Research), согласно протоколу производителя. Приготовление библиотек проводилось с использованием набора TruSeq® DNA Library Kit, (Illumina). Секвенирование экзома проводилось на платформе Illumina NextSeq® 550 Sequencing System, с использованием NextSeq® 500/550 High Output Kit v2 (75 cycles), (Illumina). Пробопод-готовка и последующее секвенирование проводились по стандартному протоколу. Среднее покрытие составляет 80x. Этапы биоинформационного анализа включали: удаление адаптеров и последовательностей с низким качеством прочтения; картирование прочтений на референсную последовательность генома человека при помощи алгоритма BWA-MEM; проверка качества исходных данных, выравнивания, обогащения и покрытия целевых регионов с помощью FastQC, BAMQC и NGSrich, маркировка дубликатов, поиск нуклеотид-ных вариаций с помощью GATK HaplotypeCaller + Freebayes + Strelka2 (с получением объединенного VCF-файла); обработка консенсусного VCF-файлов с помощью предобучен-ной нейронной сети для фильтрации ложноположительных результатов; аннотирование с помощью SnpEff (анализ всех транскриптов), ANNOVAR (анализ частот аллелей в ExAC, 1000G и ESP6500, алгоритмы проверки функциональной значимости SIFT, PolyPhen2, MutationTaster, FATMM, CADD, DANN, REVEL и M-CAP) и Alamut Batch (влияние на сплайсинг, базы данных dbSNP, ClinVar, COSMIC, HGMD Professional).
Результаты. По результатам анализа экзомов нам уда-
лось обнаружить семь вариантов, два из которых хорошо описаны и являются патогенными и пять вариантов патогенны, согласно предсказательным программам. У двух пациентов из группы с оптимальным ответом на терапию было выявлено два патогенных варианта, ранее описанных при других онкологических заболевания: c.1849G>T p.V617F в гене }АК2; c.5266dupC p.Q1756fs в гене BRCA1. В группе пациентов, резистентных к терапии, нами было обнаружено 5 вариантов у 4 человек в 2 генах: ASXL1 и DNMT3A. Варианты в данных генах встречаются при различных онкогема-тологических заболеваниях, в том числе при миелодиспла-стическом синдроме и остром миелоидном лейкозе. У трех пациентов встретилось 2 разных варианта в 12 экзоне гена ASXL1, приводящие к потере функций, у одного пациента встретился миссенс вариант в 4 экзоне гена ASXL1. Экзом опухли одного из пациентов содержал одновременно варианты в 12 экзоне гена ASLX1 и 22 экзоне гена DNMT3A. Все пациенты имели смену нескольких линий терапии. Мы провели валидацию найденных вариантов секвенированием по Сенгеру в образцах крови. Также нами была проведена вали-дация в образцах буккального эпителия для двух пациентов, для двух других пациентов материал был недоступен. По результатам валидации миссенс вариант в 4 экзоне гена ASXL1 является терминальным, тогда как вариант в 12 экзоне - соматическим.
Выводы. На основании проведенной работы можно предположить, что выявленные варианты генов ASXL1 и DNMT3A могут быть ассоциированы с резистентностью к терапии ИТК и являться прогностическими маркерами эффективности терапии ИТК на этапе диагностики заболевания. Основываясь на результатах, полученных нами и другими исследователями в области онкологических заболеваний, можно утверждать, что при помощи геномных исследований мы можем обнаружить молекулярно-генетические маркеры эффективности терапии, что, в свою очередь, позволит обеспечить персонализированный подход к назначению таргет-ных препаратов.
Б.В. Бидерман, Е.Б. Ликольд, Н.А. Северина, Т.Н. Обухова, А.Б. Судариков
генетические нарушения у российских пациентов хлл c наиболее распространенными стереотипными антигенными рецепторами
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва
Введение. Хронический лимфоцитарный лейкоз отличается от других лимфопролиферативных заболеваний экстремальным сужением репертуара генов ЮНУ В настоящее время показано, что фракция стереотипных антигенных рецепторов (САР) - В-клеточных рецепторов с высокогомологичным строением - составляет более 40% от всех случаев ХЛЛ, при этом 29 таких наиболее распространенных подгрупп составляют более 13% всех случаев ХЛЛ. Часть таких САР уже выделены как независимые факторы прогноза при ХЛЛ (CLL#1, CLL#2, CLL#8 демонстрируют крайне агрессивное течение заболевания, CLL#4 - индолентное). Также было выявлено, что подгруппы САР различаются по частоте встречаемости генетических нарушений.
Цель. Определить частоту встречаемости мутаций в генах ТР53, NOTCH1, SF3B1 и делеции 17р13/ТР53 у больных ХЛЛ с экспрессией групп САР, образованных с участием одинаковых ЮНУ
Материалы и методы. В исследование включены 88 больных с ХЛЛ. Мутационный статус генов ЮНУ всех пациентов был исследован в ФГБУ «НМИЦ Гематологии» МЗ РФ с 2012 по 2020гг. Нуклеотидные последовательности генов ЮНУ и САР определяли согласно методике, рекомендован-
ной ERIC. Мутации в гене NOTCH1 (34 экзон) исследовали методом фрагментного анализа, либо методом NGS с помощью праймеров Campregher et al. Мутации в гене TP53 (2-11 экзо-ны) определяли с помощью NGS согласно Pavlova et al. Мутации в гене SF3B1 (14-16 экзоны) исследовали у 26 пациентов методом NGS. 66-ти больным выполнено FISH-исследование на наличие делеции 17p13/TP53 (Abbott, USA).
Результаты. В данной работе исследовался материал 32 пациентов с CLL#1, 17 с CLL#6, 15 с CLL#3, 12 с CLL#99 и 12 CLL#28A. CDR3 в подгруппах CLL#1 и #99 имеют сходный мотив, отличаются только на 1 аминокислоту и образуются с использованием генов IGHV 1го клана (чаще IGHV1-2). CLL#28A также образуется на основе гена IGHV1-2, в основе CLL#3 и #6 - IGHV1-69.
Мутации в гене TP53 были выявлены с высокой частотой в подгруппах CLL#6, #1, #99 и #28А - соответственно в 6 (35,3%), 1 (34,3%), 4 (33,3%) и 2(16%) случаев. При этом у всех пациентов в подгруппах #99 и #28а были обнаружены только минорные мутации (VAF<5%). У большинства пациентов подгрупп #1 и #6 VAF>10%. У двух пациентов с CLL#6 и одного c CLL#99 наблюдалось по 2 клона. В подгруппе CLL#3 было выявлено только 2 случая с мутациями в данном гене,
МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ
но у одного было 2 клона, а у другого 4.
Мутации в гене N0^!^ выявлялись у пациентов с CLL#99, #6, #1, #28А, #3 с частотой, соответственно 3(25%), 4 (23,5%), 7(21,8%), 2(16%) и 2(13%). В большинстве случаев выявлялась широко распространенная мутация c.7544_7545delCT Также были обнаружены мутации (по 1 случаю) с.7558_756^е1СТТС и р^2444Х у пациентов в ^#1 и с.7547_755^е1 у пациента с CLL#28A. Одновременное наличие мутаций в генах ТР53 и N0^!^ было обнаружено у 4 пациентов - по 2 случая подгруппах CLL#1 и CLL#6.
Мутации в гене SF3B1 были выявлены у 8 (53,3%) пациентов с CLL#3. В подгруппах CLL#6 (исследовали 11 пациентов), #99 и #28А мутаций в данном гене обнаружено не было. В подгруппе #1 мутации в гене SF3B1 не исследовали.
Делеция 17р13/ТР53 была обнаружена у 9 из 27 исследованных больных с CLL#1 (33%), и у 4 из 14 больных с CLL#6 (28,5%). В группе CLL#3 данная делеция была выявлена у
только 1 больного из 12, а среди пациентов с CLL#99 и #28А (9 и 4 исследованных случаев) она обнаружена не была.
Выводы. Наши результаты показывают, что в подгруппах CLL#1, CLL#6, CLL#3 генетические нарушения встречаются значительно чаще, чем в целом у пациентов с ХЛЛ, по литературным данным. Возможно, это связано с тем, что часть пациентов в нашей выборке имели рецидив после режима FCR. В подгруппе CLL#99, также как и в сходной по строению рецептора подгруппе CLL#1, мутации в гене TP53 встречаются аномально часто, но с низкой VAF, что в настоящее время не имеет доказанного негативного клинического значения. Интересно, что две подгруппы с геном IGHV1-69 в основе SAR демонстрируют абсолютно противоположную картину по частоте встречаемости нарушений в исследуемых генах. Дальнейшее изучение генетических нарушений при этих и других группах САР поможет в будущем оптимизировать терапию и углубить понимание патогенеза заболевания.
А.В. Боровикова, Ж.М. Жабакова, Г.Ж. Абильдинова
частота выявляемости мутации jak2 в казахстане
Республиканское государственное предприятие «Больница Медицинского центра управления делами Президента Республики Казахстан», г. Нур-Султан, Казахстан
Введение. Миелопролиферативные заболевания представляют собой группу гематологических заболеваний, характеризующихся первичным расстройством кроветворных стволовых клеток, приводящим к росту одного или нескольких типов клеток крови. Наиболее важным критерием в диагностике миелопролиферативных заболеваний является мутация V617F в 14 экзоне гена Jak2, который кодирует не-рецепторную тирозинкиназу, участвующую в передаче сигнала от рецепторов цитокинов и факторов роста к ядру клетки и экспрессирован в ранних предшественниках гемопоэза.
Цель. Определить частоту встречаемости гена JAK2 при хронических миелопролиферативных заболеваниях.
Материалы и методы. Молекулярно-генетическое исследование проведено 259 пациентам. Выделение ДНК проводили из 500 мкл крови с использованием набора реагентов PureLink Genomic DNA Mini Kit (Thermo Scientific, США) и в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию ДНК оценивали с помощью прибора Qubit4 (Thermo Scientific, США). При интерпретации результатов учитывали «Серую зону» - образцы, имеющие долю мутантного аллеля от 4 до 7%. При наличии «Серой зоны» пациенты проходили повторное исследование через 6 месяцев. Детекцию и количественный учет гена JAK2 проводили с помощью ПЦР-RT
QuantStudio 12 Flex (Applied biosystem). Возрастной диапазон пациентов и средний возраст (± SD) составляли от 28 до 80 лет и 45,89 ± 15,60 года соответственно.
Результаты исследования. Группу исследования составили 269 человек, из них 133 (49,4%) пациентов с подозрением на истинную полицитемию (ИП) и 132 (49%) пациента на с подозрением на первичный миелофиброз и 4 (1,5%) пациента с Ph-негативным хроническим миелолейкозом (ХМЛ). Частота выявляемости в группе исследования мутации в 14 экзоне гена JAK2 составила 47% (127). Среди 133 пациентов с ИП мутация JAK2 обнаружена у 66 пациентов, что составило 49,6%, у 132 пациентов с ПМФ - у 58 (43,9%). В группе первичных больных, обследованных с целью дифференциальной диагностики при Ph (-) ХМЛ, мутация была выявлена у 3 (75%) из 4 пациентов, что позволило достоверно подтвердить диагноз.
Изучена частота мутации JAK2 в зависимости от возраста и пола. Возрастной пик обнаружения мутации V617F гена JAK2 у заболевших находится между 40 и 70 годами с преобладанием заболеваемости у женщин после 60 лет.
Выводы. Частота мутации JAK 2 при хронических миелопролиферативных заболеваниях составила в исследуемой группе 47%, чаще диагностируется у женщин старше 60 лет.
И.А. Булдаков1, С.В.Волошин1, В.А. Шуваев1,2, С.В.Петров1, М.С.Фоминых11 С.С. Бессмельцев1, А.В. Чечеткин1, И.С. Мартынкевич1
секвенирование следующего поколения в определении
bcr-abl-независимых механизмов развития резистентности к терапии
итк у пациентов с хф хмл: результаты пилотного исследования
1Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии
и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства», г. Санкт-Петербург 2 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Городская клиническая больница имени В.В. Вересаева» Департамента здравоохранения г. Москвы
Введение. С каждым годом накапливается все больше данных о механизмах развития первичной и вторичной резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ (ИТК) у пациентов с хМл. Технология секвенирования следующего поколения (NGS) позволяет обнаруживать мутации в киназном домене BCR-ABL химерного гена у значительной части пациентов с резистентностью к терапии ИТК. Но, по-
прежнему остаются неясными причины резистентности у пациентов без мутаций в киназном домене BCR-ABL.
Цель. Определить BCR-ABL-независимые молекулярно-генетические маркеры резистентности к терапии ИТК у пациентов с ХМЛ с применением NGS.
Материалы и методы. Мы исследовали образцы крови 15 пациентов с резистентным течением ХФ ХМЛ (8 мужчин
